脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，又名内毒素，是革兰氏阴性菌快速生长或死亡后释放出的细胞壁组分。当奶牛处于瘤胃酸中毒、子宫内膜炎和乳房炎等疾病状态下，机体腔内如消化道内的LPS移位进入动物血液，诱发宿主炎症应答[1, 2, 3, 4]。当机体处于炎症状态下，营养代谢会发生改变[5, 6]。在啮齿类动物上的研究发现，LPS可下调乳腺中脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶等乳脂合成关键酶的活性[7, 8]，并抑制脂蛋白合成酶活性，进而抑制乳腺对脂肪酸的吸收和乳脂合成功能[9]。对奶牛以LPS攻毒的试验结果也显示，LPS可下调乳腺中一些乳脂合成酶基因的表达，降低乳脂率[10]。由于乳脂率主要与乳腺内脂肪合成相关基因的表达情况及外周血中乳脂前体物的数量等因素有关。虽目前研究表明，灌注LPS可下调乳腺中一些关键酶的基因表达数量，降低乳脂率[10]，但其是否同步影响了血液中乳脂前体物的数量，尚不清楚。
亚急性瘤胃酸中毒是当前奶牛养殖业中的主要疾病之一，作者在前期普查试验中发现，饲喂高精料的奶牛血液中含有较高浓度的LPS[11]。同时，Zebeli等[3]和王书恩等[12]研究均表明，随饲粮中谷物饲料添加比例的提高，奶牛瘤胃液中LPS浓度显著增加，同时外周血中也检测到较高浓度的LPS，奶牛乳脂率下降。有相关性分析表明，高精料饲粮条件下，血液中增多的LPS可能是导致乳脂率下降的主要诱因[13]。根据以上报道，LPS对奶牛乳脂率有负面影响，该影响一方面可能是通过抑制了乳脂合成相关酶的基因表达，另一方面还可能与乳前体物的生成数量受到影响有关。基于当前的研究主要集中于前者，对后者的报道仍较少，并且当前研究主要针对乳脂，LPS是否会同步影响血液中乳蛋白前体物的数量，尚无报道。本研究提出如下假说：颈静脉灌注LPS可能会影响奶牛血液中乳蛋白与乳脂前体物的数量。因此，本试验拟通过颈静脉灌注LPS，研究其对奶牛外周血循环中蛋白质、脂质和氨基酸浓度的影响，旨在进一步探讨LPS对泌乳生理的危害。
本试验在南京市江浦奶牛场进行。选3头泌乳后期、体重为(500±25) kg的健康经产奶牛。以玉米、豆粕、麦麸、青贮、苜蓿干草及羊草为主要原料配制基础饲粮，满足我国农业行业标准(NY/T 34—2004)推荐的营养需求，基础饲粮组成及营养水平见表1。精料、羊草、苜蓿和青贮按照干重30∶ 30∶ 20∶ 20进行混合。试验奶牛采用栓饲，每日07：00和17：00进行饲喂，在04:00、12:00和20:00进行挤奶，自由饮水。
试验采用3×3拉丁方设计，分3期进行，每期15 d。其中前3天为试验期，后12天为恢复期。在正式试验前预试10 d。试验使用美国Sigma公司生产的LPS(大肠杆菌O111∶ B4)。试验期前1天对奶牛体重进行称量，安装单侧颈静脉血瘘。试验期第1天07：00使用微量注射泵进行灌注，LPS采用无热源生理盐水溶解，剂量分别为0.4和0.8 μg/kg BW。对照组除灌注液中不含LPS外(仅灌注生理盐水)，其他处理模式同试验组。灌注前将灌注液预热至37 ℃，正式灌注前灌注30 mL生理盐水，使微量注射泵适应血液压力。灌注速度为1 mL/min，灌注100 min，结束后饲喂饲粮。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) % |
在灌注后0、1、2、3、4、5、6、7、8、24和48 h通过颈静脉血瘘进行血样采集，分别保存在加肝素钠和无肝素钠的试管中，静置后3 000 r/min离心15 min，分离血清和血浆，保存于-20 ℃冰箱。血清样采用生化分析仪测定葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的浓度，血浆样采用氨基酸分析仪(L-8900，日本HITACHI)分析各氨基酸浓度。
试验数据经Excel处理后，采用SPSS 20.0软件中GLM模型中Univariate程序进行协方差分析，模型中的变量为LPS和采样时间，以及LPS与采样时间的互作效应；灌注前各指标浓度为协变量，对协方差分析具有显著性差异的指标，进一步采用Duncan氏法进行多重比较。显著性水平置于0.05。
由表2可见，颈静脉灌注LPS对奶牛血清葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白和尿素氮浓度均有显著影响(P<0.05)。除了血清尿素氮浓度为0.8 μg/kg BW LPS组>对照组>0.4 μg/kg BW LPS组外，其他各指标均为对照组>0.8 μg/kg BW LPS组>0.4 μg/kg BW LPS组。采样时间对血清葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白浓度无显著影响(P>0.05)，对血清尿素氮浓度影响显著(P＜0.05)。LPS与采样时间对以上指标均无交互效应(P>0.05)。
| 表2 颈静脉灌注LPS对奶牛血清葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白与尿素氮浓度的影响 Table 2 Effects of jugular infusion of LPS on concentrations of glucose, total protein, albumin, globulin and urea nitrogen in serum of dairy cattle |
由表3可见，灌注LPS显著影响了奶牛血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的浓度(P＜0.05)。其中血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白浓度均以0.8 μg/kg BW LPS组最高。采样时间对血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白浓度影响显著(P<0.05)。LPS与采样时间对以上指标均存在显著的交互效应(P<0.05)。
| 表3 颈静脉灌注LPS对血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白与低密度脂蛋白浓度的影响 Table 3 Effects of jugular infusion of LPS on concentrations of triglyceride, total cholesterol, high density lipoprotein and low density lipoprotein in serum of dairy cattle |
由表4可见，颈静脉灌注LPS显著降低了奶牛血浆α-氨基正丁酸、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、异亮氨酸、精氨酸和天冬氨酸的浓度(P<0.05)，但对其他游离氨基酸浓度均无显著影响(P>0.05)。同时，采样时间对甘氨酸和蛋氨酸浓度有显著影响(P<0.05)。并且，LPS与采样时间对甘氨酸浓度存在显著的互作效应(P<0.05)。
| 表4 颈静脉灌注LPS对奶牛血浆游离氨基酸浓度的影响 Table 4 Effects of jugular infusion of LPS on concentrations of free amino acids in plasma of dairy cattle |
Khafipour等[14]报道，以谷物饲料诱导奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒时，奶牛血清葡萄糖浓度显著升高，推测一方面可能与高谷物饲粮下瘤胃中丙酸(生糖前体物)浓度增高有关；另一方面与胃肠道中移位的LPS所引发的免疫反应有关。当免疫系统被激活后，机体对能量的需求增加，后者可导致糖元的分解速度加快。Steiger等[15]对小母牛长时间低剂量灌注LPS后发现，血清葡萄糖浓度总体呈下降趋势。张志辉等[16]通过对禁食小鼠尾静脉灌注LPS后发现，小鼠呈持续性低血清葡萄糖，推测其机制可能是LPS抑制了肝脏中参与糖异生的葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶的mRNA表达。Waldron等[17]通过乳静脉对泌乳期奶牛灌注LPS后发现，血清葡萄糖浓度呈现先降低后上升的趋势。本试验中，灌注LPS显著降低了血清葡萄糖浓度，其原因一方面可能是LPS抑制了肝脏内与糖元合成和分解相关的基因表达，结果导致糖元合成受阻及糖元分解速率下降，最终致外周血清葡萄糖浓度降低。另一方面，由于机体处于应激状态，机体需要耗用大量能量以维持机体稳态，结果也可能导致血清葡萄糖浓度在短时间内被大量消耗，进而引起血清葡萄糖浓度降低。乳糖主要由乳腺组织中的血清葡萄糖合成[18]，并且乳糖的合成及产奶量与葡萄糖的摄取成正相关[19]。因此，外周血中葡萄糖浓度降低，可能会影响乳腺中乳糖的合成，进而影响乳品质。
“低乳脂综合征”是当前集约化奶牛养殖场中常见生产问题，其主要诱因包括高精料下瘤胃中大幅增加的反式脂肪酸和胃肠道中移位进入血液的LPS[20]。本研究发现，灌注LPS显著降低了血清总胆固醇浓度。其机制可能是LPS抑制了肝脏中脂肪裂解酶的活性[20]，导致甘油三酯的分解速率下降，最终使甘油三酯的分解产物(总胆固醇)浓度降低，但血清甘油三酯浓度升高。Waldron等[17]通过乳静脉灌注LPS结果显示，LPS可以在短时间内升高血清甘油三酯的浓度，随后生理盐水对照组的血清甘油三酯浓度超过试验组。本研究结果显示，灌注LPS的奶牛血清总蛋白、白蛋白及球蛋白浓度显著下降，原因可能与LPS引发的肝脏与肾脏受损有关。李筠[21]研究发现，一方面，LPS可加速肝细胞凋亡，使肝脏功能减弱；另一方面，还可通过其诱导生成的肿瘤坏死因子α(TNF-α)加重肝脏损伤。在肝脏受损情况下，蛋白质合成受阻，结果导致试验组中白蛋白和总蛋白浓度下降。另外，肝功能受损还会导致细胞免疫功能紊乱，结果引发球蛋白浓度降低。高密度脂蛋白和低密度脂蛋白主要在肝脏中合成，肝脏代谢异常或肝脏功能损伤皆会影响高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的合成，这也是血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白浓度降低的主要原因。
氨基酸是蛋白质合成的主要原料，也是构成机体免疫系统的基本物质，在免疫反应中，氨基酸是发生重分配并主要用于合成参与炎症和免疫反应的蛋白质以及参与免疫细胞增殖和其他免疫反应的重要来源[22]。乳腺通过吸收血液中的各种氨基酸合成乳蛋白。因此，血液中氨基酸浓度会影响乳蛋白的浓度和组成。本研究中，灌注LPS显著降低了奶牛血浆α-氨基正丁酸、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、异亮氨酸、精氨酸和天冬氨酸的浓度。李建文等[23]和侯永清等[24]研究表明，当动物发生免疫应激时，血浆氨基酸优先用于合成急性期蛋白而非体组织蛋白，前者含有较多的异亮氨酸和精氨酸，而支链氮基酸的生成与抗体的生成有关。因此，这可能是血浆中上述几种氨基酸浓度下降的主要原因。在给奶牛灌注LPS诱发免疫反应时发现，奶牛血浆中的蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸和鸟氨酸的浓度下降，而组氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸的浓度基本不受影响[25, 26]，此结果与本试验结果相似。Gardiner等[27]通过向小鼠腹腔灌注LPS模拟脓毒血症发现，LPS继发的脓毒血症可能损伤肠细胞氨基酸吸收功能和屏障功能，导致肠道内细菌易位，LPS进入体内，加重脓毒血症。这也有可能是氨基酸浓度降低的原因。臧长江等[28]报道，通过乳静脉灌注LPS提高了乳蛋白浓度，其机制涉及LPS可能通过干扰哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录激活子5(JAK2/STAT5)通路，进而影响了乳蛋白浓度及其氨基酸组成。作者分析认为，其原因还可能包括灌注LPS激活了机体免疫反应，导致外周免疫蛋白大量进入乳腺，最终导致乳蛋白浓度增加。但由于本研究未采集奶样观察乳成分的变化，不能肯定外周灌注LPS会导致乳蛋白浓度升高或降低。然而，本研究结果提示，高精料下移位的LPS可能通过影响奶牛体内蛋白质的整体代谢，进而影响乳蛋白浓度。
颈静脉灌注LPS能够显著降低奶牛血液中蛋白质、脂质和部分氨基酸的浓度，提示高精料条件下从消化道移位的LPS可能通过机体的免疫应答，影响奶牛血液中乳蛋白与乳脂前体物的浓度。
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