2. 重庆市畜牧科学院, 重庆 402460
, WANG Xuetao1, TANG Jiayong1, TANG Xiaopeng1, JIA Gang1, LIU Guangmang1, CHEN Xiaolin1, LONG Dingbiao2, WANG Kangning1
2. Chongqing Academy of Animal Science, Chongqing 402460, China
我国是甘薯生产大国，种植面积大，总产量高，分别占到全世界的70%和85%左右，年产量高达1.2亿t[1]。甘薯渣是甘薯加工中提取淀粉后的副产品，每年我国都有大量的甘薯渣产生，有资料显示，一个甘薯淀粉生产加工企业，每年产淀粉3 000 t，那么每年将会产生甘薯渣4 000 t以上。甘薯渣纤维素含量高，蛋白质含量低，同时水分含量很高，不易储存，并且极易受微生物污染而腐败变质，因此限制了其利用，通常是直接作为农家饲料加以简单利用或被当作废弃物丢弃。随着我国饲料资源的日益匮乏，人们开始关注甘薯渣的开发利用，以农副产品废弃物为原料，利用微生物固态发酵(solid-state fermentation,SSF)生产生物饲料逐渐受到人们的重视。目前我国对甘薯渣开发利用较多的是利用其发酵生产酒精、膳食纤维、果胶、柠檬酸、多聚γ-谷氨酸等[2, 3]。国外对甘薯渣的应用主要是用于生产不饱和脂肪酸以及用单菌或混菌固态发酵甘薯渣富集蛋白质等[4, 5]。有关甘薯渣固态发酵开发新饲料资源的研究报道较少，若通过菌种的筛选及复配，探讨甘薯渣的最佳发酵工艺参数，可望有效提高甘薯渣营养价值，开拓新的饲料资源。在此本研究拟以曲霉类、木霉类、芽孢杆菌类、酵母类4类共12种菌株对甘薯渣进行单菌发酵，从中筛选1株发酵效果好的菌株作为混菌发酵的主菌种，与其他3类筛选出的菌株进行复配，筛选最佳菌种组合，采用正交试验设计，对发酵时间、发酵温度、料水比、接种量及菌种复配比例等条件进行优化，筛选出适合甘薯渣发酵的工艺参数。研究结果可望为甘薯渣等低品质的非常规饲料原料的开发与利用提供有益参考。
1 材料与方法 1.1 菌种与培养基发酵菌种：本试验所用菌种均为购买或获赠于其他实验室，共12株，包含曲霉菌3株，木霉菌2株，枯草芽孢杆菌4株，酵母菌3株。菌种保存在4 ℃冰箱，每3个月活化1次。
发酵培养基：甘薯渣和菜籽粕按9 ∶ 1混匀，30 g装入250 mL广口瓶，121 ℃灭菌20 min。木薯渣购于绵阳一淀粉加工厂，为提取淀粉后的残渣，粗蛋白质含量为1.76%，粗纤维含量为8.80%；菜籽粕购于四川省雅安市农牧市场，粗蛋白质含量为36.93%，粗纤维含量为12.27%。
1.2 最适单菌种的筛选及菌种复配筛选采用单因子试验设计，4类共12株菌种分别接种于甘薯渣发酵培养基进行单菌发酵。发酵条件为接种量1×106个/g，加水60%，温度30 ℃，发酵4 d，pH自然，每株菌重复3次，以未添加菌液的空白发酵组为对照。考察发酵前后粗蛋白质含量、羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulose,CMCase)活性和还原糖含量变化，从曲霉类、木霉类、芽孢杆菌类、酵母类菌株中，各筛选1株最适发酵菌种，并以筛选出的4株菌中发酵效果最好的菌种作为主菌种(A)，分别和其他的3株辅发酵菌种(B、C、D)进行双菌、三菌和四菌混菌复配筛选。各菌种的接种比例为1 ∶ 1(1 ∶ 1 ∶ 1、1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1)，每组均设3个重复。发酵条件参考主发酵菌单因素发酵优化试验结果：接种量1×106个/g，发酵时间4 d，料水比(m/V)1 ∶ 1.3，培养温度38 ℃。最终以粗蛋白质含量为主要指标，CMCase活性和还原糖为辅助指标，确定最优的菌种组合。
1.3 正交试验优发混菌发酵条件采用正交设计进一步对发酵温度(A)、发酵时间(B)、料水比(C)、接种量(D)、菌种复配比例(E)进行5因素4水平的发酵条件优化(n=3)。其中接种量、发酵时间、料水比、发酵温度水平设置参考主发酵菌单因素发酵条件优化试验结果。发酵结束后，取部分鲜样测定CMCase活性，剩余部分65 ℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量。
1.4 最优发酵条件发酵对甘薯渣营养价值的影响根据正交试验设计优化出的混菌发酵参数，对甘薯渣进行固态发酵，设置1个对照组(不接种菌种)，其他条件与试验组一致。每组设3个重复。发酵结束后，取部分鲜样测定CMCase、滤纸酶(filter paper，FPA)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、淀粉酶活性，剩余部分65 ℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定干物质、粗灰分、粗纤维、粗脂肪、粗蛋白质、还原糖含量。
1.5 指标测定还原糖含量测定参照黄晓钰等[6]《食品化学综合实验》；水分、粗脂肪、粗蛋白质、粗灰分、粗纤维含量的测定参照张丽英[7]《饲料分析及饲料质量检测技术》；纤维素酶活性参照国标GB/T 23881—2009[8]、何凤琴等[9]及汤小朋等[10]的测定方法；淀粉酶活性参照陈毓荃[11]主编的《生物化学实验方法和技术》中介绍的淀粉酶活性的测定方法。
1.6 数据分析数据先用Excel 2003进行整理，再用SPSS 21.0处理、分析。单因素筛选试验数据进行单因素方差分析并结合Duncan氏法进行多重比较；正交试验数据进行极差分析及方差分析。所有试验结果均用平均值±标准差表示，显著水平为P<0.05。
2 结果与分析 2.1 最适单菌种发酵的筛选12种单菌种发酵甘薯渣后，粗蛋白质含量、CMCase活性、还原糖含量见表1。从表中可以看出，黑曲霉2发酵甘薯渣后其粗蛋白质含量从5.64%提高到7.89%，提高了44.7%，显著高于其他菌种发酵组(P<0.05)；黑曲霉2发酵组所产的CMCase活性为2.61 U/g，显著高于其他单菌发酵组(P<0.05)。综合考虑粗蛋白质含量、CMCase活性和还原糖含量等指标，确定黑曲霉2为曲霉组中优势菌种，同时也是12种菌株中最优发酵菌种，将其定为本试验主发酵菌种，记作A。
木霉组中里氏木霉和绿色木霉发酵甘薯渣后，其粗蛋白质含量无显著差异(P>0.05)，但CMCase活性高于绿色木霉发酵组(P<0.05)，因此选择里氏木霉作为木霉组中优势菌种，记作B。芽孢杆菌组中，枯草芽孢杆菌1组粗蛋白质含量显著高于其他3个组(P<0.05)；枯草芽孢杆菌1和3发酵后CMCase活性相当，显著高于其余2个芽孢杆菌发酵组(P<0.05)，因此确定枯草芽孢杆菌1作为芽孢杆菌中的优势菌种，记作C。酵母发酵组中，酿酒酵母1发酵后的粗蛋白质含量显著高于其他2个发酵组(P<0.05)。选择酿酒酵母1作为酵母菌中的优势菌种，记作D。
 | 表1 甘薯渣固态发酵最适单菌株筛选(风干基础) Table 1 The screening of single microbial strain for sweet potato residue fermentation (air-dry basis) |
以黑曲霉2为主发酵菌株(A)，与2.1试验筛选出的优势菌株里氏木霉(B)、枯草芽孢杆菌1(C)和酿酒酵母1(D)分别进行1 ∶ 1、1 ∶ 1 ∶ 1和1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1的复配，考察不同混菌组合对甘薯渣发酵效果的影响，结果见表2。
| 表2 不同混菌组合发酵对甘薯渣粗蛋白质、CMCase活性和还原糖含量的影响(风干基础) Table 2 Effects of different mixed microbe strain fermentation on the crude protein content,CMCase activity and reducing sugar content of sweet potato residue (air-dry basis) |
从表2可以看出，混菌组合发酵与单菌发酵相比，均提高发酵后原料粗蛋白质含量。粗蛋白质含量最高的是ABCD组合，达到8.39%，其次是ABC组合，2种组合发酵甘薯渣的粗蛋白质含量均显著高于其他发酵组合(P<0.05)。同时ABCD组合CMCase活性显著高于其他菌种组合(P<0.05)，达到3.04 U。还原糖含量除ACD组合最低外(P<0.05)，其余的组合之间差异不显著(P>0.05)。综合分析，ABCD组合发酵对甘薯渣营养价值改善最高，确定该组合为最优菌种组合。
2.3 正交试验结果采用L16(45)的正交试验设计，考察发酵温度、发酵时间、接种量、料水比、菌种复配比例对甘薯渣发酵的影响。各因素水平为发酵温度(32、34、36、38 ℃)、发酵时间(3、3.5、4、4.5 d)、接种量(2.5、5、10、20×105 CFU/g)，料水比(1 ∶ 1.2、1 ∶ 1.3、1 ∶ 1.4、1 ∶ 1.5)，菌种复配比例(黑曲霉2 ∶ 里氏木霉 ∶ 枯草芽孢杆菌1 ∶ 酿酒酵母1=1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1、1 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 1、1 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1、1 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 1)，分别用A、B、C、D、E表示。由极差分析(表3)粗蛋白质R值可以看出，RD>RC>RE>RA>RB，即接种量对发酵后粗蛋白质含量影响最大，其次是料水比，然后是菌种复配比例，再是温度，最后是发酵时间。由粗蛋白质K值可得最佳发酵组合A4B2C1D3E2。从CMCase R值可以看出，RA>RB>RC>RD>RE，即5个参数对CMCase活的影响程度有大到小依次是发酵温度、发酵时间、料水比、接种量、菌种复配比例。由CMCase K值可得最佳组合为A4B4C1D3E1。综合粗蛋白质和CMCase R值和K值，得出最适发酵参数组合是A4B4C1D3E2，即发酵温度38 ℃，培养时间4.5 d，料水比1 ∶ 1.2，接种量1×106个/g，接种比例为1 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 1。
| 表3 正交试验结果的极差分析表Table 3 The range analysis of the orthogonal test result |
由表4可知，以最优条件发酵甘薯渣后，CMCase、FPA、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶活性分别为4.26、3.29、3.75和5.15 U/g DM。与对照组相比，以干物质为基础，粗蛋白质含量从6.37%提高 到9.75%，提高了53%；粗脂肪含量从2.71%提高到4.92%，提高了82%；粗灰分含量从4.47%提高到6.56%，发酵后粗纤维含量没有下降，反而有所提升，从9.64%提高到13.08%。
| 表4 混菌发酵对甘薯渣营养成分变化的影响(干物质基础)Table 4 Effect of mixed microbe strain fermentation on nutrients composition of sweet potato residue(DM basis) |
不同的微生物产酶的种类和产酶能力不同，需要根据发酵目的不同来选择不同的微生物进行发酵[12]。本研究一共对4类共12种菌株进行发酵筛选，结果发现曲霉中的黑曲霉2，木霉中的里氏木霉，芽孢杆菌枯草芽孢杆菌1，酵母中的酿酒酵母1效果较好。其中黑曲霉能产生淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、葡萄糖酶、植酸酶、半乳甘露聚糖酶等酶类，因此在发酵中得到广泛的应用，但黑曲霉因变异性大，不同的黑曲霉菌株，发酵效果不一样。木霉也广泛用于微生物发酵，资料报道里氏木霉能分泌大量的纤维素酶和木聚糖酶[13, 14]。芽孢杆菌作为益生菌，可促进动物对饲料的消化、吸收、利用，从而提高饲料的转化率，并在防病促生长中起到非常重要作用[15, 16]。酵母属于益生菌，在发酵中应用广泛，发酵过程中酵母自身的繁殖生长会产生大量的高营养价值菌体蛋白[17]。
以筛选出的黑曲霉2为主发酵菌，与筛选出的其他3种菌种进行不同复配，发现四菌组合发酵效果优于双菌和三菌组合，发酵后甘薯渣粗蛋白质含量和CMCase酶活均高于其他组合(表2)。有研究报道，里氏木霉与黑曲霉混合发酵可弥补里氏木霉所产的β-葡萄糖苷酶活性较低的不足，提高酶解效率，让基质充分发酵[18, 19, 20]。Ahamed等[21]对里氏木霉RUT-C30与黑曲霉LMA进行混合发酵，发现FPA可达到7.1 U/mL，与单菌发酵的3.4 U/mL相比提高了108.8%。本研究发现4菌混合发酵，效果优于其他发酵组合，可能原因在于多菌组合发挥了各个菌种相互之间的协同效应。
微生物接种量、发酵时间、发酵温度、水分含量等因素也对发酵效果有着重要的影响[12, 22]。本研究利用L16(45)正交试验设计考察了4菌混合发酵的最优发酵参数，试验获得的混菌发酵最适参数为：培养温度38 ℃，培养时间4.5 d，料水比1 ∶ 1.3，接种量1×106个/g，接种比例1 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 1。傅娅梅[23]对复合蛋白质饲料适宜的发酵参数进行探讨，发现最适参数为：发酵时间2.5 d，加水量65％，接种量10％，枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母:植物乳酸杆菌为1 ∶ 1 ∶ 1；胡瑞等[24]用复合益生菌发酵豆粕，发现在复合益生菌(酿酒酵母 ∶ 米曲霉 ∶ 枯草芽孢杆菌=5 ∶ 1 ∶ 2)总添加量0.5%，料水比1 ∶ 0.4，发酵48 h小效果最佳。
陈松等[25]利用产朊假丝酵母、白地霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉混菌发酵苹果渣，发酵后基质粗蛋白质含量较发酵前提高了108%。王叔军等[26]向甘薯渣中添加少量的麸皮和尿素作为氮源，用微生物进行混菌发酵后，粗蛋白质含量提高到42.4%。赵启美等[27]采用固液结合的方法，发酵甘薯渣后，粗蛋白质含量提高了58.4%；粗纤维含量由25.3%下降到14.2%。本研究中，发酵后产物中粗蛋白质、粗脂肪和灰分含量显著提高。但发酵后粗纤维含量没有下降，反而有所上升，可能原因在于甘薯渣在提取淀粉过程中，因淀粉提取程度不同，造成甘薯渣粗纤维含量差异很大，本研究中所用原料粗纤维只有8.8%，低于资料报道的27%的水平[28]。因此发酵时微生物优先利用淀粉生长，这也是本研究中甘薯渣发酵后与汤小鹏等[10]发酵木薯渣相比，本试验中产物中淀粉酶活性高，而CMCase等纤维素降解酶活性相对较低的原因。多菌混菌固态发酵，可有效提高产物中FPA、CMCase和淀粉酶等活性[29]，本研究采用4种不同菌株混菌发酵，产物中检测出了FPA、CMCase、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶等活性。微生物在发酵过程中，利用发酵底物提供的氮源和碳源进行繁殖、生长，消耗部分底物，导致底物干物质含量降低，从而使粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量相对提高，但是通过微生物发酵，一方面微生物可将甘薯渣中低质量蛋白质转化为高质量菌体蛋白，提高蛋白质质量；另一方面固态发酵后产生的各种酶，以及微生物发酵过程中累积大量营养丰富的菌体蛋白及许多微生物代谢产物，间接提高了发酵产物营养价值，可望使甘薯渣营养价值得到进一步改善。此外，混菌发酵时有益微生物的竞争性生长，可望有效抑制导致甘薯渣腐烂变质的有害微生物如黑根霉(Rhizopus stolonifer)软腐菌生长，提高甘薯渣的存储价值。
4 结 论① 通过L16(45)正交试验得到多菌混合发酵甘薯渣的最优条件为：发酵温度38 ℃，发酵时间4.5 d，料水比1 ∶ 1.3，接种量1×106个/g，接种比例为黑曲霉2 ∶ 里氏木霉 ∶ 枯草芽孢杆菌1 ∶ 酿酒酵母1=1 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 1。
② 以最优条件混菌发酵甘薯渣后，发酵产物中可检测到CMCase、FPA、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶等酶活性。与对照相比，以干物质为基础，发酵后显著提高了产物中粗蛋白质、粗脂肪和还原糖含量。发酵后粗纤维含量没有下降，反而有所上升。
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