2. 兰州军区总医院, 兰州 730040
2. Hospital of Medicine Branch, Lanzhou Military Region Hospital, Lanzhou 730040, China
随着社会经济发展,饮食结构改变,糖尿病已成为在世界范围内广泛存在、常见的慢性疾病。伴胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是严重危害人类健康的疾病,其发病率占糖尿病的90%以上,而肝脏是参与体内糖代谢最重要的器官,糖尿病与肝脏疾病相互影响。因此,T2DM的研究受到人们的广泛重视。目前对糖尿病的治疗主要以西药为主,但西药治疗存在继发性失效和严重的不良反应[1]等缺点。因此,寻找对机体无损伤或损伤较小的药物,是当前糖尿病亟待解决的问题。
骆奶曾被用于治疗各种肝炎、结核、过敏性疾病、胃溃疡和肿瘤[2, 3, 4],曾有报道指出骆奶用于1型糖尿患者可以降低患者的胰岛素(INS)用量,Rogers[5]和Agrawal等[6]报道骆奶能降低1型糖尿患者血糖,减少患者INS用量,骆奶中含有一种具有类似INS许多特性的蛋白质,能安全有效地控制糖尿病患者血糖,对骆奶中INS进行成分和结构分析发现,骆奶中这种蛋白质在酸性环境下不形成凝固结构,不易被酸性物质破坏,使其可经过胃被小肠吸收,从而降低血糖,克服了口服INS存在的问题[7]。此外,骆奶中维生素C含量是牛奶3倍多[8]。维生素C单独或联合其他药物亦可用于糖尿病及并发症预防治疗[9, 10]。骆奶对T2DM的作用的研究很少,尤其尚未见对T2DM动物的肝细胞凋亡的保护作用的研究。本试验采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立T2DM大鼠模型,研究双峰驼奶对T2DM大鼠肝细胞凋亡的保护作用,为临床治疗糖尿病及其并发症提供新思路。
选用健康6周龄雄性Wistar大鼠60只,体重120~150 g,购自兰州大学动物实验中心,动物合格证号:SCXK甘2005-0007。
双峰骆奶采自甘肃酒泉瓜州县锁阳镇新沟村,参照文献[11]报道的方法处理。采驼奶前,用干净的毛巾擦洗骆驼乳头,用75%酒精消毒,双峰骆奶收集于灭菌处理的不锈钢容器中,尽快运回实验室(8 h内),置于-80 ℃的冰箱保存备用。
盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride,MTH,上海施贵宝制药有限公司);CX4 Pro全自动生化分析仪(美国Beckman);Onetouch Ultra Ⅱ快速血糖仪(美国强生);兔抗大鼠B细胞淋巴瘤因子2(B cell lymphoma/lewkmia-2,BCL-2)、兔抗大鼠BCL-2相关蛋白X(BCL-2-associated X protein,BAX)、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG,二抗)、山羊抗兔IgG免疫组织化学试剂盒以及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物公司);RNA Plus试剂、PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM PCR试剂盒(大连宝生物公司);焦炭酸二乙酯(DEPC,美国Sigma);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore);其他试剂均为国产分析纯。
电子天平(BP210S,德国Sartorius);紫外分光光度计(HP8453,美国HP);离心机(IEC Micromax,美国Thermo Electron);PCR仪(Mx3005P qPCR System,美国Stratagene);电泳仪、电转移仪和酶标仪(美国Bio-Rad)。
T2DM大鼠模型:用高脂饲粮(蛋黄2.5%、蔗糖20.0%、猪油10.0%、基础饲料67.5%)饲养2个月后,单次注射STZ 30 mg/kg,诱发T2DM。注射STZ前大鼠禁食16 h;注射STZ后3~7 d,检测血糖,血糖值大于14 mmol/L的大鼠纳入试验。
60只大鼠随机分5组,每组12只,阴性对照(C)组采用基础饲粮,其他4组均为建立T2DM模型后的大鼠,分别为糖尿病模型对照(DMC)组、低剂量骆奶(LCM)组(2 mL/d)、高剂量骆奶(HCM)组(5 mL/d)和MTH组(200 mg/kg)。
各试验组均采用灌胃给药,连续4周,C组和DMC组给予等量生理盐水。
试验前大鼠禁食不禁水16 h,以50%葡萄糖溶液灌胃(5 g/kg),给予葡萄糖前先测定空腹血糖,给予葡萄糖后0、30、60和120 min,分别检测大鼠血糖浓度的变化。
末次给药后,大鼠注射戊巴比妥钠(50 mg/kg),麻醉后,打开腹腔,分离腹主动脉并取血液0.5 mL加入抗凝管中,3 000×g离心15 min,取上清检测INS浓度。
末次给药后大鼠禁食不禁水6 h,颈椎脱臼处死,立即取新鲜肝脏组织,于4%多聚甲醛溶液固定,常规脱水,石蜡包埋,切片,经HE染色后,中性树胶封片,光镜下观察肝脏病变。
4%多聚甲醛固定的肝脏组织常规脱水,石蜡包埋,切片,制成4 μm厚的组织切片。经抗原修复,非离子表面活性剂(Triton)作用10 min;3%过氧化氢作用20 min;羊血清封闭30 min;滴加一抗(兔抗大鼠BCL-2和兔抗大鼠BAX,1∶ 150),阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗,置湿盒中4 ℃过夜;PBS洗涤3次,滴加羊抗兔二抗,37 ℃孵育30 min;PBS洗涤3次,滴加链霉亲和素-生物素复合物(SABC)室温孵育20 min;PBS洗涤3次,滴加DAB显色、终止;PBS洗涤3次,苏木素轻度复染、脱水、透明,中性树胶封片。显微镜下观察,采用MinVnt图像分析系统在400倍显微镜下对免疫组织化学阳性结果进行分析。
末次给药后大鼠禁食不禁水6 h,颈椎脱臼处死,立即取肝脏,液氮中冷冻保存备用。提取总RNA,-80 ℃保存备用。总RNA纯度鉴定:取2.5 μL总RNA提取液在紫外分光光度计测定260 nm吸光度值(A260 nm)、280 nm吸光度值(A280 nm),计算A260 nm/A280 nm,在1.8~2.0之间为纯度合格。逆转录:取200 ng总RNA,根据试剂盒说明书配制逆转录PCR反应液。反应条件:48 ℃ 60 min;70 ℃ 10min;反应得到cDNA,-20 ℃保存备用。
RT-qPCR两步法扩增:SYBR Premix EX TapTMⅡ (2×) 12.5 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 2 μL、双蒸水8.5 μL,反应为体系25 μL;反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40个循环;95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s(离解程序)。
分别检测BAX、BCL-2、细胞凋亡蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase 3)和核转录因子 B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的mRNA相对表达量。产物经2%琼脂糖凝胶电泳后拍照,用凝胶成像系统进行分析。采用2-△△Ct方法进行数据处理。根据GenBank公布的大鼠mRNA序列,使用Primer Premier 5.0设计引物(表1),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
将液氮冻存的肝脏组织取出提取总蛋白,称取50 mg于研钵研磨,加入细胞裂解液800 μL,在冰上裂解30 min,反复吹打使其充分裂解后,移入1.5 mL离心管,4 ℃ 12 000×g离心15 min,收集上清,测定总蛋白浓度。每组取50 μg总蛋白上样,15%十二烷基四乙酸二钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,运用电转移法将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加兔抗大鼠β肌动蛋白(β-actin,1∶ 1 000,一抗)、兔抗大鼠BCL-2(1∶ 1 000,一抗),加兔抗大鼠BAX(1∶ 1 000,一抗)4 ℃孵育过夜,洗膜后加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶ 5 000),37 ℃孵育 2 h,化学发光法ECL显影。试验重复3次。
采用IPP 6.0软件对Western blot结果特异性产物条带进行累计吸光度检测(IOD),试验数据输入SPSS 17.0统计软件,采用单因素的方差分析进行统计学检验。组内采用独立样本t检验。组间采用配对样本t检验,数据均用平均值±标准误表示,P<0.01判定为差异显著。
由表2可知,与C组相比,其他组血糖浓度均升高。DMC组、LCM组、HCM组和MTH组均呈先升高后降低的趋势。给予葡萄糖30、60和120 min时,LCM组大鼠血糖浓度显著低于DMC组(P<0.01);给予葡萄糖0、30和120 min时,HCM组大鼠血糖浓度显著低于DMC组(P<0.01);MTH组血糖浓度与DMC组在各时间点均差异不显著(P>0.05)。结果提示,双峰骆奶能发挥降血糖作用;双峰骆奶对糖耐量异常具有一定的改善作用。
由表3可知,与C组相比,DMC组INS浓度显著上升(P<0.01),LCM组和MTH组INS浓度显著下降(P<0.01);与DMC组相比,LCM组、HCM组和MTH组INS浓度均显著下降(P<0.01),其中LCM组最低。
由图1可知,C组肝小叶结构清晰完整,肝细胞核结构清晰,肝细胞形态正常。肝窦正常,连接成网状。DMC组肝细胞失去正常的索状结构,脂肪变性,肝细胞水肿,肝窦变窄,部分肝细胞核表缩、碎裂、溶解。肝细胞索之间纤维细胞增生。LMC组和HMC组肝细胞形态正常,胞核结构清晰,部分肝细胞浆内可见小脂滴形成,局部细胞界限不清,肝小叶结构清晰,肝细胞索排列整齐、呈放射状,肝窦正常,部分肝索排列紊乱,与DMC组比较,肝脏脂肪变性及损伤减轻。
由图2可知,BCL-2蛋白免疫阳性反应呈棕黄色颗粒状,定位于胞浆,与DMC组相比,MTH组和HCM组肝细胞BCL-2蛋白合成量明显升高,LCM组肝细胞BCL-2蛋白合成量变化不大。提示,驼奶可提高肝细胞BCL-2蛋白合成量。
由图3可知,BAX蛋白免疫阳性反应呈棕黄色颗粒状,定位于胞浆;与其他组相比,DMC组肝细胞BAX蛋白合成量明显升高,LCM组肝细胞BAX蛋白合成量变化不大。结果提示,T2DM大鼠肝细胞BAX蛋白合成量较高,而双驼峰奶降低了肝细胞BAX蛋白的合成。
由图4可知,肝脏组织中BAX、BCL-2、caspase 3和NF-κB mRNA在各组均有表达。caspase 3 mRNA在LCM组中表达最高,与DMC组和MTH组相比差异显著(P<0.01);BCL-2 mRNA在MTH组中表达最高,与DMC组相比差异显著(P<0.01);BAX mRNA在LCM组和MTH组中表达高于DMC组和HCM组,与DMC组相比差异显著(P<0.01);NF-κB mRNA在MTH组中表达最高,与其他各组相比,差异显著(P<0.01)。
由图5可知,T2DM大鼠模型建立成功后,DMC组、MTH组、LCM组和HCM组均可检测到BAX和BCL-2蛋白。与DMC组相比,LCM组和MTH组BCL-2蛋白相对含量显著下调(P<0.01),HCM表现为显著上调(P<0.01)。HCM组和LCM组BCL-2蛋白相对含量高于MTH组,其中HCM组显著高于MTH组(P<0.01)。与DMC组相比,LCM组、HCM组和MTH组中BAX蛋白相对含量均提高,BAX蛋白在MTH组表达最高,显著高于HCM组和MTH组(P<0.01)。结果显示,双峰骆奶能有效地抑制细胞凋亡,与MTH具有类似的作用。
糖尿病的发病机制较复杂,在糖尿病的治疗过程中,控制血糖是治疗糖尿病的首要目标,T2DM患者除了高血糖外,常表现为糖耐量异常,INS敏感性下降等,同时存在着代谢紊乱。现代研究证明双峰骆奶能促进新陈代谢,增强肝脾功能,改善胰腺功能,补肝益肾,清肺消暑、养阴、解毒,清除坏死组织,肉芽促生,加速疾病痊愈等作用[12]。通过双峰骆奶喂养T2DM大鼠,其结果揭示驼奶能够显著改善大鼠糖耐量和INS浓度。
BAX为促凋亡蛋白,BCL-2为抗凋亡蛋白[13]。多项研究表明,BCL-2 mRNA高表达时,细胞增殖大于细胞凋亡,而BAX mRNA高表达时,表现为细胞凋亡[14]。HE染色结果和免疫组织化学染色结果显示驼奶能够促进细胞增殖,抑制细胞的凋亡,有效地预防T2DM大鼠的病变,从而对T2DM发挥辅助治疗的效果。
糖尿病导致肝细胞凋亡的机制复杂,细胞凋亡的具体机制涉及一系列基因的复杂调控。目前认为细胞caspase 3是凋亡信号转导的共同通路,该酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据[15]。以前的研究证实,胰岛B细胞凋亡是与NF-κB的活化有关。抑制NF-κB的活化可以保护胰岛B细胞[16];抑制NF-κB信号通路可减少B细胞凋亡;由此可见,NF-κB通路的炎症反应可能在T2DM的发生、发展及肝脏组织的脂肪变性中起到重要作用。
RT-qPCR结果显示,双峰骆奶能引起caspase 3、NF-κB、BAX和BCL-2 mRNA的表达。驼奶剂量的不同,BAX mRNA表达显著下调;BCL-2 mRNA表达上调;同时激活NF-κB mRNA的表达;从而可能激活肿瘤坏死因子(TNF)家族相关基因的表达,最终引起胰岛B细胞分泌INS,保护肝脏和胰腺。Western blot结果揭示,BCL-2蛋白相对含量在LCM组和HCM组显著高于MTH组,BAX蛋白相对含量MTH组显著高于LCM组和HCM组,然而BCL-2/BAX增高,表明驼奶抑制肝细胞的凋亡,其效果优于MTH。
骆驼是荒漠、半荒漠地带的重要的畜种资源,其分布具有较强的地域性,仅存在于蒙古、中东的某些地区和中国的新疆和内蒙古,由于其数量的减少,产奶量较少以及鲜奶不易于保存等而不被众人所了解,其医用价值开发更少。Agrawal等[17]报道,每天饮用0.5 L驼奶,使糖尿病患者的INS需求量相对降低,血糖稳定。他们对2 099人进行了调查[18],结果说明,日常生活中饮用驼奶对糖尿病的发病率有明确的影响,驼奶对糖尿病有拮抗作用。驼奶的营养丰富,保健治疗价值也很高,但就驼奶的研究以及驼奶产业的发展并不乐观,尤其是在我国鲜有几个产业链来开发和利用。通过驼奶对疾病的辅助治疗作用机理,特别是对糖尿病和肺结核治疗作用的研究,将促进养驼业的发展,并为临床治疗提供有效的参考依据。
双峰骆奶能抑制BAX蛋白的合成,而促进BCL-2蛋白合成,揭示双峰骆奶能抑制细胞凋亡,促进细胞增殖。双峰骆奶具有明显的降低T2DM大鼠的血糖及肝细胞损伤的作用,可起到辅助治疗的作用。
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