凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)原产于南太平洋沿岸的暖水水域，分类学上隶属节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，对虾属(Penaeus)，具有生长迅速、广盐性、广温性、肉质鲜美、营养需求低等特点^[1]。凡纳滨对虾自1988年引进中国大陆，并于20世纪90年代成功实现了凡纳滨对虾的人工繁育^[2]，现已经得到大面积推广，并成为我国三大对虾的首选养殖品种，也是目前世界上养殖产量最高的对虾品种^{[3, 4]}。鱼粉因其具有均衡的氨基酸、矿物质、维生素及较好的适口性成为水产动物配合饲料的重要组成部分，并且凡纳滨对虾的生长高度依赖于鱼粉^[5]，在世界范围内的水产养殖种类中，对虾养殖消耗的鱼粉量最大，占水产饲料消耗鱼粉量的24%~27%^[6]，但是鱼粉是一种有限资源，从1985年开始鱼粉的产量一直稳定在700万t左右^[7]，因而成为制约水产养殖业可持续发展的重要瓶颈。为了解决鱼粉资源短缺问题，许多研究者寻找合适的原料，如肉骨粉、蝇蛆粉、藻粉、豆粕等，来替代凡纳滨对虾配合饲料中的鱼粉，但当替代鱼粉达到一定水平后，凡纳滨对虾的生长性能及饲料利用就会受到影响^{[8, 9, 10]}，因此寻找一种新的途径来节省鱼粉的使用具有重要意义。

植物精油是由植物中提取的植物次生产物，能够被完全降解，不会给环境和食品安全带来危害^[11]，因其具有抗菌、防腐、杀虫、抗氧化的作用而被广泛应用于食品、制药、卫生、化妆等行业^{[12, 13]}。随着水产养殖的规模化和集约化，水环境日益恶化，水产动物免疫力下降、疾病频发，越来越多的研究人员开始关注植物性产品的功能，在对鲫鱼(Carassius auratus)、军曹鱼(Rachycentron canadum)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、凡纳滨对虾、大菱鲆(Tarphops oligolepis)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)及大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的研究中均表明植物精油产品不仅能够增强水产动物的免疫力，而且对水产动物的肠道菌落结构、肌肉品质有一定影响^{[14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23]}，但缺乏其对鱼粉节省效应的研究。因此，本试验拟以25%的鱼粉含量为对照，同时设22%和19% 2个低鱼粉含量，研究降低鱼粉含量的同时添加植物精油对凡纳滨对虾生长性能、体成分、血清生化指标及肠道超微结构的影响，以期通过添加植物精油来节约凡纳滨对虾养殖中鱼粉的用量。

以鱼粉、豆粕(溶剂浸出法制备)和花生粕为主要蛋白质源，鱼油、豆油和大豆卵磷脂为主要脂肪源，配制出粗蛋白质含量为40%、粗脂肪含量为9%的5种试验饲料(D1～D5，D1为对照)，试验饲料中植物精油的添加量分别为0、0、0.02%、0、0.02%，对应的鱼粉含量依次为25%、22%、22%、19%、19%。植物精油为由百奥明添加剂有限公司提供的PEP-MGE，主要为柑橘油、牛至油等的混合油。试验饲料组成及营养水平见表1，按照配方将各种固态原料混合后过80目筛，维生素和矿物质等微量组分采用逐级扩大法混合，再加入鱼油、豆油和大豆卵磷脂以及水混合均匀，用双螺杆挤条机压制成粒径为1.0和1.5 mm的颗粒饲料，90 ℃烘箱中熟化30 min，自然风干，饲料密封后放入-20 ℃冰箱中保存，测得各试验饲料的必需氨基酸组成见表2。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) % 项目 Items 饲料 Diets D1 D2 D3 D4 D5 鱼粉 Fish meal 25.00 22.00 22.00 19.00 19.00 豆粕 Soybean meal 28.00 31.00 31.00 32.00 32.00 花生粕 Peanut meal 10.38 11.80 11.80 14.88 14.88 磷虾粉 Brewer’s yeast 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 面粉 Flour 22.81 22.81 22.81 22.81 22.81 豆油 Soybean oil 1.42 1.50 1.50 1.59 1.59 鱼油 Fish oil 1.42 1.50 1.50 1.58 1.58 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 维生素预混料 Vitamin premix1) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 矿物质预混料 Mineral premix2) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 赖氨酸 Lys 0.03 0.03 0.06 0.06 蛋氨酸 Met 0.03 0.03 0.06 0.06 植物精油 Plant essential oil 0.02 0.02 纤维素 Cellulose 2.97 1.33 1.31 0.02 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels3) 水分 Moisture 9.04 8.90 9.28 9.25 9.45 粗蛋白质 Crude protein 39.43 39.71 40.12 40.08 39.98 粗脂肪 Crude lipid 8.52 8.55 9.00 8.65 9.09 粗灰分 Ash 10.07 9.70 9.82 9.34 9.60 1)每千克维生素预混料含有One kilogram of vitamin premix contained the following：VA 1 000 000 IU，VD 40 000 IU，VE 20 g，VK3 12 g，VB1 12 g，VB2 10 g，VB6 12 g，VB12 0.02 g，烟酸 nicotinic acid 30 g，泛酸钙 calcium pantothenate 24 g，叶酸 folic acid 2 g，生物素 biotin 0.2 g，肌醇 inositol 40 g。 2)每千克矿物质预混料含有One kilogram of mineral premix contained the following：FeC6H5O7·5H2O 6.86 g，ZnSO4·7H2O 9.28 g，MnSO4·4H2O 6.29 g，CuSO4·5H2O 10.20 g，KIO3(0.99%) 1.70 g，Na2SeO3 (1%) 0.50 g，C10H22N2O4S2Co (10%) 5 g，MgSO4·7H2O 614.49 g，KCl 191.62 g，NaCl 76.69 g，C6H10CaO6·5H2O 77.83 g。 3)营养水平为实测值。Nutrient levels were measured values.

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 试验饲料的必需氨基酸组成Table 2 Essential amino acid composition of experimental diets % 项目 Items 饲料 Diets D1 D2 D3 D4 D5 赖氨酸 Lys 2.29 2.33 2.24 2.26 2.31 苏氨酸 Thr 1.31 1.28 1.22 1.26 1.29 蛋氨酸 Met 0.67 0.72 0.69 0.63 0.66 异亮氨酸 ILe 1.40 1.45 1.43 1.39 1.35 亮氨酸 Leu 2.59 2.63 2.65 2.55 2.65 苯丙氨酸 Phe 1.29 1.26 1.35 1.32 1.28 组氨酸 His 0.91 0.89 0.95 0.99 0.97 精氨酸 Arg 2.19 2.25 2.20 2.18 2.22 缬氨酸 Val 1.71 1.73 1.76 1.69 1.66

表2 试验饲料的必需氨基酸组成Table 2 Essential amino acid composition of experimental diets

养殖试验于广东恒兴饲料集团东海岛试验基地进行，虾苗来源于恒兴虾苗场孵化的进口1代苗。正式试验前先将所需虾苗暂养于室外水泥池(2 m×2 m×1 m)中，待虾苗长至接近试验规格时，将其转入正式试验的室内养殖系统(300 L水体的圆桶形玻璃钢桶)中继续暂养2周。暂养期间幼虾根据虾苗规格先后投喂丰年虫、虾片、恒兴牌凡纳滨对虾开口料及0号料；试验分组前24 h虾苗停止喂食，挑选体质健壮、规格基本一致、初重为(0.33±0.01) g的凡纳滨对虾750尾，随机分为5组(每组5个重复，每个重复30尾)，分别饲喂1种试验饲料，试验期为8周。试验期间每天于07:00、11:00、17:00和21:00各投喂1次，投喂1 h后观察对虾摄食情况，并根据摄食情况适当调整投喂量。试验用水为经砂滤、沉淀后的海水，连续充气，每天记录水温，每周测定盐度、溶解氧浓度及pH。试验期间水温为(26.7±1.3) ℃，水体pH为7.7±0.1，盐度为(19.4±1.7)‰，溶解氧浓度>6.0 mg/L，氨氮浓度≤0.05 mg/L。

试验结束后饥饿24 h，称重并记录存活尾数，计算生长性能指标。

每桶随机取6尾对虾，保存于-20 ℃冰箱，用于体成分分析；每桶另随机取10尾对虾，单独称体重后，于第5步足基部血窦取血，盛于1.5 mL离心管中，混合后于4 ℃冰箱放置过夜后，5 000 r/min离心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱备用。取每桶取血后的3尾对虾剥离肝胰腺并称重、记录数据，然后取其平均值，作为该桶对虾的肝体比；剩余部分取肌肉，保存于-20 ℃冰箱；另取一部分对虾的肠道进行扫描电镜观察。

饲料、全虾及肌肉样品中的水分含量采用105 ℃常压干燥法测定，粗蛋白质含量采用微量凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，粗灰分含量采用550 ℃马弗炉灼烧法测定；血清生化指标在OLYMPU-SAU600型全自动生化分析仪(日本)上测定。

增重率(WGR，%)=100×(终末体重-初始体重)/初始体重；

特定生长率(SGR，%/d)=100×(ln终末均重-ln初始均重)/试验天数；

成活率(SR，%)=100×试验结束时虾尾数/试验开始时虾尾数；

蛋白质效率(PER)=(终末体重-初始体重)/(摄食量×饲料粗蛋白质含量)；

饲料效率(FE)=(终末虾总重+死虾总重-初始虾总重)/(投饲总量×饲料干物质含量)；

肝体比(HSI,%)=100×肝胰腺重/体重。

试验数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并结合Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05表示组间差异显著。

由表3可知，同一鱼粉含量下，添加植物精油的组的WGR、SGR和PER均显著高于未添加植物精油的组(P＜0.05)，但上述4组均显著低于对照组(P＜0.05)；同一鱼粉含量下，添加植物精油的组的FE均高于未添加植物精油的组(P＞0.05)，且与对照组无显著差异(P＞0.05)，未添加植物精油的组均显著低于对照组(P＜0.05)；各组凡纳滨对虾的SR和HSI无显著差异(P＞0.05)，且SR均在96%以上。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料中添加植物精油对凡纳滨对虾生长性能的影响Table 3 Effects of dietary plant essential oil on growth performance of Litopenaeus vannamei 项目 Items 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 终末体重FBW/g 15.36±1.42c 12.31±2.29a 13.70±2.23b 12.24±2.12a 13.45±1.78b 增重率 WGR/% 4 508.72±425.66c 3 592.22±685.77a 4 010.76±666.93b 3 570.90±636.15a 3 936.68±533.50b 特定生长率 SGR/(%/d) 6.83±0.18c 6.42±0.32a 6.62±0.29b 6.41±0.30a 6.59±0.23b 蛋白质效率 PER 2.52±0.27c 2.04±0.37a 2.17±0.35b 1.96±0.28a 2.17±0.25b 成活率 SR/% 98.66±2.99 98.67±1.82 98.67±1.82 98.00±2.98 96.67±2.36 饲料效率 FE 1.00±0.11b 0.81±0.14a 0.87±0.14ab 0.79±0.11a 0.87±0.10ab 肝体比 HSI/% 5.23±0.75 5.03±1.09 4.98±0.34 5.06±0.99 4.99±0.60 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。下表同。 In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P＜0.01). The same as below.

表3 饲料中添加植物精油对凡纳滨对虾生长性能的影响Table 3 Effects of dietary plant essential oil on growth performance of Litopenaeus vannamei

由表4可知，各组凡纳滨对虾全虾和肌肉营养成分均无显著差异(P＞0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料中添加植物精油对凡纳滨对虾全虾及肌肉营养成分的影响Table 4 Effects of dietary plant essential oil on whole body and muscle nutritional components of Litopenaeus vannamei % 项目 Items 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 全虾 Whole shrimp 水分 Moisture 76.92±0.56 77.17±1.17 76.89±1.33 77.41±2.46 77.22±0.46 粗蛋白质 Crude protein 71.36±1.69 72.03±1.55 70.83±2.71 72.56±1.27 71.46±1.07 粗脂肪 Crude lipid 9.72±2.07 7.91±1.86 8.45±3.46 8.92±4.11 8.96±0.91 粗灰分 Ash 13.03±0.73 13.25±0.79 13.01±0.99 13.02±1.09 13.60±0.73 肌肉 Muscle 水分 Moisture 76.99±0.46 77.74±0.92 77.44±0.43 77.18±1.27 78.84±3.35 粗蛋白质 Crude protein 83.74±1.61 85.03±1.93 85.31±1.12 84.86±1.56 85.58±0.61 粗脂肪 Crude lipid 6.62±1.12 5.82±1.31 6.01±0.59 5.61±1.45 5.35±1.32 粗灰分 Ash 7.22±0.46 7.09±0.57 7.20±0.27 7.10±0.33 7.12±0.22

表4 饲料中添加植物精油对凡纳滨对虾全虾及肌肉营养成分的影响Table 4 Effects of dietary plant essential oil on whole body and muscle nutritional components of Litopenaeus vannamei

由表5可知，各组凡纳滨对虾血清生化指标 均无显差异(P＞0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲料中添加植物精油对凡纳滨对虾血清生化指标的影响Table 5 Effects of dietary plant essential oil on serum biochemical indiexes of Litopenaeus vannamei 项目 Items 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 总蛋白 TP/(g/L) 85.42±5.36 87.08±14.78 73.88±8.18 85.76±6.51 86.24±7.84 葡萄糖 Glu/(mmol/L) 1.40±0.66 0.86±0.19 0.99±0.36 0.80±0.36 0.91±0.28 甘油三酯 TG/(mmol/L) 1.15±0.33 0.70±0.10 0.82±0.42 0.67±0.25 0.96±0.30 总胆固醇 TC/(mmol/L) 1.63±0.58 0.77±0.29 0.75±0.48 0.79±0.56 0.88±0.44 天冬氨酸转氨酶 AST/(U/L) 322.2±81.2 270.0±59.2 290.0±87.6 295.0±39.5 256.8±72.1 丙氨酸转氨酶 ALT/(U/L) 342.2±61.2 269.6±81.3 260.2±49.7 290.2±170.2 328.4±142.6 碱性磷酸酶 AKP/(U/L) 28.8±9.3 22.4±8.3 14.4±9.4 19.4±10.9 30.0±17.2 乳酸脱氢酶 LDH/(U/L) 210.2±120.9 125.2±33.2 178.4±33.4 214.4±120.9 91.8±50.7

表5 饲料中添加植物精油对凡纳滨对虾血清生化指标的影响Table 5 Effects of dietary plant essential oil on serum biochemical indiexes of Litopenaeus vannamei

由图1可以看出，当饲料中鱼粉含量降低时，添加植物精油能够改善凡纳滨对虾肠道绒毛脱落的状况。

图1(Figure 1)

图1 各组凡纳滨对虾的中肠超微结构(透射电镜，8 900倍)Fig. 1 Ultrastructure of midgut of Litopenaeus vannamei in groups (TEM,8 900 times)

植物精油因其特有的性质而被广泛利用，目前已知的大约有3 000种，其中300种在制药、农业、食品、化妆品、香水、厕所清洁行业具有重要的商业用途^[13]，许多研究者正试图发现植物精油的功能与其组分之间的关联，以便加以利用^{[24, 25, 26]}。近年来，科学家发现精油对动物的消化系统具有促进作用^{[27, 28]}，但没有试验证明植物精油能够提高凡纳滨对虾的生长性能。本研究发现，降低饲料中鱼粉含量后，未添加植物精油的组凡纳滨对虾的生长性能变差，添加植物精油的组凡纳滨对虾的生长性能得到提高，其FE甚至达到对照组水平。本研究中，随着饲料中鱼粉含量的降低，豆粕和花生粕的含量均上升，刘立鹤等^[29]研究发现饲料中花生粕的含量在20%以下时对凡纳滨对虾的生长性能没有显著影响，而另有研究表明豆粕中较高的抗营养因子不仅会降低水产动物的增重率和饲料利用率^{[30, 31, 32, 33]}，还会引起肠道菌落结构的改变^{[34, 35]}。本试验中每种饲料中花生粕的含量均低于20%，这可能暗示着饲料中过多的豆粕会引起肠炎，从而导致肠道结构病理性变化。

Brunet等^[36]认为甲壳动物的消化道根据重要性可以分为前肠、中肠、后肠3个部分，其中前肠和尾肠的内表层被壳丁质覆盖，在消化过程中不起重要作用，并且肠道微绒毛与肠道结构之间关系复杂，对营养吸收也具有重要作用^[37]。本研究中发现，随着饲料中添加植物精油，凡纳滨对虾肠道绒毛脱落状况得到改善，且同一鱼粉含量下，添加植物精油的组凡纳滨对虾的生长性能要优于未添加植物精油的组。植物精油之所以能够改善肠道绒毛脱落状况，可能是因为其能够有效抑制凡纳滨对虾肠道有害细菌生长，调节菌落的平衡，提高营养吸收效率。研究表明，植物精油对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等均具有一定杀菌活性^{[38, 39, 40, 41]}。Yeh等^[22]发现，牛樟提取物能够有效抑制病原菌，并增强凡纳滨对虾自身免疫力和抗病 力。Giannenas等^[21]发现，与对照组相比，饲料中 添加香芹酚或麝香草酚能够提高虹鳟的饲料利用效率，并减少其肠道内的厌氧细菌的数量。目前植物精油的抗菌机制仍未确定，主要有3种解释：一是作为典型的亲脂性物质，能够穿过细菌细胞壁及细胞膜并损坏其结构，进而引起细菌内部大分子的泄露，致使细菌溶解；二是影响脂质层稳定，溶解胞体中的脂肪体；三是影响能量代谢及还原酶系^{[42, 43, 44, 45, 46, 26]}。 3.2 饲料中植物精油对凡纳滨对虾血清生化指标的 影响

动物处于正常生理状态下，机体能够维持各项生理指标的动态稳定，而血液组成的变化在一定程度上能够反映出动物此时的健康状态^[47]，其中胆固醇和甘油三酯是血脂的重要组成部分，且都主要在肝脏中合成，因此血清胆固醇和甘油三酯含量的变化在一定程度上能够反映肝脏的某些生理功能是否正常。血糖是动物重要的能量来源，并且可以作为物理胁迫因子的指标^[48]。本研究发现，各组凡纳滨对虾的血清胆固醇、甘油三酯、葡萄糖和总蛋白含量均无显著差异，表明饲料中添加植物精油不会破坏凡纳滨对虾的正常生理状态。谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性是反映肝脏损伤程度的指标，是机体代谢必不可少的酶类，在平衡机体氨基酸“池”以及蛋白质、脂肪与糖之间物质转化中发挥非常重要的作用^[49]，血清中ALT和AST活性的高低在一定程度上可以反映肝细胞损伤的程度^[50]；碱性磷酸酶(AKP)是一种膜结合蛋白，与甲壳动物海水中磷质与钙质的吸取、磷酸钙的生成、甲壳素的形成和分泌直接相关，并且能够与其他水解酶类构成解毒体系，在甲壳动物非特异免疫中发挥着重要作用^[51]，并且还可以通过测定血淋巴中的AKP活性的高低来判断对虾非特异免疫机能的强弱^[52]；乳酸脱氢酶(LDH)广泛存在于动物机体组织中，当组织细胞坏死时，该酶在血清中增加，是水生动物重要的同工酶之一^[53]。本研究发现，各组凡纳滨对虾的血清AST、ALT、AKP和LDH活性均无显著差异，表明饲料中添加植物精油不会对凡纳滨对虾的非特异性免疫及正常生理状态造成不良影响。

在降低鱼粉含量的情况下，饲料中添加0.02%的植物精油能够改善凡纳滨对虾生长性能及肠道健康。