动物营养学报  2015, Vol. 27 Issue (4): 1172-1177   PDF (1347 KB)    
共轭亚油酸和α-亚麻酸对HepG2细胞核转录因子NF-E2相关因子及谷胱甘肽硫转移酶A1 表达的影响
李广亮, 张秀英 , 齐悦, 郝丽红, 张金铭    
东北农业大学动物医学学院, 哈尔滨 150030
摘要:本试验旨在研究共轭亚油酸(CLA)和α-亚麻酸(ALA)对于HepG2细胞核转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)及其调控的谷胱甘肽硫转移酶A1(GSTA1)mRNA和蛋白质表达的影响。试验组采用浓度为0.2、0.5和1.0 mmol/L的CLA和ALA作用HepG2细胞24 h,采用荧光定量PCR法测定mRNA的表达量,蛋白质印迹法测定蛋白质的表达量。结果表明,CLA浓度分别为0.2和0.5 mmol/L时,Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白质表达量与对照组相比极显著增加(P<0.01),并随CLA浓度增加呈下降趋势;采用ALA作用的细胞,Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白质表达量与对照组相比,随ALA浓度的增加呈现极显著上升(P<0.01)。由此可见,CLA在较低浓度时,诱导Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白质表达量作用较强,而随ALA浓度增加Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白质的表达量逐渐增多。
关键词共轭亚油酸     α-亚麻酸     HepG2细胞     Nrf2     GSTA1    
Effects of CLA and ALA on Genes and Protein Expressions of Nuclear Transcription Factor Nrf2 and GSTA1 in HepG2 Cell
LI Guangliang, ZHANG Xiuying , QI Yue, HAO Lihong, ZHANG Jinming    
College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: The purpose of the study was to explore the effects of conjugated linoleic acid (CLA)and α-linolenic acid (ALA)on mRNA and protein expression of nuclear transcription factor nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and glutathione S-transferase A1 (GSTA1) in HepG2 cells. The experiment groups were used 0.2, 0.5 and 1.0 mmol/L CLA and ALA treated HepG2 cells for 24 h, the mRNA expression levels were quantified by quantitative reverse transcription PCR analysis, and the protein expression levels were detected by western blotting method. The results showed as follows: compared with the control group, the mRNA and protein expressions of Nrf2 and GSTA1 were significantly incresed in cells treated with CLA with the concentration of 0.2 and 0.5 mmol/L (P<0.01), and with the CLA concentration increased, the mRNA and protein expressions of Nrf2 and GSTA1 were decreased. However, when HepG2 cells were treated with ALA, the mRNA and protein expressions of Nrf2 and GSTA1 were significantly increased with the ALA concentration increased of compared to control group (P<0.01). In conclusion, CLA with a relatively lower concentration elevates the mRNA and protein expressions of Nrf2 and GSTA1, on the contrary, the mRNA and protein expressions of Nrf2 and GSTA1 are increase gradually with the CLA concentration increased.
Key words: conjugated linoleic acid     α-linolenic acid     HepG 2 cell     nuclear factor erythroid 2-related factor 2     glutathione S-transferase A1    

共轭亚油酸(CLA)和α-亚麻酸(ALA)分别是多不饱和脂肪酸(PUFA)中n-6家族和n-3家族的重要代表,是人和动物不可或缺的营养物质,在食品和饲料中保持适量的CLA和ALA能够有效预防和抑制代谢综合征及其引发的多种疾病[1, 2, 3]。核转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)是可诱导多种解毒酶、生物转化酶和异生物质转运蛋白的关键核转录因子[4, 5],谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是Nrf2信号通路下游的靶基因,其中谷胱甘肽硫转移酶A1(GSTA1)是Ⅱ相代谢酶GSTs酶系重要亚型,占胞液总GSTs的65%~75%,是细胞防御系统重要的组成部分。因此研究CLA和ALA与Nrf2和GSTA1的相关性具有重要意义[6]。研究证明,Nrf2具有抗氧化和抗炎症等功能,被认为是能够治疗多种代谢综合征引起的疾病的潜在药物作用靶点[7],而在鸡和家兔的饲料中添加2种脂肪酸均发现会提高鸡蛋和家兔肝脏中Nrf2的表达量[8, 9]。但对于不同浓度的CLA和ALA作用HepG2细胞时,对Nrf2-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)信号通路以及GSTA1表达量的影响,鲜有详细报道。鉴于此,本文旨在探讨CLA和ALA以不同的浓度作用HepG2细胞24 h时,对HepG2细胞中Nrf2和GSTA1的mRNA以及蛋白质表达量的影响。

1 材料与方法 1.1 试验材料

HepG2细胞由哈尔滨医科大学药理学实验室赠送;DMEM培养基购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司;CLA和ALA购自Sigma公司;RT-PCR试剂盒购自全式金生物技术有限公司;Trizol购自Invitrogen公司;人源细胞Nrf2抗体购自Immunoway公司;GSTA1抗体购自武汉三鹰公司;辣根过氧化物标记羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和RIPA裂解液均购自碧云天生物技术研究所。

1.2 试验方法 1.2.1 细胞培养和试验设计

HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于25 mL培养瓶,5% CO2、37 ℃条件下培养。使用0.25%的胰蛋白酶消化,将对数生长期细胞接种于六孔板,待细胞生长稳定、细胞融合率达到80%以上时,将皂化后的CLA和ALA加入培养基至所需浓度。分别添加0.2、0.5和1.0 mmol/L CLA,0.2、0.5和1.0 mmol/L ALA,作用24 h,每个处理6个重复,并设空白对照组。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)试验

将细胞接种于96孔板,待其长成单层后弃掉原有培养液,加入稀释后的CLA和ALA培养液,浓度梯度分别是0、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0和5.0 mmol/L。每梯度平行接种12个孔,同时设对照孔。每孔加入100 μL培养基,培养24 h,加入10 μL的MTT,培养4 h,加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解紫色结晶,酶标仪检测,计算细胞成活率。

细胞成活率(%)=100×样品孔吸光度值/

对照孔吸光度值。

1.2.3 总RNA提取和RT-PCR检测Nrf2和GSTA1的mRNA表达量

用TRIzol(Invitrogen)法提取HepG2细胞中总RNA,立刻使用反转录试剂盒(全式金生物技术有限公司)反转录成cDNA。使用荧光定量PCR仪(ABI 7500 RT-PCR SDS system)定量。通过SYBR Green荧光定量染料法,反应条件设置为94 ℃预变性30 s,94 ℃变性5 s,60 ℃退火34 s,循环次数40次。使用引物如下,Nrf2的上游引物:5’-TTCCCGGTCACATCGAGAG-3’,下游引物:5’-TCCTGTTGCATACCGTCTAAATC-3’;GSTA1的上游引物:5’-GGGAAAGACATAAAGGAGAGAG-3’,下游引物:5’-TCAAAGGCAGGGAAGTAGC-3’;β-肌动蛋白(β-actin)的上游引物:5’-GATCCACATCAGCTGGGAAGG-3’,下游引物:5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’。

1.2.4 蛋白质的提取以及蛋白质印迹法(Western blotting)检测Nrf2和GSTA1的蛋白质表达量

采用RIPA裂解法,提取细胞总蛋白。将弃掉培养液的细胞,用灭菌处理的冰PBS冲洗1~2次,加入80 μL RIPA裂解液(碧云天试剂公司)用细胞刮刀刮取细胞,并吸取进离心管中,14 000×g离心30 min,吸取上层清液备用,以上提取蛋白质操作都在冰上操作,以防止在提取过程中蛋白质降解,通过紫外分光光度法和BCA法测定蛋白质浓度。将蛋白质样品稀释至相同且合适的浓度进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳(电泳时间:100 V、2 h;100 V、40 min)。湿转至硝酸纤维素(NC)膜(转膜时间:100 V、2 h),用三乙醇胺缓冲盐(TBST)溶液稀释的终浓度为5%的脱脂乳封闭1 h,用兔抗人Nrf2抗体(1 ∶ 1 000)孵育4 ℃过夜。然后用羊抗兔二抗室温封闭1 h,采用电化学发光检测法(ECL法)显色。同一样本用β-actin作为内参。结果用Image J凝胶分析软件进行吸光度值分析。每个结果至少经过3次重复试验得到。

1.3 数据分析

试验数据用平均值±标准差表示,用SPSS 19.0统计软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结 果 2.1 不同浓度的CLA和ALA对HepG2细胞成活率的影响

由表1可知,不同浓度的CLA和ALA对HepG2细胞成活率的影响,与对照组相比,CLA和ALA低浓度时对细胞成活率无显著影响(P>0.05),当CLA和ALA的浓度为3.0和5.0 mmol/L时,极显著降低HepG2细胞的成活率(P<0.01)。本试验所使用的浓度对细胞成活率没有显著影响(P>0.05)。

表1 不同浓度的CLA和ALA对HepG2细胞成活率的影响Table 1 Effects of different CLA and ALA concentrations on survival percentage of HepG2 cells
2.2 不同浓度的CLA和ALA对Nrf2 mRNA表达量的影响

由图1可知,与对照组相比,CLA浓度为0.2和0.5 mmol/L时,Nrf2 mRNA的表达量分别提高4.53倍和3.39倍,差异极显著(P<0.01);CLA浓度为1.0 mmol/L时,Nrf2 mRNA的表达量与对照组相比提高1.67倍,差异显著(P<0.05)。与对照组相比,ALA浓度为0.2 mmol/L时,Nrf2 mRNA表达量变化不显著(P>0.05);ALA浓度为0.5和1.0 mmol/L时,Nrf2 mRNA表达量分别提高2.65倍和8.44倍,差异极显著(P<0.01)。

图1 不同浓度的CLA和ALA对Nrf2 mRNA表达量的影响Fig. 1 Effects of different CLA and ALA concentrations on expression of Nrf2 mRNA
2.3 不同浓度的CLA和ALA对GSTA1 mRNA表达量的影响

由图2可知,与对照组相比,CLA浓度为0.5和1.0 mmol/L时,GSTA1 mRNA表达量分别提高4.39倍和3.35倍,差异极显著(P<0.01);CLA浓度为0.2 mmol/L时,GSTA1 mRNA表达量与对照组相比提高1.61倍,差异显著(P<0.05)。与对照组相比,ALA浓度为0.2 mmol/L时,GSTA1 mRNA变化不显著(P>0.05),ALA浓度为0.5和1.0 mmol/L时,GSTA1 mRNA表达量分别提高3.00倍和4.59倍,差异极显著(P<0.01)。

图2 不同浓度CLA和ALA对GSTA1 mRNA表达量的影响Fig. 2 Effects of different CLA and ALA concentrations on expression of GSTA1 mRNA
2.4 不同浓度的CLA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响

由图3可知,与对照组相比,CLA浓度为0.2和0.5 mmol/L时,Nrf2蛋白质表达量提高1.85倍和1.91倍,差异极显著(P<0.01);CLA浓度为1.0 mmol/L时,Nrf2蛋白质表达量提高1.27倍,差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,CLA浓度为0.2和0.5 mmol/L时,GSTA1蛋白质表达量分别提高1.93倍和2.05倍,差异极显著(P<0.01);CLA浓度为1.0 mmol/L时,GSTA1蛋白质表达量提高1.53倍,差异显著(P<0.05)。

图3 不同浓度的CLA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响Fig. 3 Effects of different CLA concentrations on protein expression of Nrf2 and GSTA1
2.5 不同浓度的ALA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响

由图4可知,与对照组相比,ALA浓度为0.2 mmol/L时,Nrf2蛋白质表达量提高1.35倍,差异显著(P<0.05);ALA浓度为0.5和1.0 mmol/L时,Nrf2蛋白质表达量分别提高1.77倍和1.94倍,差异极显著(P<0.01)。与对照组相比,当ALA浓度分别为0.2、0.5和1.0 mmol/L时,GSTA1蛋白质表达量分别提高了1.75倍、2.28倍和2.86倍,差异极显著(P<0.01)。


图4 不同浓度的ALA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响Fig. 4 Effects of different ALA concentrations on protein expression of Nrf2 and GSTA1
3 讨 论

基因和环境因素是影响人和动物的健康和疾病的关键因素,营养物质是环境因素中重要的组成部分,而且其变化会影响人和动物的健康和疾病[10, 11]。CLA和ALA是机体所必需的重要营养物质,2种不饱和脂肪酸对于维持人和动物的健康具有重要作用。目前,对于CLA和ALA的研究,大多数是进行体内试验,研究集中在摄入食物时的比例和血液中的含量等方面,而在细胞水平上,CLA和ALA对细胞状态的影响和对细胞内关键信号通路的影响鲜有研究[1, 9, 12]

GSTA1具有降解多种有毒化学物质和调节体内氧化平衡的作用,也是Nrf2-Keap1信号通路调控的下游靶基因之一[6],Nrf2是信号通路的关键核转录因子,提高Nrf2的表达量对于机体具有保护作用,可治疗和预防人和动物的代谢综合征和脂肪肝等多种疾病,适量的摄入CLA和ALA,对于保证人和动物的健康至关重要[12, 14]。本试验结果表明,不同浓度的CLA和ALA均不同程度上提高了Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质的表达量,但提高的量不同。Selene等报道[14],0.4 mmol/L ALA可通过提高HepG2细胞中Nrf2 mRNA和蛋白质表达量,由此减轻砷引起的细胞损害;还有研究证明,在饲料中添加ALA可增加家兔脑内Nrf2的蛋白质表达量,调节脑内的氧化还原状态,缓解脑退行性变等多种脑内疾病[15];并且在威斯塔鼠饲料中添加CLA,同样会增加Nrf2蛋白质的表达量[11],这与本试验结果可相互印证。在本试验选择的浓度范围内,ALA的浓度越大,Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质表达量提高的越多;而CLA则是在浓度为0.5 mmol/L时,诱导Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质表达的作用最强,而CLA浓度为1.0 mmol/L时,提高Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质的表达量相对减少。ALA和CLA都能增强Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质表达量,而不同的浓度增强的幅度变化较大。CLA和ALA作为必需脂肪酸,摄入的多少对于机体的健康非常重要。CLA和ALA在体内含量不同时,引起相应的生物学特征改变的具体机制仍需进一步研究。

4 结 论

CLA在较低浓度时,诱导Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白质表达量作用较强,而随ALA浓度增加Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白质的表达量逐渐增多。

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