α-亚麻酸(α-linolenic acid,LNA;C18 ∶ 3n-3)和亚油酸(linoleic acid,LN;C18 ∶ 2n-6)为淡水鱼类的必需脂肪酸(essential fatty acids,EFA),可以通过去饱和作用以及碳链延长作用转化为长链高不饱和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids,HUFA),对鱼体的生理、生化和细胞学功能有着重要作用[1, 2]。大量研究表明,α-亚麻酸、亚油酸对鱼虾类的生长、存活有促进作用,但不同种类的添加效果不同,添加量过低或过高都会造成鱼类的生长抑制[3, 4, 5, 6]。本试验拟研究团头鲂幼鱼饲料中适宜的α-亚麻酸、亚油酸含量,旨在为团头鲂配合饲料的配制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验鱼和饲养管理选择平均体重为(59.5±0.5) g的团头鲂幼鱼作为试验鱼,在浙江一星饲料集团海盐试验基地池塘网箱中进行养殖试验。
养殖试验分为2个部分,分别为α-亚麻酸和亚油酸试验,每个试验设6个浓度梯度(组)。共挑选960尾体格健壮、规格整齐的团头鲂幼鱼,随机分为12个组,每组4个重复,每个重复20尾,以 重复为单位分养于网箱中。
试验池塘养殖面积4亩(1亩=677 m2),网箱规格为1.0 m×1.5 m×2.0 m。池塘中央配备2台功率为1.5 kW的叶轮式增氧机。日投饵2次,每天08:00、15:00定时投喂。日投喂量为鱼体重的3%~5%,正式养殖试验持续85 d。每2周根据估算的鱼体重增加量调整投喂量。养殖试验期间水温21.0~32.9 ℃,水温逐渐升高(图1),为适宜团头鲂快速生长的水温;养殖水体溶氧浓度>6.5 mg/L,pH 7.2~8.0,氨氮浓度<0.2 mg/L,亚硝酸盐浓度<0.01 mg/L,硫化物浓度<0.05 mg/L。
1.2 试验饲料
采用气相色谱仪以归一法定量得到试验用亚麻籽油(食用级)、玉米油(食用级)、棕榈油(熔点24 ℃、食用级)和大豆卵磷脂(食用级)的脂肪酸组成,见表1。玉米油含有55.70%的亚油酸,亚麻籽油含有52.86%的α-亚麻酸,而棕榈油则以棕榈酸(36.73%)、油酸(44.40%)为主,大豆卵磷脂的亚油酸含量为60.94%。
试验油脂以棕榈油为基础油脂,分别以亚麻籽油、玉米油提供α-亚麻酸、亚油酸。棕榈油与亚麻籽油在试验油脂中的6个混合比例分别为6 ∶ 0、5 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 5,棕榈油与玉米油的6个混合比例同上,共制备出12种试验油脂。
试验采用半纯化基础饲料配方,试验油脂按照6.0%的比例添加,通过更换配方中的试验油脂来配制不同α-亚麻酸、亚油酸含量的12种试验饲料,其组成及营养水平见表2。
饲料原料经粉碎过60目筛,按配方比例称重,混匀,用绞肉机制成1.5 mm粗细的条状料,再切成2~3 mm长的颗粒,置于阴凉处风干,待可以不相互粘连、水分在20%~25%时,将饲料放入-20 ℃冰柜保存。每次使用时,将饲料从冰柜拿出后,自然升温到常温后再投喂。实际使用的饲料量按照干重计算。
α-亚麻酸试验中,实测各试验饲料中α-亚麻酸的含量分别为0.02%、0.55%、1.08%、1.60%、2.13%、2.65%;其中,亚油酸含量为1.34%~1.45%。亚油酸试验中,实测各试验饲料中亚油酸 的含量分别为0.86%、1.29%、1.73%、2.16%、2.59%、3.03%;其中,α-亚麻酸含量为0.02%~0.04%。
1.3 样品采集和分析方法养殖试验结束时,禁食24 h,统计每个网箱鱼体总重、尾数,统计投喂的饲料量、成活率,计算特定生长率和饲料系数,计算公式如下:
特定生长率=100×(ln终末均重-ln初始体重)/饲养天数;
饲料系数=饲料摄入量/(终末均重-初始体重)。
另在每个网箱中随机取3尾鱼,尾静脉采集血液,静置0.5 h左右,常温下待血液凝固、析出血清后,3 000 r/min、4 ℃离心10 min,收集血清,液氮速冻、保存运回实验室,-80 ℃低温冰箱保存;测定体重和体长,解剖取内脏和肝脏,称重,计算肥满度、脏体指数、肝体指数比,计算公式如下:
肥满度=100×体重/体长3;
脏体指数=100×内脏重/体重;
肝体指数=100×肝脏重/体重。
采用雅培C800全自动生化分析仪,分别测定血清中总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量。
1.4 数据处理与分析试验结果用SPSS 17.0软件进行统计分析,采用平均值±标准差(mean±SD)表示,在单因素方差分析的基础上,采用Duncan氏法多重比较检验组间差异,以P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 团头鲂幼鱼生长速度、饲料系数与饲料中α-亚麻酸、亚油酸含量的关系在池塘网箱中,经过85 d的正式养殖试验,得 到试验团头鲂的生长速度(以特定生长率表示)、饲料系数、成活率数据。团头鲂在试验期间的成活率均为100%。α-亚麻酸、亚油酸试验中各组团头鲂幼鱼特定生长率、饲料系数的结果分别见表3和表4。
由表3可知,6个α-亚麻酸试验组团头鲂幼鱼的特定生长率达到1.38%/d~1.43%/d,最高特定生长率出现在1.08%组,为(1.43±0.01)%/d,显著高于0.02%和2.65%组(P<0.05);饲料系数为1.29~1.39,最低值出现在1.08%组,为1.29±0.02,显著低于0.02%和2.65%组(P<0.05)。
依据表3的试验结果,用团头鲂幼鱼特定生长率(y)对饲料中α-亚麻酸含量(x)作图,得到图2中回归曲线,求得其二次回归方程[7]为y=-0.027 8x2+0.073 4x+1.381 5,R2=0.953 3。依据回归方程计算得到,在饲料α-亚麻酸含量为1.32%时,团头鲂幼鱼具有最大的特定生长率,为1.43%/d。
依据表3的试验结果,用团头鲂幼鱼饲料系数(y)对饲料中α-亚麻酸含量(x)作图,得到图3中回归曲线,求得其二次回归方程为y=0.046 4x2-0.123 1x+1.378 6,R2=0.964 1。依据回归方程计算得到,在饲料中α-亚麻酸含量为1.33%时,团头鲂具有最小的饲料系数,为1.30。
由表4可知,6个亚油酸试验组团头鲂幼鱼的特定生长率达到1.29%/d~1.37%/d,最高特定生长率出现在1.73%组,为(1.37±0.02)%/d,显著高于0.86%组(P<0.05);饲料系数为1.40~1.54,最低值出现在1.73%组,为1.40±0.03,显著低于0.86%和3.03%组(P<0.05)。
依据表4的试验结果,用团头鲂幼鱼特定生长率(y)对饲料中亚油酸含量(x)作图,得到图4中回归曲线,求得其二次回归方程为y=-0.051 7x2+0.210 1x+1.154 1,R2=0.942 6。依据回归方程计算得到,在饲料亚油酸含量为2.03%时,团头鲂具有最大的特定生长率,为1.37 %/d。
依据表4的试验结果,用团头鲂幼鱼饲料系数(y)对饲料中亚油酸含量(x)作图,得到图5中回归曲线,求得其二次回归方程为y=0.098 3x2-0.397x+1.796 9,R2=0.936 5。依据回归方程计算得到,在饲料亚油酸含量为2.02%时,团头鲂具有最小的饲料系数,为1.42。
上述结果表明,饲料中α-亚麻酸、亚油酸含量对团头鲂的生长速度和饲料系数产生了影响,饲料中α-亚麻酸含量为1.32%~1.33%时,团头鲂幼鱼可以获得较佳的生长速度和饲料效率;饲料中亚油酸含量为2.02%~2.03%时,团头鲂幼鱼可以获得较佳的生长速度和饲料效率。这个结果为团头鲂幼鱼饲料中适宜的α-亚麻酸、亚油酸含量。 2.2 团头鲂幼鱼形体指标与饲料中α-亚麻酸、亚油酸含量的关系
在养殖试验结束后,经测定,得到各组团头鲂幼鱼的肥满度、脏体指数、肝体比数据,见表5。在α-亚麻酸试验中,团头鲂幼鱼的肥满度为2.25%~2.37%,脏体指数为6.11%~7.04%,肝体指数为1.35%~1.41%,其中0.02%组的脏体指数显著低于除1.08%组外的其他各组(P<0.05)。在亚油酸试验中,团头鲂幼鱼的肥满度为2.16%~2.32%,脏体指数为6.25%~6.59%,肝体指数为1.23%~1.43%,其中3.03%组的肝体指数显著低于其他各组(P<0.05)。
在试验结束时,测定各组团头鲂幼鱼血清脂质代谢相关指标的含量,结果见表6。
在α-亚麻酸试验中,团头鲂幼鱼血清总胆固醇、甘油三酯含量均在0.02%组最高,分别达到(8.63±1.64) mmol/L、(2.33±0.48) mmol/L,显著高于0.55%、1.08%组(P<0.05);血清高密度脂蛋白含量随α-亚麻酸含量的升高总体呈现先上升后下降的趋势,在1.60%组获得最高值,显著高 于 0.55%、2.13%组(P<0.05);0.02%组的血清低 密度脂蛋白含量显著高于其他各组(P<0.05)。
在亚油酸试验中,团头鲂幼鱼血清总胆固醇、甘油三酯含量分别在1.29%、0.86%组获得最高值,分别达到(11.12±0.79) mmol/L、(2.30±0.55) mmol/L,并均显著高于1.73%组(P<0.05);血清高密度脂蛋白含量随亚油酸含量的升高总体呈现先上升后下降的趋势,在饲料亚油酸含量为1.29%~2.16%时总体较高,其中1.29%组显著高于0.86%、3.03%组(P<0.05);各组血清低密度脂蛋白含量无显著差异(P>0.05)。
饲料脂肪的营养价值很大程度上取决于脂肪酸的不饱和程度及各种必需脂肪酸的比例。因此,在鱼类脂肪需求的研究中,不但要考虑脂肪的绝对添加量,而且要考虑各种必需脂肪酸的适宜添加量[8]。本试验在相同条件下同时开展团头鲂幼鱼α-亚麻酸、亚油酸需求的养殖试验,饲料系数、特定生长率及鱼体相关健康评价指标值的差异可以反映团头鲂幼鱼对饲料α-亚麻酸、亚油酸的需求差异。
3.1 团头鲂幼鱼对饲料中α-亚麻酸、亚油酸的需要量本试验采用半纯化饲料,依据养殖试验的鱼体生长速度和饲料效率结果,采用特定生长率、饲料系数与饲料中α-亚麻酸、亚油酸含量的回归方程来确定α-亚麻酸、亚油酸的需要量,这是确定养殖鱼类对饲料营养素需要量的规范方法。
依据特定生长率、饲料系数与饲料中α-亚麻酸、亚油酸含量的回归关系,得到团头鲂幼鱼饲料中α-亚麻酸的适宜含量为1.32%~1.33%,亚油酸的适宜含量为2.02%~2.03%。刘玮等[9]、高艳玲等[10]的研究表明,除了HUFA之外,团头鲂的必需脂肪酸还应该同时包括亚油酸和α-亚麻酸,并且团头鲂对亚油酸的需求要比α-亚麻酸更大。本试验结果表明,团头鲂幼鱼对亚油酸的需求高于α-亚麻酸,与上述研究一致。
从获得的特定生长率、饲料系数结果分析,在适宜的饲料α-亚麻酸、亚油酸含量下,养殖团头鲂幼鱼获得的最大特定生长率分别为1.43%/d、1.37%/d,α-亚麻酸组的结果高于亚油酸组结果;而最低的饲料系数分别为1.30、1.42,α-亚麻酸组的结果低于亚油酸组结果。此结果显示,饲料中适宜含量的α-亚麻酸对团头鲂的生长作用优于亚油酸。这一结论与王树森等[11]在中国对虾(Penacus orientalis)上的研究一致。Bautista等[12]的研究也发现,遮目鱼(Chanos chanos Forskal)摄食富含n-3 HUFA的饵料较摄食富含n-6 HUFA时生长快,n-3和n-6这2个系列的HUFA对鱼类的生长作用,前者大于后者。这可能与α-亚麻酸是合成C20 ∶ 5n-3(EPA)、C22 ∶ 6n-3(DHA)的前体有关,n-3 HUFA对机体血脂成分、脂质代谢、免疫功能等方面都具有重要的影响,而亚油酸只能通过去饱和延伸碳链的方式合成花生四烯酸(arachidonic acid,ARA;C20 ∶ 4n-6)。
鱼类对必需脂肪酸的需求在一个适宜的剂量范围,饲料中必需脂肪酸含量过低或过高均可能引起生长抑制、抗病力下降等。这一现象在本试验中有着共性的表现,例如:过低剂量(0.02%)和过高剂量(2.65%)的α-亚麻酸组饲料系数分别为1.38±0.03、1.37±0.03,显著高于1.08%组的1.29±0.02。大量的研究表明,必需脂肪酸缺乏时,鱼体脂质代谢受到影响,脂肪转化受阻,磷脂代谢异常,细胞膜结构和通透性改变,外观上表现为生长受阻、免疫力下降等;而过量的必需脂肪酸同样会抑制鱼类生长,且这种抑制作用在淡水鱼中尤为明显,其双键的易氧化和酸败可能造成损害;此外,饲料中过量的HUFA可引起维生素E短缺,并由此而发生肌肉营养障碍(museular dystrophy,MD)等营养缺乏症[3, 11, 13]。鱼类生长需要必需脂肪酸,但只有适宜的必需脂肪酸含量才能保证鱼类获得较好的生长性能和饲料利用效率。
3.2 饲料中α-亚麻酸、亚油酸含量对团头鲂幼鱼形体及血清脂质代谢相关指标的影响肥满度、脏体指数及肝体比是当前用于评价水产动物形体变化的常用指标。刘猛等[14]通过采集自然水域环境中的健康鱼类来建立相关评价指标,研究指出团头鲂肥满度正常范围为2.05%~2.33%,脏体指数正常范围为6.36%~9.14%,肝体指数正常范围为1.36%~2.16%。对比本试验的结果发现,2个试验的团头鲂幼鱼形体基本正常,但亚油酸较高剂量组(2.59%、3.03%组)肝体指数分别为1.32%、1.23%,表明饲料中过高的亚油酸可能对团头鲂的肝脏代谢产生了一定的干扰。
血清生化指标的变化可以反映鱼体的生理或病理性变化、代谢和营养状况。总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量是临床上用来反映血脂代谢功能的常用指标。血液中,一般甘油三酯含量的升降都伴随着胆固醇含量的升降[15]。高密度脂蛋白由肝脏合成,并释入血液后,可与肝外组织释出的胆固醇及其酯结合,并运回肝脏处理;低密度脂蛋白的主要作用是由肝脏向肝外组织输送内源性胆固醇[16]。
α-亚麻酸可促使肝外组织胆固醇的合成进程加快,同时增加血液高密度脂蛋白含量,加速肝脏对胆固醇的清除与转化速度。此外,α-亚麻酸还可促使肝脏胆固醇合成的关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)活性降低,从而降低肝脏胆固醇的合成量[17, 18]。对亚油酸的研究也表明,其有助于降低血清胆固醇和抑制动脉血栓的形成,在预防动脉粥样硬化和心肌梗塞等心血管疾病方面有良好作用[19]。
本研究结果显示,1.08% α-亚麻酸组和1.73%亚油酸组血清总胆固醇和甘油三酯含量均显著低于对应的低剂量组,而对应的高密度脂蛋白含量则维持在较高水平,说明在适宜的添加量下,α-亚麻酸、亚油酸均具有降血脂的功能。但对比发现,α-亚麻酸组血清胆固醇含量总体低于亚油酸组,表明α-亚麻酸的降血脂功能优于亚油酸,支持饲料中适宜含量的α-亚麻酸对团头鲂的生长作用优于亚油酸的结论。α-亚麻酸试验中,从0.55%组开始,血清低密度脂蛋白含量较0.02%组显著下降,可能与鱼体肝脏自身合成的内源性胆固醇减少有关。亚油酸试验中也可以发现,1.73%组血清低密度脂蛋白含量较低于其余各组,表明饲料中1.73%的亚油酸能有效地降低血清低密度脂蛋白含量,从而降低血脂含量。
4 结 论本试验条件下,综合分析特定生长率、饲料系数、形体指标及血清脂质代谢等评价指标,团头鲂幼鱼获得最佳生长时对饲料α-亚麻酸、亚油酸的需求存在差异:团头鲂幼鱼饲料中α-亚麻酸的适宜含量为1.32%~1.33%,亚油酸的适宜含量为2.02%~2.03%。
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