糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是蛋壳基质的重要组成部分,贯穿蛋壳形成的全过程[1],是蛋白聚糖的功能性区域。作为有机组分,GAGs和蛋白聚糖可影响钙化组织结构的强度和形状[2]。蛋壳中GAGs和基质蛋白等有机成分与蛋壳强度等品质密切相关[3, 4],蛋壳中蛋白质、糖醛酸和酸性GAGs与蛋壳强度呈极显著正相关关系[5]。并且,蛋壳中蛋白与糖蛋白的不同是造成品种间蛋壳品质差异的最终原因[6]。产蛋后期蛋壳胶护层中的多糖和脂类含量降低,蛋壳厚度和糖基化程度也随日龄的增加而降低,降低了胶护层的机械特性和对细菌抵抗力[7],多糖的减少意味着胶护层蛋白糖基化程度降低[8],因此,提高糖基化程度可改善蛋壳品质。不同种类GAGs的结构有别,各有其作用。蛋壳基质薄膜中硫酸角质素(KS)蛋白多糖的含量与蛋壳强度显著相关、与壳重增加有关;蛋壳钙化层中的硫酸皮肤素(DS)蛋白多糖可影响蛋壳的形态,但不受壳重变化的影响[9]。可见,GAGs及蛋白聚糖对维持蛋壳的结构和功能具有重要作用。本文从GAGs种类和生物活性、在蛋壳的分布和对蛋壳超微结构的作用,以及蛋壳中GAGs调控等方面,简述了GAGs影响蛋壳品质的研究进展,以期为蛋壳品质的研究提供新思路。
1 GAGs的种类和生物活性GAGs,又称黏多糖、氨基多糖、酸性多糖,是动物和植物,特别是高等动物结缔组织中的一类结构多糖,首次发现于哺乳动物肥大组织。GAGs是一种阴离子线性多糖,由重复双糖单位组成,因双糖单位中至少有1个单糖残基带有负电荷的羧基和硫酸基,故呈酸性。根据单糖残基、残基连键的类型以及硫酸基数目和位置的不同,GAGs家族包含6类成员:透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、DS、KS、肝素(Hp)和硫酸乙酰肝素(HS)。GAGs中双糖的基本组成单位为氨基己糖和糖醛酸,其中氨基己糖为N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc),糖醛酸为葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。KS中不含糖醛酸,为半乳糖代替。GAGs为不分支的长链聚合物,各种GAGs主糖链差异较小,但之后的硫酸化、脱乙酰基和差向异构化使各GAGs长链之间出现明显差别,因而生物学活性不同。除HA以游离形式存在外,其他GAGs均通过丝氨酸残基与核心蛋白共价连接,组装成相应的蛋白聚糖而发挥作用[10]。
因结构不同,各种GAGs的生物活性和行使功能有别。HA的结构最简单,多糖链由[→4)GlcNAc β1→3GlcA β(1→]重复二糖组成,不被硫酸化,不与蛋白质共价结合,以游离形式或非共价复合体形式存在。HA结构虽简单但分子量大,因单糖残基间的β链和大量的链内氢键,以及外伸的负电荷羧基之间的相互斥力,HA在溶液中呈现高度伸展的无规卷曲,且因其分子表面含有较多亲水基团,HA可结合大量的水,黏滞性较大,起润滑和保护作用。由于硫酸化位点的不同,最常见的CS主要有4-CS和6-CS,且多数CS是二者的共聚物。与CS最大的区别在于,DS糖醛酸单位主要是L-艾杜糖醛酸,并有不定数量的D-葡糖醛酸。L-艾杜糖醛酸是在差向异构酶的作用下,由D-葡糖醛酸C5上发生异构化形成。且L-艾杜糖醛酸一旦形成,在其C2位上即可发生硫酸化,因此,DS的多糖链更加灵活,可与多个特定的蛋白和多糖结合。KS是唯一不含糖醛酸单体的杂多糖,因双糖单位中含有半乳糖,故酸性较弱,结合阳离子的程度较其他GAGs差。根据与蛋白质连接方式(N-链接聚糖或O-链接聚糖)的不同,KS主要有2种(Ⅰ和Ⅱ),存在于角膜或骨骼中。与其他GAGs显著不同的是Hp和HS中N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以α-1,4键相连,但二者N-硫酸化的程度不同,是区别二者的重要标志。HS中,转变为N-硫酸的N-乙酰基一般不足50%,Hp中则常达70%~90%。因差向异构作用是可逆的平衡反应,而2-硫酸化作用可防止艾杜糖醛酸的逆向反应,因此,Hp高度聚阴离子化,每个双糖中含有4个潜在的阴离子:1个羧基、1个N-硫酸和2个O-硫酸,是一种天然的抗凝剂。可见,不同结构的GAGs其生物学功能不同,结构间的差别主要在于双糖单位的组成、葡糖醛酸/艾杜糖醛酸及硫酸化程度不同[11]。
2 GAGs在蛋壳的分布及对蛋壳超微结构的 作用研究表明,蛋壳中具有功能的GAGs主要有4种(HA、KS、CS和DS)[12, 13, 14, 15]。蛋壳中GAGs由48%的HA和52%的半乳糖胺聚糖(主要是CS和DS的共聚物)组成[13]。蛋壳膜和蛋壳基质中GAGs亚类组成不同,壳膜中主要是HA,其次是HS;蛋壳基质中以CS居多,并含有丰富的HA、KS和HS[15]。蛋壳的形成是一个时序性过程,在输卵管的不同部位,无机物和基质成分相互作用,由内至外依次形成未钙化的内、外蛋壳膜(70 μm)、钙化的不规则乳突层(100 μm)、栅栏层(300 μm)、垂直晶体层(3~8 μm)和胶护层(0.5~12.8 μm)[16, 17]。GAGs存在于各结构层中,参与形成超微结构。GAGs是基质薄膜纤维核中X胶原蛋白重要的糖组分,参与维持壳膜的完整性和弹性[1];KS不仅存在于基质薄膜中,还与核心蛋白结合形成高度硫酸化的角质素蛋白多糖,与外壳膜纤维共同作用构成乳突核,促进第一枚晶体的形成;HA和DS蛋白多糖大量存在于蛋壳的栅栏层,构成蛋壳最厚层[18, 19];糖蛋白是有机胶护层(内部钙化层和外部非钙化层)的重要组成部分,含量大于90%,蛋白质主要存在于外层,内层含有丰富的硫酸化蛋白多糖和磷酸盐[7]。糖醛酸存在于蛋壳基质薄膜和矿化层中,其中矿化层中含量较高,比内外基质薄膜高约5倍,这与糖醛酸在蛋壳矿化过程中发挥功能相关[4, 20]。可见,GAGs广泛分布在蛋壳各结构层,维持蛋壳结构和功能。
GAGs参与形成蛋壳的超微结构,在维持蛋壳的结构和功能方面有重要作用。研究表明,GAGs及相应的蛋白多糖参与蛋壳结构的形成[1],糖醛酸或其硫酸化部位经过适当的离子化,可单独或相互作用,在方解石沉积过程中结合钙离子,钙化程度与GAGs的含量和硫酸化程度密切相关[11]。在蛋壳形成过程中,输卵管峡部、红峡部和蛋壳腺均检测到KS蛋白多糖和DS蛋白多糖的分泌[1]。KS蛋白多糖被认为参与形成乳突层第1枚晶体的成核,DS蛋白多糖作用于钙化阶段,参与调节晶体的生长和定向[1, 3]。体外研究表明,纯化后的蛋壳包含DS蛋白聚糖,可改变方解石的形态,降低方解石的大小,且对碳酸钙形态和大小的影响有剂量依赖性,但超过一定含量,不会再有进一步的作用[21]。体外模拟试验中加入DS与加入子宫液的反应相似,都调控晶体的生长和形态[11]。蛋鸡腹腔注射氯酸盐,会抑制DS蛋白多糖形成,严重影响蛋壳栅栏层的生长[1];撤销抑制剂43 d后,DS蛋白多糖恢复硫酸化,晶体改变得到恢复[21]。此外,GAGs是构成壳膜纤维和乳突核部的重要组成部分[18]。通过比较有和无乳突核时的壳膜组成,发现乳突核部富含氨基己糖、唾液酸和己糖,无糖醛酸,提示KS可能参与蛋壳钙化的起始[22]。乳突体包含的KS蛋白聚糖(对钙的亲和性较低),可作为第1晶体的成核位点,还有益于雏鸡对钙的利用[23]。而胶护层中含有的KS大分子与乳突核不同,其参与羟基磷灰石的形成,但具体作用仍不清楚[24]。可见,糖醛酸和GAGs及蛋白聚糖在钙化组织形成和调节蛋壳形成过程中发挥重要作用[25]。
3 蛋壳中GAGs合成和分解的调控GAGs在机体内与核心蛋白结合形成蛋白聚糖(除HA外)而发挥功能。参与GAGs合成的各种单糖及其衍生物均可由葡萄糖转变,与二磷酸尿苷(UDP)结合,形成活性单糖。GAGs在细胞内合成,首先核糖体上合成的多肽分泌入内质网,在木糖转移酶催化下,1分子木糖基连接到核心蛋白多肽链的丝氨酸残基上,形成O-糖苷键,再由半乳糖转移酶催化,依次转移2分子半乳糖,构成“木棸霔半”(O-xyl-galact-galact-)三糖连接区,然后由高度特异的糖基转移酶催化活性单糖转移到氨基酸侧链,糖链合成后需进一步修饰,但糖链的延伸和加工修饰在高尔基体中进行。其中糖基转移酶,尤其半乳糖-β-1,3-葡萄糖醛酸基转移酶(GlcAT-Ⅰ),可将一个葡萄糖醛酸残基从UDP-葡萄糖醛酸转移到GAGs链上[26];差向异构酶可催化葡萄糖醛酸转变为艾杜糖醛酸;硫酸转移酶催化硫酸基(由活性硫酸根提供)转移到新合成的多糖链的氨基或羟基上,都在GAGs多糖链后期组装过程中发挥重要作用[27]。GAGs的分解主要在溶酶体,受内切糖苷酶、外切糖苷酶及硫酸酯酶等调控。蛋白聚糖在组织蛋白酶等的作用下,部分肽链水解产生带多糖链的小片段,被细胞吞噬进入溶酶体,逐步水解成各种单糖及其衍生物。因此,GAGs的合成和分解主要受各种酶的分隔定位和特异性影响。
蛋壳GAGs由输卵管和蛋壳腺上皮细胞和管状腺细胞分泌,贯穿蛋壳结构的形成[1]。GAGs可能作为碳酸钙堆积起始时的晶体核[3],随着GAGs合成增加,晶核数量增长,碳酸钙围绕晶核逐渐沉积,而晶核的数量决定了乳突的密集程度,乳突间距变小。同时,因晶核增多,乳突增长密集,乳突黏合发生和乳突层轮廓消失较早,降低了乳突层高度。研究表明,乳突层厚度越小,乳突间距越小,蛋壳强度越大[28]。GAGs发挥以上作用可能与GlcAT-Ⅰ的活性有关。锰是GlcAT-Ⅰ的活性因子,可调控蛋壳中GAGs的含量。饲粮锰不足时,蛋壳腺内GlcAT-Ⅰ基因和蛋白表达水平均降低,蛋壳中氨基己糖和己糖醛酸含量降低,乳突层厚度和乳突宽度显著增加,蛋壳表面裂纹增加,蛋壳品质下降[29, 30]。Venkatesan等[31]通过导入GlcAT-Ⅰ基因,改变GAGs的合成,可增加人软骨组织中蛋白多糖含量。若阻碍软骨组织中GlcAT-Ⅰ的表达,则蛋白多糖合成骤减,终致骨连接功能丧失[32]。蛋壳中糖醛酸和GAGs的含量随饲粮锰水平(来自硫酸锰,由0提高到100 mg/kg)增加而升高[30]。此外,肖俊峰[28]利用蛋白质组学技术,验证了锰可提高GlcAT-Ⅰ和β-1,4-半乳糖基转移酶(GT)的表达水平,GT可将半乳糖苷从UDP-半乳糖苷转移到N-多糖复合物末端的GlcNAc上,促进N-乙酰半乳糖胺的组成,从而促进GAGs的形成,但关于GT调控蛋壳品质的研究鲜有报道。调控GlcAT-Ⅰ和GT的活性,促进GAGs的合成,是通过GAGs调控蛋壳品质的方向之一。
GAGs的结构随着机体的发育、生长和老化而不断变化,其含量和结构的差异与多种疾病的发生、发展密切相关[33]。硫酸化程度对GAGs的结构和功能具有重要作用,尤其HS、CS和DS的活性受硫酸化影响显著。硫酸转移酶可催化硫酸基结合到新形成的多糖链氨基或羟基上,促进蛋白聚糖合成。研究表明,氯酸盐可抑制糖胺的硫酸化,对CS和DS的抑制作用大于90%,但对其他GAGs的抑制效果较差[34]。氯酸盐影响蛋壳晶体栅栏层的生长,但对蛋壳晶体初始成核影响较小,主要原因是前者含有大量的CS和DS,而后者由高度硫酸化的KS蛋白聚糖形成。此外,维生素A缺乏时,硫酸转移酶的活性下降,GAGs合成受阻,这可能是饲粮中维生素A缺乏,影响蛋壳品质的机理。由此可见,硫酸转移酶可调控蛋壳GAGs和蛋白聚糖的硫酸化程度,改变含量和结构,在蛋壳矿化过程发挥重要作用。调节硫酸转移酶的含量和活性,是通过GAGs调控蛋壳品质的又一方向。
GAGs是X胶原纤维重要的糖组分,而蛋壳钙化结晶起始于基质薄膜交联的纤维核上,基质薄膜的完整性是蛋壳形成的先决条件,铜缺乏或氨基腈干预导致的壳膜交联异常,均不利于后续蛋壳的结构形成[35, 36]。因此,GAGs可能通过影响壳膜纤维的交联程度和完整性,直接影响晶体成核位点的形成,进而改变超微结构,调控蛋壳品质。研究表明,饲粮缺铜可降低鸡蛋大小的均一性,形状异常、蛋壳粗糙和褶皱,改变蛋壳乳突层的结构,主要原因是蛋壳基质薄膜的改变,铜依赖性的交联减少,GAGs位于胶原纤维,但是否也通过GAGs发挥作用尚不清楚。因此,明确GAGs调控蛋壳品质的机理,对通过营养调控蛋壳品质具有重要意义。
GAGs作为蛋白聚糖的功能区域,需与相应的核心蛋白结合发挥作用,如DS蛋白聚糖的核心蛋白是OC-116[12],贯穿栅栏层的形成,调节栅栏层的厚度。研究并发现不同GAGs的核心蛋白,并探究其相互作用,是通过GAGs调控蛋壳品质的另一切入点。
4 小 结综上,GAGs广泛存在于蛋壳中,参与超微结构形成,进而调控蛋壳品质。但GAGs调控蛋壳超微结构的作用机制尚不明确,且GAGs的种类和数量随蛋壳超微结构层不同而改变,发挥的位点和时间也有所差别。因此,利用先进技术,观测蛋壳形成中GAGs的时序性变化,将有助于揭示GAGs在蛋壳超微结构形成过程中的生物学作用,同时为营养调控蛋壳品质提供新思路。
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