, ZHOU Yinghua
, LIU Huizhi , WANG Shengping, GAO Shufeng, ZHOU Xiaoling, SHU Yan, MIU Dong, GUO Zhaohui
目前饲料安全的概念在世界范围内已形成共识，新型、绿色、无公害生物饲料成为未来饲料行业研究热点和发展方向。微生物固体发酵饲料是生物饲料的一个重要组成部分。当前发酵杂粕和发酵原料在猪方面的应用研究报道相对较多，而微生物发酵全价饲料，特别是微生物发酵不含抗生素的全价饲料在仔猪阶段的报道较少，因此本试验研究了不同添加比例的复合益生菌无抗发酵饲料和含抗生素饲料对断奶仔猪生长性能、肠道菌群、血液生化指标和免疫性能的影响，旨在为研发安全、高效、环保的无抗发酵饲料并成熟应用奠定理论基础。
试验用复合益生菌制剂由湖南省微生物研究所研制并提供，活菌数≥2×109 CFU/mL。复合益生菌制剂主要成分为乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌等。无抗发酵饲料的底物为全价乳猪配合粉料，发酵添加液体(菌液和水份)比例为40%(料水比为3∶ 2)，发酵液接种比例为5%。每个星期做1次发酵饲料，1次发酵时间为3~7 d；饲料发酵3 d以上可以使用。一个批次的发酵饲料一般要求在15 d内用完。
无抗发酵饲料发酵前和发酵7 d后成分检测结果为：发酵前，粗蛋白质18.00%、钙0.71%、总磷0.59%、无机磷0.40%；发酵7 d后，粗蛋白质18.20%、钙0.70%、总磷0.58%、无机磷0.46%、乳酸菌2.7×109 CFU/g、枯草芽孢杆菌4.2×106 CFU/g、酵母菌4.5×106 CFU/g。
将120头平均体重9.5 kg左右的“杜洛克×长白×大白”杂交断奶仔猪随机分成4个处理，每个处理3个重复，每个重复10头仔猪。对照组(A组)饲喂基础饲粮(含抗生素)，试验组(B、C、D组)分别饲喂用10%、20%、30%无抗发酵饲料替代部分基础饲粮(不含抗生素)配制的试验饲粮。抗生素为在每千克预混料中添加20 mg硫酸黏杆菌素+40 mg杆菌肽锌。试验于2012年7月10日至2012年8月14日在湖南恒惠农牧有限公司猪场进行。基础饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels the basal diet (air-dry basis) % |
按猪场常规饲养管理程序进行。预试期3 d，同时进行预防接种、驱虫，进入正试期后，各组分别饲喂相应饲粮。自由采食，自由饮水，按猪场正常程序进行免疫。试验期34 d。
分别于试验的第1天和最后1天08:00空腹称重，根据初重和末重计算平均日增重。每周记录各组的采食量，试验结束后结算各组消耗饲料，计算平均日采食量和料重比。每天08:00观察仔猪粪便情况，记录腹泻头数，计算腹泻率。
腹泻率(%)=[总腹泻次数／(总头数×试验天数)]×100。新鲜粪便取样分别在试验前期第10天、试验中期第21天和试验后期第34天，取样后装入塑料样品袋放置于-20 ℃冰箱中保存。采用平板稀释方法对粪便样品中的乳酸菌、大肠杆菌和沙门氏菌进行计数。
乳酸菌：用微量取液器分别移取粪便10-4～10-6稀释液1.0 mL接种于乳酸菌选择性培养基(MRS)平皿上(各稀释度设3个重复)，37 ℃厌氧培养48 h后进行菌落计数。
大肠杆菌：用微量取液器分别移取粪便10-4～10-6稀释液1.0 mL涂布接种于麦康凯培养基平皿上(各稀释度设3个重复)，置于37 ℃培养箱中有氧培养24 h后，选取粉红色或红色，表面光滑、凸起，边缘整齐不透明，质地软、黏，直径1.0～3.0 mm的菌落进行计数，并通过相应生化试验对大肠杆菌进行鉴定。
沙门氏菌：用微量取液器分别吸取不同梯度的粪便稀释液1.0 mL于培养血中，与冷却至45 ℃的沙门氏菌-志贺氏菌琼脂培养基(SS琼脂)混合(各稀释度设3个重复)，倾注法进行菌落计数[1]，37 ℃培养24 h，检测菌体数量。
试验结束时08:00空腹从各组随机抽出3头中等体重仔猪前腔静脉采血各5 mL，血样于采血管中斜面静止等析出血清后，3 000 r/min离心15 min并用无菌注射器吸取上层透明血清于离心管中，得血清样品。将各血清样品分装于1 mL塑料离心管并移动式低温保藏箱中保存备用，保存的血清送至永州市人民医院检测。碱性磷酸酶、谷草转氨酶活性和尿素氮、葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白含量采用日立7020全自动生化分析仪测定。血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量采用免疫透射比浊法测定。
试验结束前，连续5 d以不完全收粪法采集粪便，每天收粪1次。在猪圈四角和中间5点共采集粪便100 g，加10% H2SO4 10 mL，搅拌均匀，放置4 ℃冰箱中备用。测定前先将粪样50 ℃烘至半干，粉碎。按4 mol/L盐酸不溶灰分指示剂法测定饲粮的粗蛋白质、干物质、有机物、粗纤维和磷的消化率。酸不溶灰分指示剂法参照《家畜饲养学实验指导》[2]。
采用SAS 9.1.3统计软件对数据进行方差分析和Duncan氏法多重比较，P＜0.05和P＜0.01分别为差异显著和极显著。
由表2可知，C组平均日增重最高，D组平均日增重最低，C组平均日增重显著高于D组(P<0.05)；与对照组相比，C组平均日增重提高了6.37%(P>0.05)。4个组之间的平均日采食量差异不显著(P>0.05)。4个组之间的料重比差异极显著(P<0.01)，其中D组料重比显著高于其他各组(P<0.05)；3个试验组中，C组的料重比最低，比对照组降低了5.54%(P>0.05)。4个组之间的腹泻率差异极显著(P<0.01)，其中C组显著低于对照组(P<0.05)，而D组显著高于对照组(P<0.05)；4个组中C组的腹泻率最低，比对照组降低了63.63%(P<0.05)。
| 表2 无抗发酵饲料对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of fermented feed without antibiotic on growth performance of weaner piglets |
由表3可知，在前期阶段，3个试验组的粪便中乳酸菌数量都显著高于对照组，其中C和D组乳酸菌数量与对照组相比较分别显著提高了25.1%和36.1%(P<0.05)。在中期阶段，3个试验组的粪便中乳酸菌数量都显著高于对照组(P<0.05)，分别比对照组的乳酸菌数量提高了55.6%、96.9%和69.8%。在后期阶段，B和D组的粪便中乳酸菌数量分别比对照组的提高了64.9%和73.6%(P<0.05)。
4个组之间断奶仔猪粪便中前期和后期的大肠杆菌数量差异极显著(P<0.01)。在前期阶段，3个试验组的粪便中大肠杆菌数量都显著低于对照组(P<0.05)，分别比对照组降低了78.8%、93.1%和88.7%。在中期阶段，C和D组的粪便中大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05)，分别比对照组降低了61.1%和59.7%。在后期阶段，只有B组的粪便中大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05)，比对照组降低了75.1%。
4个组之间断奶仔猪前期、中期和后期粪便中的沙门氏菌数量差异均不显著(P>0.05),但是B、C和D组的粪便中沙门氏菌数量都要相对略低于对照组。
| 表3 无抗发酵饲料对断奶仔猪粪便中微生物数量的影响
Table 3 Effects of fermented feed without antibiotic on faecal microbial number of weaner piglets lg(CFU/g)
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由表4可知，4个组之间断奶仔猪血清谷草转氨酶活性差异不显著(P>0.05)。4个组之间断奶仔猪血清碱性磷酸酶活性差异显著(P<0.05)，其中C和D组与对照组相比显著提高了20.6%和12.0%(P<0.05)。B、C和D组的断奶仔猪血清尿素氮含量显著低于对照组(P<0.05)。B和C组的断奶仔猪血清葡萄糖含量显著高于对照组(P<0.05)。4个组之间断奶仔猪血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量和白蛋白/球蛋白差异均不显著(P>0.05)，但是C和D组的血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量都要略高于对照组，白蛋白/球蛋白略低于对照组。4个组之间断奶仔猪血清IgM和IgA含量差异均不显著(P>0.05)。4个组之间断奶仔猪血清IgG含量差异极显著(P<0.01)，其中C和D组的血清IgG含量显著高于对照组(P<0.05)。
| 表4 无抗发酵饲料对断奶仔猪血液生化指标和免疫指标的影响
Table 4 Effects of fermented feed without antibiotic on blood biochemical parameters and immune parameters of weaner piglets
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由表5可知，4个组之间干物质、总钙和总磷的表观消化率差异不显著(P>0.05)，B、C和D组的干物质、总钙和总磷的表观消化率都要略高于对照组。4个组之间粗蛋白质和粗纤维的表观消化率差异极显著(P<0.01)，其中B、C和D组的粗蛋白质表观消化率比对照组显著提高了4.39%、6.02%和6.65%(P<0.05)，B、C和D组的粗纤维表观消化率比对照组显著提高了7.39%、17.19%和13.31%(P<0.05)。
| 表5 无抗发酵饲料对断奶仔猪养分表观消化率的影响
Table 5 Effects of fermented feed without antibiotic on nutrient apparent digestibility of weaner piglets
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本试验中无抗发酵饲料采用的是由乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌组成的复合微生态制剂。无抗发酵饲料中除了含有一定活菌，还有益生菌代谢产生的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，可以提高动物的消化能力，提高动物的生长性能。此外，酵母菌和芽孢杆菌等好氧菌的代谢提供肠道厌氧环境进而促进乳酸菌大量繁殖，产生大量乳酸，一方面可以赋予发酵饲料酸香味，改善适口性，促进采食；另外一方面可以降低肠道pH，提高消化能力[3]。
在本试验中，综合平均日增重、平均日采食量、料重比以及腹泻率指标来看，20%无抗发酵饲料组效果最好，可以提高仔猪平均日增重和平均日采食量，显著降低料重比和腹泻率。从试验结果来看，并非无抗发酵饲料的添加比例越大，断奶仔猪的生长性能就越好，也存在一个最佳添加量和范围的问题。过多的微生物活菌进入动物肠道需要额外消耗部分营养物质，进而影响宿主动物本身的营养物质吸收利用和生长发育，这一点在前人的研究中已有报道[4, 5]。
目前发酵全价饲料的研究报道较少，现有少量研究报道都是采用含有抗生素的全价料进行发酵，还有一些研究则侧重于原料的发酵。本研究结果和前人基本一致，如魏金涛等[6]的发酵复合基础料(玉米、豆粕和膨化大豆按7∶ 2∶ 1配比组成)可以提高仔猪的平均日增重和料重比，降低了腹泻率；何正兴等[7]采用35%和50%微生物发酵蛋白饲料替代部分豆粕在育肥猪的试验结果发现，其可以提高育肥猪增重13%～16%，降低料重比；李敏等[8]采用5%的发酵预混合饲料替代对照组的发酵饲料(玉米、豆粕、麦麸、棉粕及次粉的混合物)进行育肥猪试验结果也发现其有提高生长性能的趋势；刘瑞丽等[9]在饲粮中添加15%~20%的经复合益生菌发酵的非常规饲料(玉米、小麦粉、豆粕、酒糟粉、菜籽粕和血粉)对育肥猪试验结果发现其具有提高生长性能的趋势；严验东等[10]的益生菌发酵饲料(100%添加)育肥猪试验结果也与之类似。
正常情况下，动物肠道内各种微生物区系之间保持着动态的平衡。当机体受到某些应激因素的影响导致肠道微生物菌群之间比例失调，使得肠道优势主导菌群发生更替，一些致病菌或者条件致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌等大量增加，成为优势菌群，打破肠道微生态平衡，排放内毒素和产生其他毒副作用，引起机体消化机能紊乱，导致动物生长性能下降。比如仔猪断奶这一生理过程就是一个巨大的应激因素，会导致断奶仔猪肠道微生物菌群出现短时失衡状态，因此营养学家和养殖生产者都积极在此阶段应用以乳酸菌为主的单一或者复合微生态制剂干预并纠正仔猪肠道微生态体系失衡现象，从而保证其良好生长性能发挥[4, 11, 12]。
本试验结果表明，与含抗生素的对照组相比，无抗发酵饲料组可以增加试验前期、中期和后期粪便中的乳酸菌数量，减少粪便中大肠杆菌数量；而对试验前期、中期和后期粪便中的沙门氏菌影响的差异不显著。本试验研究结果与以前国内外学者研究结论基本一致，如Canibel等[11]和Van Winsen等[13]研究表明，饲喂发酵饲料能显著降低小肠中大肠杆菌和沙门氏菌的数量，对病原菌具有较好的抑菌效果；陆文清等[14]采用人工感染大肠杆菌断奶仔猪作为试验动物对象，发现发酵饲料可改善仔猪小肠的微生物区系平衡程度，显著提高仔猪小肠乳酸菌数量，相对降低肠道大肠杆菌数量；陈鲜鑫等[1]试验发现，乳酸菌发酵液体饲料较传统干料和湿拌料，可显著提高生长猪粪便中乳酸菌含量，显著降低粪便中大肠杆菌和沙门氏菌含量；李清定等[15]研究结果表明，微生物发酵饲料能够显著提高生长猪粪便中乳酸菌含量，降低大肠杆菌含量。其作用机理可能有以下3点：第一是与发酵饲料中产生的有机酸有关，有机酸酸化的消化道环境能降低或抑制大肠杆菌等病原菌在肠道上的定植；第二是发酵饲料中的好氧菌进入动物肠道消耗氧气形成厌氧环境，降低肠道的氧化还原电势，增强肠道对乳酸杆菌、双歧杆菌等厌氧菌的定植抗力，有利于厌氧菌生长[5, 16]；第三是乳酸菌和芽孢杆菌等有益微生物在增殖中能竞争抑制有害病原的繁殖[17]。
仔猪血液生化指标的改变是机体新陈代谢机能发生改变的综合反映。比如血液中葡萄糖能够反映机体的代谢状况，其含量越高代表机体利用血糖进行合成代谢能力越强。血液中的葡萄糖作为一种重要的能量物质，为机体蛋白质的合成提供能量；此外，葡萄糖的吸收还能够促进胰岛素的释放，从而促进蛋白质的合成[18]。本试验中无抗发酵饲料10%和20%组的血清葡萄糖含量显著高于对照组。血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反映肝脏和心脏功能的重要标志，其活性过高，说明肝脏和心脏有可能被损害[19]。唐晓玲等[20]认为血清中丙氨酸转氨酶和碱性磷酸酶活性均可反映动物对蛋白质和脂类的代谢效率，特别是碱性磷酸酶，其活性的高低可反映动物的生长速度和生长性能[20]。本试验中无抗发酵饲料20%和30%组的碱性磷酸酶活性显著高于对照组，无抗发酵饲料组的谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性高于对照组，也进一步证实了益生菌发酵饲料可以提高猪的生长性能。血清尿素氮含量可以较准确地反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况，氨基酸平衡良好时血清尿素氮含量下降[10]。本试验结果表明，无抗发酵饲料组的血清尿素氮含量显著低于对照组，表明微生物发酵饲料增加了机体氮沉积量，有利于蛋白质合成，促进生长。本试验无抗发酵饲料对断奶仔猪血液生化指标的结果与前人研究基本一致[6, 10, 14, 19]。
血清中总蛋白含量反映了机体对蛋白质的吸收状况以及与体液免疫的关系。白蛋白是构成血浆胶体渗透压的主体和血液中水溶性较低物质的运输载体，对肝脏在蛋白质代谢中起着重要作用[21]。血清球蛋白是机体免疫器官制造的，大部分在肝细胞外生成，与动物机体的免疫力有密切关系。球蛋白要保持一定的含量，球蛋白检测值超过正常值说明体内存在免疫系统的亢进，球蛋白检测值低于正常值说明免疫力不足。免疫球蛋白对机体免疫力具有重要作用，免疫水平的高低间接反映了机体对疾病的抵抗能力。本试验研究结果显示，无抗发酵饲料组与有抗生素的对照组相比，无抗发酵饲料对断奶仔猪的血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、IgM和IgA含量均无显著影响，但其中20%和30%无抗发酵饲料组的上述5个指标都要高于对照组，而且3个无抗发酵饲料组的血清IgG含量都显著高于对照组，表明断奶仔猪饲粮中添加微生物发酵饲料有助于提高其机体的免疫能力，与众多研究结果基本一致[22, 23, 24, 25]。益生菌发酵饲料能够提高动物的免疫力，其作用机理可能有以下5个方面：一是有益生菌在肠道黏膜的定植能激活肠道黏膜的免疫功能，比如乳杆菌和短双歧杆菌等益生菌能促进小肠淋巴组织集合B细胞增生，增强宿主黏膜的免疫反应，诱导淋巴组织集合的浆细胞产生大量的分泌型免疫球蛋白(sIgA)，进而增强机体的免疫功能[26]；二是肠道益生菌群能促进机体免疫器官的生长发育、成熟，增加T细胞、B淋巴细胞的数量，胸腺淋巴细胞免疫球蛋白含量增多，启动免疫应答[26]；三是益生菌能激活肠黏膜中的巨噬细胞、T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞，通过调节对免疫应答和炎症反应有介导作用的细胞因子[白细胞介素(IL)-2、IL-6、IL-4、IL-5、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ等]产生量来调控T淋巴细胞和B淋巴细胞分化方向[3]；四是益生菌(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等)通过直接或者间接地发挥免疫佐剂的作用，提高接种疫苗的抗体水平，增强机体的局部或全身防御功能[26]；五是益生菌能代谢合成乳多肽类抗生物质等细菌素，刺激免疫应答反应，激活免疫系统[22]。
动物对饲料的消化性能和自身的生长性能密切相关，对营养物质的消化吸收利用效率越高，越有利其生长性能发挥。本试验结果中，无抗发酵饲料组与对照组相比，其粗蛋白质和粗纤维表观消化率显著提高，钙、磷表观消化率也有所提升，说明发酵饲料可以提高仔猪营养物质的消化率，与前人研究结果基本一致[6, 9, 27]。发酵饲料中的益生菌及其产生的消化酶可以将饲料中的粗蛋白质、碳水化合物分解为小肽、游离氨基酸和小分子营养物质，补充蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等消化酶，产生有机酸能够提高动物肠胃消化力。魏金涛等[6]研究发现，饲料发酵后可以将植酸磷转化为动物容易吸收的无机磷，提高动物对磷的利用率。刘瑞丽等[9]采用复合益生菌对混合杂粕(酒糟粉、菜籽粕和血粉混合)和酒糟进行发酵，其无机磷含量分别提高了2.37和6.46倍。猪的排泄物中含有大量的氮和磷，易造成水和土壤的富营养化，破坏生态环境，是生猪养殖污染的主要来源之一，而复合益生菌发酵饲料可以提高氮和磷的利用率，减少粪便中氮和磷排放，降低对环境的污染。
综合各项指标可见，在断奶仔猪饲粮中添加20%的无抗发酵饲料效果较好，能提高仔猪的生长性能，改善肠道微生物平衡，增强免疫性能和提高养分表观消化率。
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