铬(Cr)是动物必需的微量元素之一,作为胰岛素作用的辅助因子,在机体碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸代谢中扮演着重要角色[1]。许多研究表明,饲粮中添加适量的Cr具有提高动物生长性能、改善胴体品质、增强机体免疫力等作用[2, 3, 4]。Cr在动物体内形成小分子Cr的有机配合物以被动扩散的形式通过肠黏膜进入到小肠内[5],其吸收部位主要在小肠中部,其次是回肠和十二指肠[6]。肠黏膜不仅是机体消化、吸收营养物质的重要场所,而且还具有重要的免疫功能,保持正常的肠黏膜形态是肠道发挥其强大吸收功能、抵抗外界有害物质入侵、促进机体健康发育的前提。目前针对Cr方面的研究大多集中在Cr对机体糖代谢和脂肪沉积的影响[7, 8, 9],而针对肠道黏膜形态和蛋白质代谢方面的研究较少。且有研究认为饲粮蛋白质是Cr的最好来源[10],即摄入低蛋白质(无氮)饲粮可能会导致Cr的缺乏[10, 11]。鉴于此,本研究以Sprague Dawley(SD)大鼠为动物模型,选用新型Cr源——丙酸铬(Cr propionate,CrPro),通过饲喂无氮饲粮以产生低Cr状态,初步探讨饲粮添加不同水平的CrPro对SD大鼠器官发育、肠道黏膜形态和血清指标的影响,为人们进一步认识Cr的作用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料及试验设计选用体重(53.63±1.37) g的无特定病原体(SPF)级雌性断奶SD大鼠36只,预饲喂1周后,根据各处理体重无显著差异(P>0.05)原则分为3个处理,每个处理6个重复,每个重复2只大鼠。各处理分别饲喂无氮基础饲粮(对照组)及在基础饲粮上分别添加0.2和1.0 mg/kg Cr(以CrPro形式)的试验饲粮。试验期21 d。CrPro由建明(珠海)工业有限公司提供,实测Cr含量为0.11%。根据前人研究结果[12]配制纯合无氮基础饲粮,其中的酪蛋白及十二水合硫酸铬钾以等比例玉米淀粉替代(凯氏定氮法测定基础饲粮中粗蛋白质含量为0.70%,电热板消解-石墨炉原子吸收光谱法测定基础饲粮中Cr含量为0.08 mg/kg)。
1.2 饲养管理试验于2015年3月在西南民族大学小动物试验场进行。自然周期光照,动物房温度控制在(24±1) ℃,相对湿度控制在50%~60%,排风扇24 h连续通风换气。大鼠自由采食试验饲粮,自由饮用去离子水(未检测出Cr)。
1.3 测定指标及方法 1.3.1 血清指标正试期第21天,禁食8 h,对重复笼里的2只大鼠称重后,眼球动脉采血,4 ℃条件下以2 000×g离心15 min制得血清,置于-20 ℃条件下保存。
血清指标均由全自动生化分析仪(TC6010L,上海特康科技有限公司)测定,总蛋白(TP)含量测定采用双缩脲法;白蛋白(ALB)含量测定采用溴甲酚绿法;尿酸(UA)含量测定采用尿酸酶法。计算球蛋白(GLB)含量及白球比(A/G)。
GLB=TP-ALB。
1.3.2 器官指数采血后,颈椎脱臼处死,剖离肝脏、脾脏、肾脏,称重并计算各器官指数。
器官指数(mg/g)=器官鲜重/活体重。
1.3.3 空肠黏膜形态大鼠处死后,迅速剪取空肠段2 cm,用pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻冲洗后置于4%多聚甲醛固定液中固定,4 ℃保存3 d后,进行石蜡包埋、切片及常规苏木精-伊红(HE)染色,观察并测量空肠的绒毛高度(从绒毛基底部到绒毛顶端的距离)、隐窝深度(隐窝基底部到绒毛基底部的距离),计算绒毛长度/隐窝深度。
1.4 统计分析应用SAS 8.1程序对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),以P<0.05作为差异显著的标准,用Duncan氏法进行多重比较。
2 结 果 2.1 饲粮Cr添加水平对大鼠器官指数的影响由表1可知,饲粮Cr添加水平对大鼠肝脏指数和肾脏指数无显著影响(P>0.05)。相比对照组和1.0 mg/kg组,0.2 mg/kg组显著提高了脾脏指数(P<0.05),而对照组和1.0 mg/kg组间无显著差异(P>0.05)。
由表2可知,饲粮Cr添加水平对空肠绒毛高度、隐窝深度无显著影响(P>0.05)。与对照组相比,1.0 mg/kg组显著提高了绒毛高度/隐窝深度(P<0.05),而0.2 mg/kg组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。
由表3可知,饲粮Cr添加水平对血清TP、GLB含量及A/G无显著影响(P>0.05)。相比对照组及0.2 mg/kg组,1.0 mg/kg组显著提高了血清ALB含量(P<0.05),而对照组与0.2 mg/kg组之间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,0.2、1.0 mg/kg组显著提高了血清UA含量(P<0.05),且1.0 mg/kg组显著高于0.2 mg/kg组(P<0.05)。
本研究发现饲粮Cr添加水平对大鼠肝脏指数和肾脏指数无显著影响。与此相似,Bernao等[13]对Wistar大鼠连续灌服不同水平(0、0.1、0.2、0.5 mg/d)的吡啶甲酸铬12 d,发现腓肠肌指数、肝脏指数以及胴体指数在各处理间无显著差异。辜良英等[14]也发现,相比不添加Cr的对照组,饲粮中添加0.3 mg/kg的纳米铬和吡啶羧酸铬对SD大鼠心脏指数、肝脏指数、肾脏指数、睾丸指数以及后腿肌指数无显著影响,但在脾脏指数方面,吡啶羧酸铬组高于纳米铬组。在提高脾脏指数方面,本研究也发现,0.2 mg/kg组比对照组和1.0 mg/kg组更有效,而对照组和1.0 mg/kg组间无显著差异。脾脏作为机体免疫器官,其重量的增加在一定意义上反映机体免疫性能的提高[15]。这提示我们,饲粮中添加0.2 mg/kg的Cr可能在改善机体免疫性能方面有一定的作用。
3.2 饲粮Cr添加水平对大鼠空肠黏膜形态的 影响本研究中饲粮Cr添加水平对空肠绒毛高度、隐窝深度无影响,但影响二者的比值,其中1.0 mg/kg组能显著提高绒毛高度/隐窝深度,而0.2 mg/kg组与对照组之间无显著差异。类似地,李燕[5]发现饲粮中添加0.2 mg/kg的吡啶羧酸铬可显著增加14日龄热应激肉鸭的空肠绒毛高度/隐窝深度,并可显著增加21日龄热应激肉鸭的回肠绒毛高度/隐窝深度。王珏等[16]于热应激条件下在下蛋鸡饲粮中添加不同水平(0、0.07、0.15、0.22、0.29、0.37 μg/kg)的葡萄糖耐量因子52 d,发现与对照组相比,0.37 μg/kg组能极显著提高空肠绒毛高度,0.15 μg/kg组能显著提高空肠绒毛高度。肠绒毛为小肠固有层和上皮共同凸向肠腔形成的叶状结构,可增大小肠的吸收面积,特别是绒毛高度/隐窝深度反映了肠道黏膜的功能状态,比值高说明小肠消化吸收功能增强。由此可知,饲粮中添加适量Cr可以改善肠黏膜形态,提高小肠对营养物质的利用率。但也有研究指出,饲粮中添加不同水平(0、5、10、15 mg/kg)的六水合氯化铬(CrCl3·6H2O)对獭兔十二指肠的绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度均无显著影响[17]。这可能是与Cr源的选择及添加水平有关。目前关于Cr对肠黏膜影响的研究还较少,需要加大这方面研究的关注度。
3.3 饲粮Cr添加水平对大鼠血清指标的影响本研究发现饲粮Cr添加水平对大鼠血清TP、GLB含量及A/G无显著影响,这与Bernao等[13]、辜良英等[14]、闫祥洲等[18]、张敏红等[19]人的研究相一致。闫祥洲等[18]发现饲粮中添加0.2 mg/kg的甲基吡啶铬或酵母铬对断奶仔猪血清TP、GLB含量及A/G无显著影响。张敏红等[19]发现饲粮中添加0.3 mg/kg的吡啶羧酸铬对高温条件下饲养的阉公猪血浆TP、GLB含量也无显著影响。然而,侯小强等[20]在对早期断奶仔猪为期35 d的试验中发现,饲粮中添加0.2 mg/kg的吡啶羧酸铬对第0、9、18、35天血清TP、GLB含量无显著影响,但显著提高了第27天血清TP、GLB含量。王敏奇等[21]在肥育猪饲粮中添加0.2 mg/kg的不同Cr源(氯化铬、吡啶羧酸铬、纳米铬)40 d,发现仅纳米铬和吡啶羧酸铬组显著提高了血清TP含量。由此可见,Cr对动物血清TP、GLB含量的影响与试验取样观察时间及Cr源类型等有关。
另外,本研究发现,相比对照组及0.2 mg/kg组,1.0 mg/kg组显著提高了血清ALB含量,而对照组与0.2 mg/kg组间无显著差异。这与Moonsie-Shageer等[22]在牛上及秦健等[23]、程玉芳等[24, 25]在鸡上的研究结果(Cr添加水平为0.2~1.0 mg/kg)一致。然而,闫祥洲等[18]、张敏红等[19]、侯小强等[20]在猪上的研究则表明血清ALB含量不受Cr添加水平(0.2~0.3 mg/kg)的影响。造成这种不同的结果可能与Cr的添加水平以及动物种类等有关,并且本试验基于无氮饲粮条件下,蛋白质供给不足可能对Cr发挥其作用产生影响,但目前关于Cr对蛋白质代谢的调节作用还不明确,需要进一步系统探究。
此外,在本研究中,相比对照组,0.2、1.0 mg/kg组均显著提高了血清UA含量,且1.0 mg/kg组比0.2 mg/kg组提高效果更明显。陈强等[26]在肥育猪饲粮中添加不同水平(0、0.2、0.5、1.0 mg/kg)的烟酸铬2个月,发现0.2与0.5 mg/kg添加水平能显著降低血清UA含量,但1.0 mg/kg添加水平与对照组间无显著差异,并且随着Cr添加水平的提高,血清UA含量也呈现升高的趋势。Ernest等[27]在不同蛋白质来源(酪蛋白、鱼粉、去皮大豆、棉籽)饲粮中添加100 mg/kg的吡啶羧酸铬饲喂Wistar大鼠,发现仅酪蛋白、鱼粉组较相应的对照组显著提高了血清UA含量。这提示我们Cr对血清UA含量的作用效果不一,原因可能与Cr添加水平以及饲粮蛋白质来源有关。
4 结 论无氮饲粮中添加适量Cr能够提高SD大鼠脾脏指数,提高空肠绒毛高度/隐窝深度,提高血清ALB和UA含量,对改善机体免疫器官指数、肠黏膜形态及血清蛋白质代谢有一定的作用。
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