动物营养学报  2013, Vol. 25 Issue (10): 2422-2429   PDF (2206 KB)    
双峰骆奶对2型糖尿病大鼠肝细胞凋亡的影响
王雪莹1, 张全伟1, 张勇1, 张泉龙2, 姬菩忠2, 李亚兰1, 赵兴绪1     
1. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070;
2. 兰州军区总医院, 兰州 730040
摘要:本试验旨在研究双峰驼奶对2型糖尿病大鼠肝细胞凋亡的保护作用。60只月龄接近的雄性成年大鼠随机分5组,阴性对照(C)组采用基础饲粮,其他4组均通过链脲佐菌素结合高糖高脂饮食诱导建立2型糖尿病大鼠模型,各组分别为糖尿病模型对照(DMC)组、低剂量骆奶(LCM)组(2 mL/d)、高剂量骆奶(HCM)组(5 mL/d)和盐酸二甲双胍(MTH)组(200 mg/kg)。试验期4周。结果表明:与C组和DMC组相比,MTH组和HCM组大鼠血糖浓度显著下降(P<0.01);DMC组肝细胞水肿,部分肝细胞核皱缩、碎裂、溶解,而LCM组、HCM组和MTH组肝细胞形态正常,胞核结构清晰;与DMC组相比,HCM组和MTH组大鼠肝细胞B细胞淋巴瘤因子2(BCL-2)蛋白合成增强,BCL-2相关蛋白X(BAX)合成减弱;BCL-2 mRNA相对表达量在MTH组中最高,BAX mRNA相对表达量在LCM组和MTH组中最高;DMC组、MTH组、LCM组和HCM组均可检测出BCL-2和BAX蛋白。综合以上,双峰骆奶能抑制BAX蛋白的合成而促进BCL-2蛋白合成,揭示双峰骆奶能抑制细胞凋亡,促进细胞增殖。双峰骆奶具有明显的降低2型糖尿病大鼠的血糖及肝细胞损伤的作用,可起到辅助治疗的作用。
关键词双峰骆奶     2型糖尿病     肝脏     细胞凋亡    
Effects of Bactrian Camel Milk on Hepatocyte Apoptosis of Type 2 Diabetes Mellitus Rats
WANG Xueying1, ZHANG Quanwei1, ZHANG Yong1, ZHANG Quanlong2, JI Peizhong2, LI Yalan1, ZHAO Xingxu1     
1. College of Veterinary Medicine, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China;
2. Hospital of Medicine Branch, Lanzhou Military Region Hospital, Lanzhou 730040, China
Abstract: This study was conducted to investigate the protective effects of Bactrian camel milk on hepatocyte apoptosis of type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats. Sixty adult male rats with similar month of age were randomly divided into five groups, which were negative control (C) group (healthy rats, basal diet), diabetes model control (DMC) group (T2DM rats), low concentration camel milk (LCM) group (2 mL/d, T2DM rats), high concentration camel milk (HCM) group (5 mL/d, T2DM rats) and metformin hydrochloride (MTH) group (200 mg/kg, T2DM rats), respectively. The experiment lasted for 4 weeks. The results showed as follows: compared with C and DMC groups, the blood glucose concentration in MTH and HCM groups was significantly decreased (P<0.01). The hepatocyte was swollen, partial nuclear fragmentation, shrinkage and dissolution in DMC group, while the morphology was normal, and the nuclear was clear in LCM, HCM and MTH groups. Compared with DMC group, the synthesis of B cell lymphoma/lewkmia-2 (BCL-2) was increased in HCM and MTH groups, while that in BCL-2-associated X protein (BAX) was decreased in HCM and MTH groups. The relative expression level of BCL-2 mRNA was the highest in the MTH group, while the relative expression level of BAX mRNA reached its peak in LCM and MTH groups. The relative expression level of BCL-2 mRNA was the highest in MTH group, and that of BAX was higher in LCM and HCM groups than that in the other two groups. BCL-2 and BAX proteins could be detected in DMC, LCM, HCM and MTH groups. The results indicate that Bactrian milk can suppress cell apoptosis and promote cell proliferation through inhibiting BAX protein synthesis, but encouraging BCL-2 protein synthesis, thus reduce the hepatocyte injury and decrease the blood glucose concentration of T2DM rats, which provides a new adjunctive treatment for diabetes mellitus. [Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(10):2422-2429]
Key words: camel milk     type 2 diabetes     hepatocyte     apoptosis    

随着社会经济发展,饮食结构改变,糖尿病已成为在世界范围内广泛存在、常见的慢性疾病。伴胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是严重危害人类健康的疾病,其发病率占糖尿病的90%以上,而肝脏是参与体内糖代谢最重要的器官,糖尿病与肝脏疾病相互影响。因此,T2DM的研究受到人们的广泛重视。目前对糖尿病的治疗主要以西药为主,但西药治疗存在继发性失效和严重的不良反应[1]等缺点。因此,寻找对机体无损伤或损伤较小的药物,是当前糖尿病亟待解决的问题。

骆奶曾被用于治疗各种肝炎、结核、过敏性疾病、胃溃疡和肿瘤[2, 3, 4],曾有报道指出骆奶用于1型糖尿患者可以降低患者的胰岛素(INS)用量,Rogers[5]和Agrawal等[6]报道骆奶能降低1型糖尿患者血糖,减少患者INS用量,骆奶中含有一种具有类似INS许多特性的蛋白质,能安全有效地控制糖尿病患者血糖,对骆奶中INS进行成分和结构分析发现,骆奶中这种蛋白质在酸性环境下不形成凝固结构,不易被酸性物质破坏,使其可经过胃被小肠吸收,从而降低血糖,克服了口服INS存在的问题[7]。此外,骆奶中维生素C含量是牛奶3倍多[8]。维生素C单独或联合其他药物亦可用于糖尿病及并发症预防治疗[9, 10]。骆奶对T2DM的作用的研究很少,尤其尚未见对T2DM动物的肝细胞凋亡的保护作用的研究。本试验采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立T2DM大鼠模型,研究双峰驼奶对T2DM大鼠肝细胞凋亡的保护作用,为临床治疗糖尿病及其并发症提供新思路。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物

选用健康6周龄雄性Wistar大鼠60只,体重120~150 g,购自兰州大学动物实验中心,动物合格证号:SCXK甘2005-0007。

1.1.2 双峰骆奶的采集

双峰骆奶采自甘肃酒泉瓜州县锁阳镇新沟村,参照文献[11]报道的方法处理。采驼奶前,用干净的毛巾擦洗骆驼乳头,用75%酒精消毒,双峰骆奶收集于灭菌处理的不锈钢容器中,尽快运回实验室(8 h内),置于-80 ℃的冰箱保存备用。

1.1.3 药品与试剂

盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride,MTH,上海施贵宝制药有限公司);CX4 Pro全自动生化分析仪(美国Beckman);Onetouch Ultra Ⅱ快速血糖仪(美国强生);兔抗大鼠B细胞淋巴瘤因子2(B cell lymphoma/lewkmia-2,BCL-2)、兔抗大鼠BCL-2相关蛋白X(BCL-2-associated X protein,BAX)、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG,二抗)、山羊抗兔IgG免疫组织化学试剂盒以及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物公司);RNA Plus试剂、PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM PCR试剂盒(大连宝生物公司);焦炭酸二乙酯(DEPC,美国Sigma);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore);其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器

电子天平(BP210S,德国Sartorius);紫外分光光度计(HP8453,美国HP);离心机(IEC Micromax,美国Thermo Electron);PCR仪(Mx3005P qPCR System,美国Stratagene);电泳仪、电转移仪和酶标仪(美国Bio-Rad)。

1.2 方法
1.2.1 模型建立、分组与给药

T2DM大鼠模型:用高脂饲粮(蛋黄2.5%、蔗糖20.0%、猪油10.0%、基础饲料67.5%)饲养2个月后,单次注射STZ 30 mg/kg,诱发T2DM。注射STZ前大鼠禁食16 h;注射STZ后3~7 d,检测血糖,血糖值大于14 mmol/L的大鼠纳入试验。

60只大鼠随机分5组,每组12只,阴性对照(C)组采用基础饲粮,其他4组均为建立T2DM模型后的大鼠,分别为糖尿病模型对照(DMC)组、低剂量骆奶(LCM)组(2 mL/d)、高剂量骆奶(HCM)组(5 mL/d)和MTH组(200 mg/kg)。

各试验组均采用灌胃给药,连续4周,C组和DMC组给予等量生理盐水。

1.2.2 糖耐量检测

试验前大鼠禁食不禁水16 h,以50%葡萄糖溶液灌胃(5 g/kg),给予葡萄糖前先测定空腹血糖,给予葡萄糖后0、30、60和120 min,分别检测大鼠血糖浓度的变化。

1.2.3 血液INS浓度检测

末次给药后,大鼠注射戊巴比妥钠(50 mg/kg),麻醉后,打开腹腔,分离腹主动脉并取血液0.5 mL加入抗凝管中,3 000×g离心15 min,取上清检测INS浓度。

1.2.4 肝脏组织苏木精-伊红(HE)染色

末次给药后大鼠禁食不禁水6 h,颈椎脱臼处死,立即取新鲜肝脏组织,于4%多聚甲醛溶液固定,常规脱水,石蜡包埋,切片,经HE染色后,中性树胶封片,光镜下观察肝脏病变。

1.2.5 肝脏组织免疫组织化学染色

4%多聚甲醛固定的肝脏组织常规脱水,石蜡包埋,切片,制成4 μm厚的组织切片。经抗原修复,非离子表面活性剂(Triton)作用10 min;3%过氧化氢作用20 min;羊血清封闭30 min;滴加一抗(兔抗大鼠BCL-2和兔抗大鼠BAX,1∶ 150),阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗,置湿盒中4 ℃过夜;PBS洗涤3次,滴加羊抗兔二抗,37 ℃孵育30 min;PBS洗涤3次,滴加链霉亲和素-生物素复合物(SABC)室温孵育20 min;PBS洗涤3次,滴加DAB显色、终止;PBS洗涤3次,苏木素轻度复染、脱水、透明,中性树胶封片。显微镜下观察,采用MinVnt图像分析系统在400倍显微镜下对免疫组织化学阳性结果进行分析。

1.2.6 实时定量PCR(RT-qPCR)检测肝脏组织凋亡相关基因mRNA的表达

末次给药后大鼠禁食不禁水6 h,颈椎脱臼处死,立即取肝脏,液氮中冷冻保存备用。提取总RNA,-80 ℃保存备用。总RNA纯度鉴定:取2.5 μL总RNA提取液在紫外分光光度计测定260 nm吸光度值(A260 nm)、280 nm吸光度值(A280 nm),计算A260 nm/A280 nm,在1.8~2.0之间为纯度合格。逆转录:取200 ng总RNA,根据试剂盒说明书配制逆转录PCR反应液。反应条件:48 ℃ 60 min;70 ℃ 10min;反应得到cDNA,-20 ℃保存备用。

RT-qPCR两步法扩增:SYBR Premix EX TapTMⅡ (2×) 12.5 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 2 μL、双蒸水8.5 μL,反应为体系25 μL;反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40个循环;95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s(离解程序)。

分别检测BAXBCL-2、细胞凋亡蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase 3)和核转录因子 B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的mRNA相对表达量。产物经2%琼脂糖凝胶电泳后拍照,用凝胶成像系统进行分析。采用2-△△Ct方法进行数据处理。根据GenBank公布的大鼠mRNA序列,使用Primer Premier 5.0设计引物(表1),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 RT-qPCR引物序列及参数

Table 1 Sequences and parameters of primers for RT-qPCR



1.2.7 免疫印记分析(western blot)检测BCL-2和 BAX蛋白的相对含量

将液氮冻存的肝脏组织取出提取总蛋白,称取50 mg于研钵研磨,加入细胞裂解液800 μL,在冰上裂解30 min,反复吹打使其充分裂解后,移入1.5 mL离心管,4 ℃ 12 000×g离心15 min,收集上清,测定总蛋白浓度。每组取50 μg总蛋白上样,15%十二烷基四乙酸二钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,运用电转移法将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加兔抗大鼠β肌动蛋白(β-actin,1∶ 1 000,一抗)、兔抗大鼠BCL-2(1∶ 1 000,一抗),加兔抗大鼠BAX(1∶ 1 000,一抗)4 ℃孵育过夜,洗膜后加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶ 5 000),37 ℃孵育 2 h,化学发光法ECL显影。试验重复3次。

1.3 数据统计与分析

采用IPP 6.0软件对Western blot结果特异性产物条带进行累计吸光度检测(IOD),试验数据输入SPSS 17.0统计软件,采用单因素的方差分析进行统计学检验。组内采用独立样本t检验。组间采用配对样本t检验,数据均用平均值±标准误表示,P<0.01判定为差异显著。

2 结 果
2.1 双峰驼奶对T2DM大鼠糖耐量的影响

由表2可知,与C组相比,其他组血糖浓度均升高。DMC组、LCM组、HCM组和MTH组均呈先升高后降低的趋势。给予葡萄糖30、60和120 min时,LCM组大鼠血糖浓度显著低于DMC组(P<0.01);给予葡萄糖0、30和120 min时,HCM组大鼠血糖浓度显著低于DMC组(P<0.01);MTH组血糖浓度与DMC组在各时间点均差异不显著(P>0.05)。结果提示,双峰骆奶能发挥降血糖作用;双峰骆奶对糖耐量异常具有一定的改善作用。

表2 双峰驼奶对T2DM大鼠血糖浓度的影响

Table 2 Effects of Bactrian camel milk on blood glucose concentration of T2DM rats mmol/L

2.2 双峰驼奶对T2DM大鼠血液INS浓度的影响

由表3可知,与C组相比,DMC组INS浓度显著上升(P<0.01),LCM组和MTH组INS浓度显著下降(P<0.01);与DMC组相比,LCM组、HCM组和MTH组INS浓度均显著下降(P<0.01),其中LCM组最低。


表3 双峰骆奶对T2DM大鼠血液INS浓度的影响

Table 3 Effects of Bactrian camel milk on blood INS concentration of T2DM rats mU/L


2.3 肝脏组织HE染色结果

由图1可知,C组肝小叶结构清晰完整,肝细胞核结构清晰,肝细胞形态正常。肝窦正常,连接成网状。DMC组肝细胞失去正常的索状结构,脂肪变性,肝细胞水肿,肝窦变窄,部分肝细胞核表缩、碎裂、溶解。肝细胞索之间纤维细胞增生。LMC组和HMC组肝细胞形态正常,胞核结构清晰,部分肝细胞浆内可见小脂滴形成,局部细胞界限不清,肝小叶结构清晰,肝细胞索排列整齐、呈放射状,肝窦正常,部分肝索排列紊乱,与DMC组比较,肝脏脂肪变性及损伤减轻。

A:C组,B:DMC组,C:LCM组,D:HCM组,E:MTH组。图2、图3同。
A: C group, B: DMC group, C: LCM group, D: HCM group, E: MTH group. The same as Fig.2 and Fig.3.
图1 T2DM大鼠肝脏组织HE染色结果 Fig. 1 The HE staining results in liver tissue of T2DM rats (400×)
2.4 肝脏组织免疫组织化学染色结果

由图2可知,BCL-2蛋白免疫阳性反应呈棕黄色颗粒状,定位于胞浆,与DMC组相比,MTH组和HCM组肝细胞BCL-2蛋白合成量明显升高,LCM组肝细胞BCL-2蛋白合成量变化不大。提示,驼奶可提高肝细胞BCL-2蛋白合成量。

图2 T2DM大鼠肝脏组织BCL-2蛋白免疫组织化学染色结果Fig. 2 The immunohistostaining results of BCL-2 protein in liver tissue of T2DM rats (400×)

由图3可知,BAX蛋白免疫阳性反应呈棕黄色颗粒状,定位于胞浆;与其他组相比,DMC组肝细胞BAX蛋白合成量明显升高,LCM组肝细胞BAX蛋白合成量变化不大。结果提示,T2DM大鼠肝细胞BAX蛋白合成量较高,而双驼峰奶降低了肝细胞BAX蛋白的合成。

图3 T2DM大鼠肝脏组织BAX蛋白免疫组织化学染色结果 Fig.3 The immunohistostaining results of BAX protein in liver tissue of T2DM rats (400×)

2.5 双峰驼奶对T2DM大鼠肝脏组织凋亡相关基因表达的影响

由图4可知,肝脏组织中BAXBCL-2、caspase 3和NF-κB mRNA在各组均有表达。caspase 3 mRNA在LCM组中表达最高,与DMC组和MTH组相比差异显著(P<0.01);BCL-2 mRNA在MTH组中表达最高,与DMC组相比差异显著(P<0.01);BAX mRNA在LCM组和MTH组中表达高于DMC组和HCM组,与DMC组相比差异显著(P<0.01);NF-κB mRNA在MTH组中表达最高,与其他各组相比,差异显著(P<0.01)。

数据柱形标注*表示与DMC组相比差异显著(P<0.01),#表示与MTH组相比差异显著(P<0.01)。图5同。
Data with * are significantly different from those in group DMC (P<0.01), and with # are significantly different from those in group MTH (P<0.01). The same as Fig 5.
图4 双峰驼奶对T2DM大鼠肝脏组织凋亡相关基因表达的影响 Fig.4 Effects of Bactrian camel milk on apoptosis-related gene expressions in liver tissue of T2DM rats

数据柱形标注*表示与DMC组相比差异显著(P<0.01),#表示与MTH组相比差异显著(P<0.01)。图5同。

Data with *are significantly different from those in group DMC(P<0.01),and with # are significantly diffent from those in group MTH(P<0.01). The same as Fig 5.

2.6 双峰骆奶对T2DM大鼠肝脏组织BAX和BCL-2蛋白相对含量的影响

由图5可知,T2DM大鼠模型建立成功后,DMC组、MTH组、LCM组和HCM组均可检测到BAX和BCL-2蛋白。与DMC组相比,LCM组和MTH组BCL-2蛋白相对含量显著下调(P<0.01),HCM表现为显著上调(P<0.01)。HCM组和LCM组BCL-2蛋白相对含量高于MTH组,其中HCM组显著高于MTH组(P<0.01)。与DMC组相比,LCM组、HCM组和MTH组中BAX蛋白相对含量均提高,BAX蛋白在MTH组表达最高,显著高于HCM组和MTH组(P<0.01)。结果显示,双峰骆奶能有效地抑制细胞凋亡,与MTH具有类似的作用。

图5 双峰骆奶对T2DM大鼠肝脏组织BAX和BCL-2蛋白质相对含量的影响 Fig.5 Effects of Bactrian camel milk on relative protein contents of BAX and BCL-2 in liver tissue of T2DM rats
3 讨 论

糖尿病的发病机制较复杂,在糖尿病的治疗过程中,控制血糖是治疗糖尿病的首要目标,T2DM患者除了高血糖外,常表现为糖耐量异常,INS敏感性下降等,同时存在着代谢紊乱。现代研究证明双峰骆奶能促进新陈代谢,增强肝脾功能,改善胰腺功能,补肝益肾,清肺消暑、养阴、解毒,清除坏死组织,肉芽促生,加速疾病痊愈等作用[12]。通过双峰骆奶喂养T2DM大鼠,其结果揭示驼奶能够显著改善大鼠糖耐量和INS浓度。

BAX为促凋亡蛋白,BCL-2为抗凋亡蛋白[13]。多项研究表明,BCL-2 mRNA高表达时,细胞增殖大于细胞凋亡,而BAX mRNA高表达时,表现为细胞凋亡[14]。HE染色结果和免疫组织化学染色结果显示驼奶能够促进细胞增殖,抑制细胞的凋亡,有效地预防T2DM大鼠的病变,从而对T2DM发挥辅助治疗的效果。

糖尿病导致肝细胞凋亡的机制复杂,细胞凋亡的具体机制涉及一系列基因的复杂调控。目前认为细胞caspase 3是凋亡信号转导的共同通路,该酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据[15]。以前的研究证实,胰岛B细胞凋亡是与NF-κB的活化有关。抑制NF-κB的活化可以保护胰岛B细胞[16];抑制NF-κB信号通路可减少B细胞凋亡;由此可见,NF-κB通路的炎症反应可能在T2DM的发生、发展及肝脏组织的脂肪变性中起到重要作用。

RT-qPCR结果显示,双峰骆奶能引起caspase 3、NF-κBBAXBCL-2 mRNA的表达。驼奶剂量的不同,BAX mRNA表达显著下调;BCL-2 mRNA表达上调;同时激活NF-κB mRNA的表达;从而可能激活肿瘤坏死因子(TNF)家族相关基因的表达,最终引起胰岛B细胞分泌INS,保护肝脏和胰腺。Western blot结果揭示,BCL-2蛋白相对含量在LCM组和HCM组显著高于MTH组,BAX蛋白相对含量MTH组显著高于LCM组和HCM组,然而BCL-2/BAX增高,表明驼奶抑制肝细胞的凋亡,其效果优于MTH。

骆驼是荒漠、半荒漠地带的重要的畜种资源,其分布具有较强的地域性,仅存在于蒙古、中东的某些地区和中国的新疆和内蒙古,由于其数量的减少,产奶量较少以及鲜奶不易于保存等而不被众人所了解,其医用价值开发更少。Agrawal等[17]报道,每天饮用0.5 L驼奶,使糖尿病患者的INS需求量相对降低,血糖稳定。他们对2 099人进行了调查[18],结果说明,日常生活中饮用驼奶对糖尿病的发病率有明确的影响,驼奶对糖尿病有拮抗作用。驼奶的营养丰富,保健治疗价值也很高,但就驼奶的研究以及驼奶产业的发展并不乐观,尤其是在我国鲜有几个产业链来开发和利用。通过驼奶对疾病的辅助治疗作用机理,特别是对糖尿病和肺结核治疗作用的研究,将促进养驼业的发展,并为临床治疗提供有效的参考依据。

4 结 论

双峰骆奶能抑制BAX蛋白的合成,而促进BCL-2蛋白合成,揭示双峰骆奶能抑制细胞凋亡,促进细胞增殖。双峰骆奶具有明显的降低T2DM大鼠的血糖及肝细胞损伤的作用,可起到辅助治疗的作用。

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