目前饲料安全等同于食品安全的概念在世界范围内已成为共识。新型、绿色、无公害微生物固体发酵饲料成为未来饲料行业的研究热点和发展方向。目前发酵杂粕和其他发酵原料在猪方面的应用研究报道相对较多，而微生物发酵全价饲料，特别是微生物发酵不含抗生素的全价饲料在仔猪-生长猪-育肥猪全阶段使用的报道很少。因此，本试验在4个不同处理(不含抗生素发酵全价饲料添加量分别为0、10%、20%和30%)对断奶保育阶段仔猪进行饲养试验基础上，挑选了对照组和最佳剂量发酵全价饲料添加组(20%)，剔除少数猪只消除本次试验起始平均头重差异，进一步研究了复合益生菌无抗发酵饲粮与含抗生素饲粮对生长肥育猪(20~110 kg)全阶段生长性能、肠道菌群和消化性能的影响，为研发安全、高效环保无抗发酵饲粮并成熟应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 复合益生菌制剂和无抗发酵饲料

试验用复合益生菌制剂由湖南省微生物研究院研制并提供，活菌数≥2×10⁹ CFU/mL。复合益生菌制剂主要成分为乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌等。无抗发酵饲料的底物为全价生长育肥猪配合粉料，发酵时添加菌液、水和无抗全价饲料的质量百分比例分别为5%、35%和60%。每个星期做1次发酵饲料，发酵时间3~7 d；饲料发酵3 d以上可以使用。饲料接种发酵液菌种混匀后使用带呼吸膜的尼龙袋密封包装，保证发酵的正常进行和饲料不变质。一个批次的发酵饲料一般要求在15 d内用完。 1.2 试验动物和分组

将60头18 kg左右的“杜洛克×长白×大白”杂交保育仔猪随机分成2个组，每组3个重复，每个重复10头仔猪。试验分为对照组和试验组，对照组以猪场饲喂的含抗生素常规饲粮为基础饲粮(每千克含黄霉素5 mg)，试验组以80%不含抗生素的基础饲粮和20%的无抗发酵全价饲料组成试验饲粮。试验于2012年8月18日至2013年1月22日在湖南恒惠农牧有限公司猪场进行。 1.3 基础饲粮

为了试验操作简便起见，兼顾生长猪和育肥猪2阶段的营养需要，采用适中的饲粮组成及营养水平，整个试验期使用同一个基础饲粮，其组成及营养水平见表1。无抗饲料发酵前饲料营养成分检测值为：粗蛋白质16.60%，钙0.58%，总磷0.49%，无机磷0.30%；发酵7 d后饲料营养成分检测值为：粗蛋白质16.70%，钙0.58%，总磷0.50%，无机磷0.36%，乳酸菌2.5×10⁹ CFU/g，枯草芽孢杆菌4.5×10⁶ CFU/g，酵母菌5.5×10⁷ CFU/g。预混料来源于湖南恒惠饲料公司定制产品，对照组预混料中添加抗生素，试验组预混料不添加抗生素，其余与对照组完全一致。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels2) 含量 Content 玉米 Corn 66 粗蛋白质 CP 16.50 豆粕 Soybean meal 24 消化能 DE/(MJ/kg) 3.20 麸皮Wheat bran 6 钙 Ca 0.56 预混料 Premix1) 4 总磷 TP 0.48 合计 Total 100 有效磷 AP 0.21 赖氨酸 Lys 0.80 1)预混料为每千克饲粮提供 Premix provided the following per kg of the diet：Cu 40 mg，Fe 100 mg，Zn 80 mg，Mn 40 mg，I 1 mg，Se 0.3 mg，VA 9 000 IU，VD3 1 200 IU，VE 80 IU，VK 4 mg，VB1 6 mg，VB2 20 mg，烟酸 nicotinic acid 20 mg，泛酸 pantothenic acid 15 mg，生物素 biotin 0.3 mg，胆碱 choline 300 mg。 2)计算值 Calculated value。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

按猪场常规饲养管理程序进行。预试期3 d，进入正试期后各组分别喂相应饲粮。自由采食，自由饮水，按猪场正常程序进行免疫。试验期154 d。 1.5 测定指标 1.5.1 生长性能指标

分别于试验的第1天和最后1天08:00空腹逐栏称重，按照每栏总重和头数计算平均头重，根据平均头重的初重和末重计算平均日增重。每周记录各组的采食量，试验结束后结算各组消耗饲料，计算出平均日采食量(试验组按照饲喂基础量的0.92倍系数换算成与对照组同样的风干型饲粮重量)。根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。 1.5.2 粪样和肠道菌群检测

分别在试验中期和后期采集粪样，在试验结束时每重复选择1头中等体重出栏猪屠宰，屠宰时进行肠道食糜和肠道黏膜取样，取样后用塑料样品袋放置-20 ℃冰箱保存。采用平板稀释方法对样品中的乳酸菌、大肠杆菌和沙门氏菌进行计数。

肠道黏膜取样方法：从每头猪的十二指肠、空肠和盲肠肠段取样5 cm，剪开肠段，用干净玻璃棒将食糜轻柔分离，用蒸馏水轻缓将附着肠壁上残留食糜冲洗2~3次，用手术刀刮取肠道黏膜并在电子分析天平上称重，称量记录该肠段重量，测量剪开肠段宽度，按照长乘以宽公式计算取样肠段面积，便于计算每平方厘米和每克黏膜细菌的含量。

乳酸菌：分别称取一定量样品(粪样和食糜取样5 g左右，肠道黏膜取样1 g左右)，采用1 ∶ 9梯度稀释法，稀释至10^-6梯度，用微量取液器分别吸取10^-6～10^-4梯度稀释液1 mL加入无菌平皿中，再倾注约20 mL冷却至45 ℃的乳酸菌选择性培养基(MRS)，并转动平皿使混合均匀(各稀释度设3个重复)，37 ℃培养48 h后进行菌落计数。以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束需在20 min内完成。

大肠杆菌：用微量取液器分别移取样品按照10^-6～10^-4梯度稀释，稀释液1 mL涂布接种于麦康凯培养基平皿上(各稀释度设3个重复)，置37 ℃培养箱中培养24 h后，选取粉红色或红色，表面光滑、凸起，边缘整齐不透明，质地软，直径1.0～3.0 mm的菌落进行计数，并通过相应生化试验对大肠杆菌进行鉴定。

沙门氏菌：用微量取液器分别吸取不同梯度的样品稀释液1.0 mL于培养血中，与冷却至45 ℃的沙门氏菌-志贺氏菌琼脂培养基(SS)混合，各稀释度3次重复，倾注法进行菌落计数^[1]，37 ℃培养24 h，检测菌体数。 1.5.3 消化指标测定

试验结束前，连续5 d以不完全收粪法采集粪便，每天收粪1次。在猪圈四角和中间5点共采集粪便100 g，加10％ H₂SO₄ 10 mL，搅拌均匀，放置4 ℃冰箱中备用。测定前先将粪样50 ℃烘至半干，粉碎。按4 mol/L盐酸不溶灰分指示剂法测定饲粮的粗蛋白质、干物质、粗纤维、总钙和总磷的表观消化率。酸不溶灰分指示剂法参照《饲料分析及饲料质量检测技术》^[2]。无机磷测定是将饲料样品用盐酸和硝酸处理，使无机磷浸提出来，对滤液用钒钼酸铵试剂显色使用分光光度法测定，可计算出无机磷含量^[3]。 1.6 数据处理

采用SAS 9.0统计软件对数据进行t检验统计分析。 2 结果与分析 2.1 无抗发酵饲料对生长育肥猪生长性能的影响

由表2可见，试验组的末重、平均日增重和平均日采食量都显著高于对照组(P<0.05)，而料重比则显著低于对照组(P<0.05)。与对照组比较，试验组平均日增重提高了10.89%，平均日采食量提高了5.86%，料重比降低了4.38%。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 无抗发酵饲料对生长育肥猪生长性能的影响 Table 2 Effects of fermented feed without antibiotic on growth performance of growing-finishing pigs 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 始重 Initial weight/kg 18.07±0.31 18.17±0.93 0.868 末重 Final weight/kg 101.60±1.39b 110.70±4.51a 0.029 平均日增重 ADG/(kg/d) 0.542±0.008b 0.601±0.024a 0.016 平均日采食量 ADFI/(kg/d) 1.622±0.016b 1.717±0.030a 0.008 料重比 F/G 2.991±0.014a 2.860±0.063b 0.025 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 无抗发酵饲料对生长育肥猪生长性能的影响 Table 2 Effects of fermented feed without antibiotic on growth performance of growing-finishing pigs

由表3可见，2组之间生长肥育猪粪便中期和后期的乳酸菌、大肠杆菌和沙门氏菌数量的对数值差异显著(P<0.05)；其中试验组中期和后期的乳酸菌数量的对数值显著高于对照组(P<0.05)，而试验组中期和后期的大肠杆菌和沙门氏菌数量的对数值显著低于对照组(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 无抗发酵饲料对生长肥育猪粪便中微生物数量的影响 Table 3 Effects of fermented feed without antibiotic on faecal microbial number of growing-finishing pigs lg(CFU/g) 项目 Items 阶段 Period 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 乳酸菌 中期 Mid-period 8.29±0.05b 8.64±0.07a 0.002 Lactobacillus 后期 Late-period 8.34±0.31b 9.07±0.17a 0.023 大肠杆菌 中期 Mid-period 7.37±0.11a 6.36±0.19b 0.001 Escherichia coli 后期 Late-period 7.40±0.11a 6.38±0.11b <0.001 沙门氏菌 中期 Mid-period 6.48±0.06a 5.62±0.10b <0.001 Salmonella 后期 Late-period 6.43±0.10a 4.72±0.09b <0.001

表3 无抗发酵饲料对生长肥育猪粪便中微生物数量的影响 Table 3 Effects of fermented feed without antibiotic on faecal microbial number of growing-finishing pigs

在试验中期阶段，试验组乳酸菌数量为4.44×10⁸ CFU/g，比对照组提高了129.09%；而试验组大肠杆菌和沙门氏菌数量分别为2.41×10⁶和4.22×10⁵ CFU/g，比对照组分别降低了89.96%和 86.05%。在试验后期阶段，试验组乳酸菌数量为 1.24×10⁹ CFU/g，比对照组提高了383.51%；而试验组大肠杆菌和沙门氏菌数量分别为2.47×10⁶和5.31×10⁴ CFU/g，比对照组分别降低了90.25%和98.07%。

由表4可见，在十二指肠肠段，试验组肠道食糜中的乳酸菌和大肠杆菌数量的对数值显著高于对照组(P<0.05)，而2组间沙门氏菌数量的对数值差异不显著(P>0.05)。在空肠肠段，2组间肠道食糜中的乳酸菌、大肠杆菌和沙门氏菌数量的对数值差异均不显著(P>0.05)。在盲肠肠段，2组间肠道食糜中的乳酸菌、大肠杆菌和沙门氏菌数量的对数值差异均不显著(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 无抗发酵饲料对生长育肥猪肠道食糜微生物数量的影响 Table 4 Effects of fermented feed without antibiotic on intestine chyme microbial number of growing-finishing pigs lg(CFU/g) 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 十二指肠 Duodenum 乳酸菌 Lactobacillus 4.38±0.11b 6.81±0.06a <0.001 大肠杆菌 Escherichia coli 4.32±0.14b 4.57±0.05a 0.040 沙门氏菌 Salmonella 2.38±0.20 2.47±0.35 0.700 空肠 Jejunum 乳酸菌 Lactobacillus 4.94±0.03 5.35±0.55 0.260 大肠杆菌 Escherichia coli 3.81±0.04 3.50±0.17 0.400 沙门氏菌 Salmonella 1.77±0.11 1.81±0.05 0.650 盲肠 Cecum 乳酸菌 Lactobacillus 7.54±0.12 7.76±0.08 0.054 大肠杆菌 Escherichia coli 6.23±0.49 6.25±0.48 0.961 沙门氏菌 Salmonella 5.58±0.10 5.40±0.06 0.055

表4 无抗发酵饲料对生长育肥猪肠道食糜微生物数量的影响 Table 4 Effects of fermented feed without antibiotic on intestine chyme microbial number of growing-finishing pigs

由表5可见，在十二指肠肠段，试验组肠道每克和每平方厘米黏膜的乳酸菌数量的对数值显著高于对照组(P<0.05)；试验组肠道每克黏膜的大肠杆菌数量的对数值显著高于对照组(P<0.05)。在空肠肠段，试验组肠道每克和每平方厘米黏膜的乳酸菌数量的对数值显著高于对照组(P<0.05)。除以上5项指标以外，2组间在十二指肠、空肠和盲肠肠段上肠道每克和每平方厘米黏膜的乳酸菌、大肠杆菌和沙门氏菌数量的对数值差异均不显著(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 无抗发酵饲料对生长育肥猪肠道黏膜微生物数量的影响 Table 5 Effects of fermented feed without antibiotic on intestinal mucosa microbial number of growing-finishing pigs 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 十二指肠 Duodenum 乳酸菌 Lactobacillus/[lg(CFU/g)] 3.28±0.14b 3.82±0.08a 0.005 乳酸菌 Lactobacillus/[lg(CFU/cm2)] 2.30±0.11b 2.64±0.03a 0.006 大肠杆菌 Escherichia coli/[lg(CFU/g)] 2.45±0.25b 2.88±0.04a 0.042 大肠杆菌 Escherichia coli/[lg(CFU/cm2)] 1.35±0.13 1.43±0.04 0.400 沙门氏菌 Salmonella/[lg(CFU/g)] 3.57±0.17 3.53±0.04 0.722 沙门氏菌 Salmonella/[lg(CFU/cm2)] 3.17±0.18 3.15±0.06 0.891 空肠 Jejunum 乳酸菌 Lactobacillus/[lg(CFU/g)] 3.32±0.19b 6.60±0.04a <0.001 乳酸菌 Lactobacillus/[lg(CFU/cm2)] 2.44±0.12b 5.80±0.04a <0.001 大肠杆菌 Escherichia coli/[lg(CFU/g)] 3.46±0.28 3.54±0.18 0.694 大肠杆菌 Escherichia coli/[lg(CFU/cm2)] 2.74±0.36 2.69±0.26 0.853 沙门氏菌 Salmonella/[lg(CFU/g)] 1.63±0.07 1.63±0.08 0.977 沙门氏菌 Salmonella/[lg(CFU/cm2)] 0.81±0.06 0.80±0.05 0.980 盲肠 Cecum 乳酸菌 Lactobacillus/[lg(CFU/g)] 5.36±0.16 5.46±0.11 0.430 乳酸菌 Lactobacillus/[lg(CFU/cm2)] 5.27±0.75 5.34±0.60 0.907 大肠杆菌 Escherichia coli/[lg(CFU/g)] 3.54±0.06 3.51±0.06 0.557 大肠杆菌 Escherichia coli/[lg(CFU/cm2)] 2.69±0.03 2.72±0.01 0.214 沙门氏菌 Salmonella/[lg(CFU/g)] 2.33±0.22 2.42±0.20 0.614 沙门氏菌 Salmonella/[lg(CFU/cm2)] 2.31±0.05 2.37±0.05 0.253

表5 无抗发酵饲料对生长育肥猪肠道黏膜微生物数量的影响 Table 5 Effects of fermented feed without antibiotic on intestinal mucosa microbial number of growing-finishing pigs

由表6可见，2组之间饲料的干物质、总钙和总磷的表观消化率差异不显著(P>0.05)， 但是从数值上来看，试验组的干物质、总钙和总磷的表观消化率都要稍微高于对照组。试验组的粗蛋白质和粗纤维的表观消化率显著高于对照组(P<0.05)，比对照组分别提高了4.66%和7.47%。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 无抗发酵饲料对生长肥育猪饲料养分表观消化率的影响 Table 6 Effects of fermented feed without antibiotic on nutrient apparent digestibility of growing-vfinishing pigs % 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 干物质DM 0.827±0.006 0.835±0.008 0.197 粗蛋白质 CP 0.794±0.008b 0.831±0.016a 0.027 粗纤维CF 0.589±0.019b 0.633±0.008a 0.020 总钙 Total calcium 0.620±0.016 0.632±0.013 0.391 总磷 Total phosphorus 0.600±0.023 0.621±0.016 0.266

表6 无抗发酵饲料对生长肥育猪饲料养分表观消化率的影响 Table 6 Effects of fermented feed without antibiotic on nutrient apparent digestibility of growing-vfinishing pigs

本试验中无抗发酵饲料采用的复合微生态制剂由乳酸菌、酿酒酵母菌和枯草芽孢杆菌按照1 ∶ 1 ∶ 1比例组成。该发酵饲料中除了含有一定活菌，还有益生菌代谢产生的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，可以赋予发酵饲料酸香味，改善适口性，促进采食，增加动物的消化能力，提高动物的生长性能^[4]。本试验中，添加20%无抗发酵饲料试验组的平均日增重、平均日采食量、料重比明显优于对照组，与前人的研究报道基本一致^{[5, 6]}。此外还有众多的研究发现益生菌发酵饲料可以通过提高采食量和日增重，降低药费开支来提高育肥猪养殖经济效益，每头出栏育肥猪增加的养殖效益在30~180元之间，说明应用发酵饲料喂育肥猪经济效益比较好，方法可行^{[7, 8, 9, 10, 11]}。 3.2 无抗发酵饲料对生长育肥猪肠道中微生物数量的影响

正常情况下，动物肠道内各种微生物区系之间保持着动态的平衡。动物的健康水平也和动物肠道菌群平衡密切相关。一旦肠道微生态平衡被打破，一些致病菌或者条件致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌等大量增加，排放内毒素和产生其他毒副作用，引起机体消化机能紊乱，导致动物生长性能下降^{[12, 13]}。

本试验结果表明，与对照组相比，添加20%无抗发酵饲料试验组可以显著增加生长育肥阶段中期和后期粪便中的乳酸菌数量，减少粪便中大肠杆菌和沙门氏菌数量。由于研究方法和试验条件的局限性，目前众多的研究者一般都仅仅检测猪粪便的微生物菌群数量变化。由于细菌定植的特殊性，笔者认为排出体外的粪便和体内食糜中多为肠道过路菌，而肠道黏膜上黏附牢固的才是肠道定植菌群的主体，更值得深入研究，但是这方面的检测研究报道较少。因此本试验对十二指肠、空肠和盲肠部位的肠道食糜及肠道黏膜做了对比性检测，具有一定的参考价值。试验结果也表明，在不同的肠段位置和不同的体组成成分中(肠道食糜和肠道黏膜)，其微生物变化规律不尽相同。无抗发酵饲料可以显著增加十二指肠食糜以及肠道黏膜的乳酸菌数量，增加空肠和盲肠的食糜以及黏膜的乳酸菌数量，这个结果和众多学者研究结果基本一致^{[1, 12, 14, 15, 16]}。试验结果表明，每克肠道食糜和肠道黏膜的乳酸菌、大肠杆菌和沙门氏菌数量一般比粪便中的数量低上2~3个数量级。而且在同一肠段对于同一种细菌，如果采用的统计方式不一样，其表现出来的统计规律也不完全一致。比如十二指肠黏膜上的大肠杆菌，如果采用每克十二指肠黏膜所含大肠杆菌数量对数值来统计，结果是试验组显著高于对照组，但是如果采用每平方厘米十二指肠黏膜所含大肠杆菌数量对数值来统计，结果是试验组和对照组差异不显著。造成这种差异的根本原因是进行比较分析的参照系不同(一个是单位重量所含的微生物数量，一个是单位面积内所含的微生物数量)，同时可能与取样手法以及取样的位置一致性有关，特别是取样位置的差异性容易造成试验结果较大的误差。 3.3 无抗发酵饲料对生长育肥猪养分表观消化率的 影响

动物对饲料的消化性能越好，对营养物质的消化吸收利用效率越高，越有利促进生长。本试验结果中，与对照组相比，添加20%无抗发酵饲料试验组的粗蛋白质和粗纤维表观消化率显著提高，总钙和总磷表观消化率也有所提升，说明发酵饲料可以提高育肥猪对营养物质的消化率，这方面研究结果与前人^{[7, 17]}一致。发酵饲料中的益生菌和其产生的消化酶可以将粗蛋白质、碳水化合物分解为小肽、游离氨基酸和小分子营养物质，同时发酵产生有机酸提高动物肠胃消化机能；此外微生物可以使饲料中非蛋白氮转化为菌体蛋白提高氨基酸含量和蛋白质质量^[18]。研究发现饲料经过益生菌发酵后可以将植酸磷转化为动物容易吸收的无机磷，提高动物对磷的利用率^[17]。本试验结果也表明复合益生菌发酵饲料可以提高氮和磷的利用率，减少粪便中氮磷排放，降低生猪排泄物对环境的污染，实现清洁健康养殖。 3.4 黄霉素的抑菌作用和肠道菌群调节作用

黄霉素对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌都有一定抑制生长作用，对大肠杆菌的体外抑制作用不明显^{[19, 20]}。添加黄霉素，可降低仔猪空肠大肠杆菌数量，但对乳酸杆菌和盲肠、直肠大肠杆菌数量无明显影响^[21]。本试验中，黄霉素对生长肥育猪的肠道优势菌群调节效果不如益生菌发酵饲料，在粪便中黄霉素添加组的大肠杆菌和沙门氏菌病源菌的数量显著高于无抗饲料添加组。由于在当前养殖环境下养猪不可避免需要使用抗生素，大部分规模养殖场和养殖户目前还难以做到真正的无抗健康养殖，建议在实际养猪生产中可结合临床上抗生素保健或用药停药一段时间后再使用无抗发酵饲料，发挥其在恢复健康菌群和防止多重感染方面的优势，减少长期使用抗生素带来的耐药性等负面影响。 3.5 3种菌株组合相互代谢关系及其对饲料固态发酵的影响

本研究中复合微生态制剂由3种菌株组成，其中乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌分别为厌氧、好氧、兼性厌氧种类微生物，三者之间生物代谢过程和代谢产物在饲料固态发酵过程中可以起到一定相互促进作用。酵母菌和枯草芽孢杆菌能快速地消耗氧气，产生了少量的酒精和乳酸，同时物料的pH也下降到5.6以下，从而为乳酸杆菌的生长繁殖提供了很好的前提条件。随着乳酸杆菌数量不断增加，物料的pH继续下降，一些大分子物质(如蛋白质、多糖、脂肪等)不断降解，而同时一些有机酸、多肽、抗菌肽和游离氨基酸的数量却在不断增加，饲料营养价值得到了很大提升。复合菌剂生产的发酵饲料能调节肠道微生态平衡，维持肠道正常功能。 4 结 论

综合各项指标来看，在生长肥育猪饲粮中添加20％的无抗发酵饲料，能提高其生长性能，改善肠道微生物平衡，提高对营养物质的消化能力。