乳脂肪是牛奶的主要成分，是衡量牛奶品质的重要指标。乳脂肪也是最容易受到遗传、饲粮和生理等因素的影响而发生改变的乳成分。研究已经证实，乙酸等用于从头合成的乳脂前体物对乳脂肪的合成有直接的影响，饲粮中增加中、短链脂肪酸(short and medium chain fatty acids,SMCFA)的供给可以减少用于从头合成的短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)，提高乳脂肪含量，改变其脂肪酸组成[1]。因此，深入探讨乳脂前体物乙酸对乳脂肪合成的影响机理对改善乳脂肪组成及乳品质有重要意义。乙酸作为奶牛乳腺脂肪酸内源合成的主要前体物，对乳脂肪合成的影响研究在体内有较多的报道，但其影响机制仍然不是十分清楚。Maxin等[2]的体内研究结果表明，瘤胃灌注乙酸组乳脂率增加了6.5%，而且改变了乳脂肪组成，提示乙酸对乳脂肪合成有一定的影响。Purdie等[3]研究表明，奶牛阴外动脉灌注乙酸时，乳脂率有增加的趋势。Storry等[4]体内试验的研究结果表明，瘤胃灌注乙酸增加了乳脂肪中C4 ∶ 0～C16 ∶ 0脂肪酸的量，而降低了所有C18脂肪酸的量。孔庆洋等[5]利用体外法研究了不同浓度的乙酸钠对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)胞外甘油三酯(triacylglycerol,TAG)含量的影响，结果表明，随着乙酸钠浓度的增加，细胞内TAG含量显著增加。Fushimi等[6]研究表明，乙酸可以作为信号分子调控肝细胞内参与脂质代谢基因的表达。然而，Yonezawa等[7]的研究发现，乙酸等SCFA的添加可能抑制乳脂肪的合成，促进BMECs内的β-氧化。Li等[8]在奶牛肝细胞中发现，乙酸可以加快脂质的氧化，减少脂质的合成，从而降低奶牛肝脏中脂肪的含量。脂肪酸的从头合成是通过乙酰辅酶A和丁酰辅酶A由乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase α,ACACA)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)来完成的[9]。ACACA和FASN是奶牛乳腺组织中参与乳脂肪酸从头合成的2种重要基因[10]。硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)是单不饱和脂肪酸合成的主要酶，由于瘤胃氢化作用，乳腺摄取的脂肪酸中只有少量是不饱和脂肪酸。因此，乙酸对BMECs乳脂肪合成的影响可能与乳脂肪合成相关基因ACACA、FASN与SCD的表达量发生改变有关，但目前相关的研究报道很少。鉴于此，本试验主要研究乙酸对BMECs TAG含量以及FASN、ACACA和SCD的表达量的影响，为进一步研究乙酸对乳脂肪合成的影响机理提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器DMEM/FA12培养液(Gibco，美国)、胎牛血清(FBS，Gibco，美国)、无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA，Equitech-Bio，美国)、催乳素(Gibco，美国)、表皮生长因子(Gibco，美国)、胰蛋白酶(Gibco，美国)、胰岛素转铁蛋白(Gibco，美国)、双抗(Gibco，美国)、乙二胺四乙酸(EDTA，Gibco，美国)、氢化可的松(Sigma，美国)、噻唑蓝(MTT，Sigma，美国)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma，美国)、乙酸钠(Sigma，美国)、RNAprep pure Cell/Bacteria Kit[天根生化科技(北京)有限公司]、PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa，日本)和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa，日本)。实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)、酶标仪(Biotek，美国)、倒置显微镜(Olympuse，日本)。
1.2 BMECs的培养采用胶原酶消化法获得BMECs。选取健康的荷斯坦奶牛，取乳腺组织，去除组织外层，剪取若干约1 cm3的组织块，置于预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中。在无菌超净台中将组织块用PBS洗净后，去除组织块表层将其剪成糊状。加入0.5%胶原酶Ⅱ溶液，置于37 ℃ 5% CO2的培养箱中消化1 h，每20 min轻摇离心管。然后用孔径80目的细胞滤网进行过滤，收集细胞滤液，1 500 r/min离心5 min，弃掉上清液，加入含有10% FBS的DMEM/F12细胞培养液，用移液枪吹打均匀，接种在25 cm2培养瓶中，置于37 ℃ 5% CO2的培养箱中培养。当细胞的融合度为80%～90%时，用胰蛋白酶消化处理BMECs并进行传代。本试验采用第3代细胞。
1.3 试验设计将传至第3代的BMECs悬液(1×105个/孔)接种于细胞培养板上，每孔加入含10% FBS的DMEM/F12培养液，于37 ℃ 5% CO2培养箱培养48 h。再将培养48 h的BMECs培养孔随机分配到6组中，每组6个重复，每个重复1个孔。在各组中分别加入含不同浓度乙酸(以乙酸钠的形式添加)的DMEM/F12培养液，培养液中的FBS用1 g/L无脂肪酸的BSA代替，并使反应体系中乙酸的最终浓度分别为0、4、6、8、10、12 mmol/L，其中0 mmol/L为对照组，其余为试验组。置于37 ℃和5% CO2的 培养箱中继续培养48 h。
1.4 测试指标与方法 1.4.1 TAG含量BMECs内TAG的含量测定根据Ramírez-Zacarías等[11]的方法进行，以吸光度值表示其含量。将传至细胞悬浮液(1×105个/孔)接种于24孔培养板，培养48 h后弃掉培养液，用PBS漂洗2次，每孔加入0.2 mL 4%多聚甲醛溶液固定细胞1 h；PBS漂洗2次，用0.5 mL油红O工作液浸染2 h，用PBS漂洗直至干净；培养板置于32 ℃培养箱内将多余的水分蒸发，加入0.3 mL异丙醇萃取，然后将染液用移液枪吸出，用全自动酶标仪于510 nm波长处测吸光度(OD510 nm)。每组3个重复。
1.4.2 BMECs内FASN、ACACA和SCD的表达量BMECs内FASN、ACACA和SCD的表达量采用实时荧光定量PCR法检测。将每孔2.5 mL细胞悬浮液(5×104个/mL)接种于6孔培养板，培养48 h，在每孔加入含有不同浓度乙酸的诱导培养液，继续培养48 h后，提取总RNA。细胞总RNA的提取、反转录和实时荧光定量PCR分别采用RNAprep pure Cell/Bacteria Kit试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒进行操作。引物序列及参数见表1。每组6个重复。试验数据采用2-△△Ct法进行相对定量数据分析。
 | 表1 引物序列及参数 Table 1 Primer sequences and parameters |
试验数据采用SAS 9.0软件的回归统计程序进行，对不同浓度的乙酸处理效应进行一次线性和二次曲线回归分析，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。
2 结 果 2.1 乙酸对BMECs内TAG含量的影响由图1可见，随着乙酸浓度(0~12 mmol/L)的增加，BMECs内TAG的含量逐渐增加。经回归分析发现，培养液乙酸浓度(x，mmol/L)与BMECs内TAG的含量(y，OD510 nm)呈极显著的一元线性正相关,回归方程为：y=0.002 81x+0.096 07，R2=0.986 3(P=0.000)。说明乙酸可促进BMECs内TAG的积累，其中以浓度为8~12 mmol/L的乙酸组TAG含量较高。
 | 图1 乙酸对奶牛乳腺上皮细胞内TAG含量的影响Fig. 1 Effects of acetic acid on TAG content in BMECs |
由表2可见，所有试验组的FASN和ACACA的mRNA相对表达量均高于对照组。经回归分析表明，随着培养液乙酸浓度(x，mmol/L)增加，FASN(y′)和ACACA的mRNA相对表达量(y″)呈极显著的一次线性增加(P=0.000和P=0.000)，回归方程分别为：y′=0.060 12x-1.026 92，R2=0.981 9；y″=0.037 66x-0.984 55，R2=0.971 2。其中，以8~12 mmol/L组FASN和ACACA mRNA相对表达量较高。SCD mRNA相对表达量随着乙酸浓度增加的变化趋势经回归分析表明结果均不显著(P>0.05)，但从数值上看，所有试验组的SCD mRNA相对表达量均高于对照组，其中以4 mmol/L乙酸组的SCD mRNA相对表达量最高。
| 表2 乙酸对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪相关基因mRNA相对表达量的影响 Table 2 Effects of acetic acid on the relative mRNA expression levels of genes involved in milk fat synthesis in BMECs |
乳腺中约50%的脂肪酸来源于乙酸等乳脂前体物在BMECs内的重新合成，主要包括SMCFA(C4 ∶ 0～C14 ∶ 0)及50％的C16 ∶ 0[13]。TAG是乳脂肪的主要成分，可直接反映BMECs内乳脂肪的合成。据报道，在饲粮中增加SMCFA的供给可以减少用于从头合成的SCFA，可提高乳脂肪含量，改变其脂肪酸组成[1]。孔庆洋等[5]在BMECs培养液中分别添加乙酸(0～20 mmol/L)和丁酸(0～1.25 mmol/L)，显著增加了细胞胞外TAG的含量。然而，Kondo等[14]研究结果表明，乙酸可以使小鼠肝脏细胞内TAG含量降低。Yamashita等[15]报道乙酸能够抑制小鼠体脂肪的累积。Yonezawa 等[7]的研究发现，乙酸等SCFA的添加可能抑制 脂肪的合成，促进BMECs内的β-氧化。本试验结果表明，在BMECs培养液中添加不同浓度的乙酸，促进了细胞TAG的积累，尤以8～12 mmol/L更好；提示适宜浓度的乙酸对乳脂肪的合成有促进作用。但本试验的设计中乙酸的最高浓度为12 mmol/L，而高于12 mmol/L的乙酸浓度对乳脂肪的沉积具有什么作用，需要进一步探讨。
3.2 乙酸对BMECs乳脂肪合成的调节作用脂肪酸从头合成是通过乙酰辅酶A和丁酰辅酶A由FASN和ACACA来完成的[9]。FASN和ACACA是奶牛乳腺中参与脂肪酸从头合成的关键酶[10]。ACACA是一种含有生物素的酶，它催化乙酰辅酶A羧合成丙二酸单酰辅酶A，是脂肪酸从头合成的限速酶[16]。短期调控ACACA主要通过磷酸化或脱磷酸作用，长期则通常是由激素、营养素和其他信号分子引起的基因转录和蛋白质水平上的改变。FASN在乳腺中负责饱和脂肪酸(C4 ∶ 0~C16 ∶ 0)的合成，只能在泌乳反刍动物乳腺中合成中链脂肪酸，而且不需要硫酯酶Ⅱ的存在，在反刍动物其他组织和非反刍动物组织中FASN的产物主要是C16 ∶ 0[17]。孔庆洋等[5]在BMECs培养液中添加不同浓度的乙酸钠(0～20 mmol/L)，结果表明，与对照组相比，显著上调了FASN和ACACA的基因表达。本试验结果表明，乙酸浓度在0~12 mmol/L范围内增加，FASN和ACACA mRNA相对表达量随着乙酸浓度的增加呈极显著的一次线性增加。说明乙酸作为乳脂前体物可能在一定程度上能促进FASN和ACACA基因表达，从而促进了TAG的合成，而且主要是促进了从头合成的SMCFA的合成。然而，本试验设计的乙酸添加最高剂量是12 mmol/L，高于该浓度将对乳脂肪合成相关基因的表达有何影响需要进一步探讨。
SCD是单不饱和脂肪酸合成的主要酶，由于瘤胃氢化作用，乳腺摄取的脂肪酸中只有少量是不饱和脂肪酸。SCD位于内质网上，它能在14烷酰辅酶A、16烷酰辅酶A和18烷酰辅酶A的Δ9位上的双键形成，但其主要底物是棕榈酰辅酶A和硬脂酰辅酶A，相对来说十四酰-辅酶A作为底物的活性较[18]。目前，在牛体内发现了2种SCD异构体SCD1和SCD5，SCD1最早是在牛的脂肪组织中被发现，而SCD5几乎只在脑部表达。Bionaz等[9]的研究结果发现，SCD mRNA相对表达量在泌乳阶段上调了40倍。本试验结果表明，尽管试验组的SCD mRNA相对表达量相对于对照组差异不显著，但随着乙酸浓度的增加呈先增加后降低的变化趋势，提示低浓度的乳脂前体物乙酸的添加对单不饱和脂肪酸的合成可能有一定促进作用，高浓度反而有抑制作用，浓度越高，抑制作用越大。目前关于SCFA对SCD基因表达的影响尚未见报道，确切的结果还有待于进一步的探讨。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARGγ)和固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding factor 1,SREBF1)在奶牛乳腺乳脂肪合成中起重要的调节作用。本课题组的前期研究结果表明，乙酸的添加对PPARGγ基因表达具有显著的促进作用，但对其蛋白质表达水平尚未进行研究[19]。Kadegowda等[20]研究指出，PPARG可能调控SREBF1的表达。Ma等[21]利用SREBP-1特异的小干扰RNA的研究发现，FASN、ACACA、SCD1和脂肪酸结合蛋白3(fatty acid-binding protein 3，FABP3)的基因表达受SREBF1的调控。提示SCFA乙酸对乳脂肪酸从头合成的促进作用可能通过对PPARGγ和SREBF1的基因表达进行调控，进而调控其靶基因FASN和ACACA的表达。因此，有必要从PPARG和SREBF1的基因与蛋白质表达的角度进一步探讨关于乙酸等SCFA对乳脂肪合成的影响机制。
4 结 论乙酸对奶牛BMECs内乳脂肪的合成及其乳脂肪合成相关基因FASN和ACACA mRNA的表达量有极显著的提高效果，其中以培养液中8～12 mmol/L的乙酸效果较好。
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