免疫力缺乏和大量应激的存在是肉鸡规模化养殖的两大挑战。免疫力缺乏可使肉鸡容易感染各种疾病,造成大量死亡;还会将更多能量用于维持免疫,影响生产性能。应激情况下,肉鸡体内产生的多余氧自由基会和细胞膜上的不饱和脂肪酸发生反应,破坏核酸和蛋白质等生物大分子结构,导致疾病的发生发展[1]。因此,引进、推广优良肉鸡品种,并通过最恰当的方式进行营养调控来提高肉鸡的免疫和抗氧化能力显得尤为重要。维生素C是一种水溶性维生素,具有抗应激[2]、抗氧化[3]和提高免疫力[4]等功能,但易氧化的特性使其在饲粮和饮水中直接添加受到限制[5]。而长久以来,为了使家禽获得更好的生产性能,研究者也多采用改善饲养或繁殖环境、优化营养配比的方式来实现[6]。近年来种蛋显微操作技术的发展为家禽营养调控开辟了一个全新的领域——胚蛋注射营养(in ovo feeding,IOF)[6, 7]。IOF源于鸡胚接种技术,是指将外源营养素注射到家禽的胚蛋中[8]。研究表明,IOF能促进家禽的胚胎发育[9]、能量储备[10]和出雏后的生长发育[11]等。萨索(Sasso)肉鸡是由法国SASSO公司专门选育的有色优质肉鸡,具有肉质好、生长快和抗病力强等优点,在欧洲市场广受欢迎[12]。于Sasso肉鸡种蛋孵化的合适时期外源注射维生素C可能会改善其生产性能、免疫和抗氧化性能。因此,本试验旨在探索通过IOF方式补充维生素C来提高肉鸡生产性能、免疫和抗氧化性能的可行性,以期为后续研究提供理论和实践基础。
孵化机:蓝电孵化机(9TV-3A,北京蓝天蛟电子技术有限公司)。
维生素C标准品(Sigma,A5960):C6H8O8,纯度≥99.0%。
种蛋:Sasso肉鸡(C44,浅红羽)种蛋180枚,购于西安市高陵祖代鸡场。
本试验采用单因素完全随机设计。将180枚Sasso肉鸡种蛋随机分为3个处理,每个处理4个重复,每个重复15枚。于种蛋孵化第11天进行注射:对照组每枚种蛋注射0.1 mL生理盐水,维生素C注射组每枚种蛋分别注射含3和15 mg维生素C的0.1 mL的生理盐水。孵化21 d出雏后,每重复选取体重均匀、健康的雏鸡10只进行饲养,饲养期42 d。
温度:前期(1~10 d)控制在38.0~38.2 ℃,后期(11~18 d)控制在37.8~38.0 ℃,落盘(19~21 d)控制在37.5~37.8 ℃;湿度:45%~65%;翻蛋:翻蛋周期为120 min,翻蛋时间为180 s;孵化前期注意控温,孵化后期注意通风。
注射体积:0.1 mL;注射部位:卵黄囊;维生素C注射液的配制:将维生素C溶解在生理盐水中,分别配制成30和150 mg/mL的注射液。
注意事项:种蛋孵化第11天进行注射,注射前先照蛋,剔除死胚蛋和无精蛋,同时确定胚胎在种蛋中的大致位置;注射前用75%酒精在注射点附近擦拭消毒;注射器针头的长度和管径要适宜;1枚种蛋用1枚针头;注射完用塑胶封口。
参照NRC(1994)肉鸡营养需要配制基础饲粮(表1)。试验鸡采用3层阶梯式笼养,各重复均匀分布于鸡舍,自由采食和饮水。按常规程序进行鸡只免疫和栏舍消毒。整个饲养阶段的饲粮和饮水中不以任何形式添加维生素C。
于肉鸡1、21和42日龄时,每重复挑选与该重复平均体重相近的肉鸡1只,1日龄颈静脉采血1 mL(肝素钠抗凝),21和42日龄翅静脉采血10 mL(肝素钠抗凝),均3 000 r/min离心10 min,取分离后的血浆分装于1.5 mL EP管中,-80 ℃保存,用于生化指标的测定。试验鸡采血结束,颈部放血致死,取脾脏和法氏囊进行称重。
分别于肉鸡21和42日龄(之前停饲12 h)按重复称体重和剩料量,计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
分别于肉鸡21和42日龄时,每重复随机挑选1只鸡,翅静脉采血,肝素钠抗凝:用微量取样器沿管壁取1 mL抗凝血于离心管中,迅速加入低温保存的磷酸盐缓冲液(PBS)1 mL,慢慢混匀;将混合液沿管壁缓慢加入到盛有2 mL淋巴细胞分层液(室温预置)的试管中,2 000 r/min离心25 min;吸取中间乳白色淋巴细胞层于预冷的离心管中,加适量PBS,混匀,4 ℃ 下2 000 r/min离心15 min;弃上清,加适量PBS,混匀,4 ℃ 下2 000 r/min离心10 min;加入PBS 500 μL,充分混匀,取200 μL混悬液依次加入CD3单抗和CD8单抗10 μL,及CD4单抗5 μL,充分混匀,低温避光孵育30 min;加PBS于离心管0.5刻度线处,4 ℃下 1 500 r/min离心5 min,加适量PBS上流式细胞仪测定。
血浆总抗氧化能力(T-AOC)测定:Fe3+还原法;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定:二硫代二硝基苯甲酸比色法;超氧化物歧化酶(SOD)活性测定:黄嘌呤氧化酶法;丙二醛(MDA)含量测定:硫代巴比妥酸(TBA)比色法;试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产。
采用SPSS 18.0统计软件进行one-way ANOVA,用Duncan氏法进行多重比较,以P<0.05为显著性判断标准。
由表2可知,3 mg注射组的种蛋孵化率和肉鸡初生重显著高于其他组(P<0.05),生理盐水注射组和15 mg注射组的种蛋孵化率和肉鸡初生重均差异不显著(P>0.05)。
孵化期注射维生素C对1~21日龄肉鸡的ADFI无显著影响(P>0.05),但3 mg注射组22~42日龄和1~42日龄肉鸡的ADFI显著提高(P<0.05)。各组22~42日龄和1~42日龄肉鸡的ADG均差异不显著(P>0.05),但3 mg注射组1~21日龄肉鸡的ADG显著低于生理盐水注射组(P<0.05)。与生理盐水注射组相比,3 mg注射组1~21日龄肉鸡的F/G显著提高(P<0.05),且3 mg注射组1~42日龄肉鸡的F/G显著高于其他组(P<0.05)。
由表3可知,与生理盐水注射组相比,孵化期注射3和15 mg维生素C使肉鸡脾脏指数在21日龄分别降低了19.0%和18.4%,在42日龄分别降低了13.6%和12.6%;法氏囊指数在21日龄分别降低了31.2%和30.9%,在42日龄分别降低了27.6%和26.2%,但方差分析均差异不显著(P>0.05)。
由表4可知,各组肉鸡21和42日龄外周血 CD3+CD4+比例、CD3+CD8+比例和 CD3+CD4+/CD3+CD8+均差异不显著(P>0.05)。
由表5可知,15 mg注射组肉鸡21日龄血浆T-AOC显著高于3 mg注射组(P<0.05),42日龄各组血浆T-AOC差异不显著(P>0.05)。各组21日龄肉鸡血浆GSH-Px和SOD活性差异不显著(P>0.05),但15 mg注射组42日龄肉鸡血浆GSH-Px和SOD活性显著高于生理盐水注射组和3 mg注射组(P<0.05)。各组21和42日龄肉鸡血浆MDA含量均差异不显著(P>0.05)。
对于孵化场而言,种蛋孵化率提高意味着经济效益提高,而种蛋中注射营养素可提高孵化率[13, 14]。本试验结果表明,种蛋中注射3 mg维生素C时可显著提高孵化率(P<0.05)。Elíbol等[15]的研究同样表明,种蛋孵化第13天注射3 mg的维生素C能显著降低孵化后期的胚胎死亡率(P<0.05)。新生卵中不存在维生素C,当胚胎发育至第3~4天时,可内源性合成,但在人工孵化条件下,合成的数量不能满足发育需求[6]。尤其到孵化后期,过量代谢热的产生会影响胚胎发育[16],此时添加维生素C可有效缓解这种压力[17]。这是因为维生素C可调节肾上腺激素对21-羟化酶和β-羟化酶的抑制作用,利于肾上腺酮产生,促进糖异生,使胚胎有足够的能量来适应胚胎发育后期孵化环境的改变[16]。数据表明,白莱航鸡种蛋孵化至第15天时,血浆中维生素C的含量开始显著降低(P<0.05)[18],而当胚胎发育到第10天以后,因代谢热增加可提高胚胎死亡率[16]。但维生素C浓度并非越高越好,若血液中肾上腺酮的含量长时间维持在较高水平,会对机体产生毒性,损害机体健康而降低孵化率[16]。增加维生素C的浓度会伴随着对胰岛β细胞毒性的增加[19];种蛋孵化前注射750 mg/mL的维生素C对胚胎是有毒性的[20]。因此本研究中,当维生素C的注射量为15 mg时并未显著提高种蛋的孵化率(P>0.05),可能与高浓度维生素C对胚胎发育的毒性有关。
免疫器官称重法是研究机体免疫体况的方法之一。一般认为免疫器官相对重量降低为免疫抑制所致,而免疫器官相对重量增加则为免疫增强的表现[21]。法氏囊和脾脏是家禽重要的免疫器官,其中法氏囊属于中枢免疫器官,是血清抗体生成系统的细胞成长和分化部分,对雏鸡的免疫能力有较大的决定作用;脾脏属于外周免疫器官,能产生淋巴细胞和B细胞,分泌特殊抗体[21]。本试验结果表明,孵化期注射3和15 mg维生素C后,21和42日龄的脾脏指数分别降低了19.0%、18.4%和13.6%、12.6%,法氏囊指数分别降低了31.2%、30.9%和27.6%、26.2%,但方差分析均差异不显著(P>0.05),说明孵化期注射维生素C可能会抑制肉鸡免疫器官发育。研究表明,鸡脾脏在胚胎发育至12胚龄时初具轮廓,随后开始快速发育[22];对鸡法氏囊功能发挥有重要作用的黏膜皱襞从孵化期第11~12天开始形成[23]。而本试验选取的注射时间是11胚龄(孵化期第11天),免疫器官发育处在关键时期,可能因注射带来的外源刺激而受到影响。另外,孵化期注射维生素C促进胚胎在发育后期利用更多的能量来缓解热应激,也可能是影响免疫等器官发育的原因之一。
机体外周血淋巴细胞的数量及T淋巴细胞不同亚型的分布与机体的免疫状态直接相关[24]。正常情况下,机体T淋巴细胞各亚型的数量和比例相对稳定,它们共同使机体在遭受外来抗原刺激时产生正常的免疫应答,维持机体免疫状态平衡[25]。特别是外周血中参与对外源性抗原识别的CD4+T淋巴细胞、内源性抗原识别的CD8+T淋巴细胞水平及两者比值(CD4+/CD8+)是评价机体免疫状态的重要指标[24]。
维生素C与免疫系统之间存在明显交互作用[26]。研究表明,维生素C有助于免疫细胞免受免疫反应时释放的酶、酸和氧化物等构成的自噬机制的影响,因此保持细胞内较高的维生素C水平,可使免疫细胞在遭受病原体侵害时发挥更持久的作用[27]。但McCorkle等[28]指出细胞介导的免疫应答不因添加维生素C而受到影响。本试验中,孵化期注射不同水平的维生素C对肉鸡外周血T淋巴细胞亚型没有影响(P>0.05),说明维生素C不参与T淋巴细胞亚型分化。McCorkle等[28]同样认为,维生素C可参与B淋巴细胞分化,但对T淋巴细胞的分化无调节作用。
肉鸡因代谢、生长发育快,易发生脂质过氧化反应,产生对机体有害的过氧化产物[21]。维生素C作为一种抗氧化剂,在细胞外液中通过中和机体代谢过程中产生的超氧阴离子自由基(O-2·)和羟基自由基(·OH)等自由基及其氧化物,来保护生物膜免受脂质过氧化的破坏[29]。
血液和组织的T-AOC、SOD和GSH-Px活性及MDA含量是反映机体抗氧化性能的重要指标。本试验结果表明,与生理盐水注射组和3 mg注射组相比,孵化期注射15 mg维生素C可显著提高肉鸡42日龄血浆GSH-Px和SOD活性(P<0.05),且15 mg注射组21日龄肉鸡血浆T-AOC显著高于3 mg注射组(P<0.05),但与生理盐水注射组差异不显著(P>0.05)。这说明孵化期注射15 mg维生素C可在一定程度上提高肉鸡的抗氧化性能,这与饲粮中添加维生素C的效果相似。但哪种方式对抗氧化性能的提高更为突出,需进一步研究。
① 孵化期注射3 mg维生素C可提高肉鸡的孵化率、初生重和1~42日龄ADFI,但提高了1~42日龄F/G。
② 孵化期注射15 mg维生素C可在一定程度上提高肉鸡的抗氧化性能。
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