胆碱是维持水生动物正常生长所必需的一种维生素,它不仅是机体的组成成分,而且还参与到某些物质的代谢过程中。胆碱作为甲基供体,影响甜菜碱与蛋氨酸的代谢;作为卵磷脂的主要成分,促进肝脏中脂肪的转运与利用[1]。研究表明,鱼类摄食缺乏胆碱的饲料会产生缺乏症状,例如:杂交鲈(Monrone saxatilis×M. chrysops)[2]和斑点叉尾 (Ictalurus punctatus)[3]肝脏脂肪过度沉积;鲤(Cyprinus carpio)[4]和金鲈(Perca flavescens)[5]幼鱼生长受到抑制;湖鳟(Salvelinus namaycush)饲料效率降低、生长受阻、肝脏脂肪沉积等[6]。
罗非鱼因其具有生长速度快、食性杂与抗病力强等优点,已成为我国南方地区养殖的一种主要淡水鱼品种[7]。目前有关罗非鱼胆碱需要量的研究主要集中在1~50 g的小规格幼鱼[8]或成鱼阶段,且结果差异较大。研究发现,0.56~3.40 g罗非鱼幼鱼的胆碱需要量为1 000~3 000 mg/kg[9, 10, 11],220 g罗非鱼成鱼的胆碱需要量为506.43~981.38 mg/kg[12]。体重>50 g的大规格罗非鱼幼鱼,生长速度快,饲料消耗多,对营养素的需要量大,因而对胆碱的需要量可能已经发生了变化。吉富罗非鱼(GIFT,Oreochromis niloticus)是通过对4个非洲原种品系尼罗罗非鱼和4个亚洲品系尼罗罗非鱼进行种内杂交选育而成的[13],经过多年选育,其生长速度较其他品系的尼罗罗非鱼可提高5%~30%[14],是目前我国罗非鱼养殖中最主要的品系。因此,本试验通过在饲料中梯度添加胆碱,研究胆碱对初始体重为(57.4±2.5) g的吉富罗非鱼幼鱼生长性能、体成分和血清生化指标的影响,来确定大规格吉富罗非鱼幼鱼对饲料中胆碱的需要量,旨在为罗非鱼饲料的配制提供理论依据,从而节约饲料生产成本。
1 材料与方法 1.1 试验饲料以酪蛋白、明胶为蛋白质源,混合油脂[m(豆油) ∶ m(玉米油)=1 ∶ 1]为脂肪源,糊精为糖源配制基础饲料,其组成及营养水平见表1。以氯化胆碱为胆碱源,在基础饲料的基础上分别添加0、300、600、1 200、1 800、2 400 mg/kg的氯化胆碱,配制6种试验饲料。6种试验饲料胆碱水平实测值分别为45.1、308.9、540.5、946.0、1 486.5、1 756.8 mg/kg。所有原料经粉碎后过60目分级筛,然后混匀。最后加豆油、玉米油和20%的水混匀,用绞肉机将饲料原料挤压呈条状,常温条件下避光风干,破碎成直径为2 mm的颗粒饲料。
1.2 试验用鱼与饲养管理试验所用吉富罗非鱼鱼苗购自广西省罗非鱼国家级育种试验场,鱼苗购回后放入网箱中暂养至试验所需规格,在正式试验开始前,用不含胆碱的基础饲料喂养2周。试验鱼分组前,鱼体饥饿24 h,然后挑选体格健壮且规格大小一致的480尾吉富罗非鱼,平均体重为(57.4±2.5) g,养殖于24个1.0 m×1.0 m×1.5 m的网箱中,每个网箱放养20尾鱼。将24个网箱随机分为6组,每种试验饲料投喂4个网箱。饲养期为10周,时间为2014年7月至2014年10月。养殖期间水温为26.5~30.9 ℃,pH为7.2~8.0,溶氧浓度>5 mg/L,氨氮浓度<1 mg/L,亚硝酸盐浓度<0.1 mg/L。每天投食2次(06:00、18:00),表观饱食投喂,并根据鱼体生长、摄食情况和水温等环境条件及时调整投喂量,且每天记录鱼摄食及死亡情况。
养殖试验结束后,禁食24 h,以网箱为单位进行称重,计算增重率(weight gain rate,WGR)和成活率(survival rate,SR)。从每个网箱中随机取3尾鱼,用于全鱼常规营养成分的测定。另外,随机从每个网箱取2尾鱼用MS-222麻醉后测定体长和体重,然后尾静脉采血。血液静置3 h后,4 ℃离心(3 000 r/min,10 min),取上清于-40 ℃冰箱保存。采血后分离肝胰脏、内脏,并分别对肝胰脏、内脏称重,接着取背肌。采完样后,所有样品存储在-40 ℃冰箱以备后续分析。
1.4 指标测定根据以下公式,计算试验鱼的增重率、成活率、饲料效率(feed efficiency,FE)、脏体比(viscerosomatic index,VSI)、肝体比(hepatosomatic index,HSI)、肥满度(condition factor,CF)。
成活率(%)=(S1/S0)×100;
饲料效率=Wz/Fz;
蛋白质效率(%)=[Wz/(Fz×P)]×100;
脏体比(%)=(WV/W)×100;
肝体比(%)=(WH/W)×100;
肥满度(g/cm3)=(W/L3)×100。
式中:W1为每个网箱试验鱼终末体重(g);W0为每个网箱试验鱼初始体重(g);S1为终末尾数;S0为初始尾数;Wz为每个网箱最终所增加的鱼体总重(g);Fz为每个网箱在整个养殖期间所投喂饲料的总重(g);P为饲料蛋白质水平(%);WV为采样鱼的内脏重(g);W为采样鱼的体重(g);WH为采样鱼的肝胰脏重(g);L为采样鱼的体长(cm)。
饲料、全鱼、肌肉及肝胰脏的粗蛋白质、粗脂肪与粗灰分含量分别采用凯氏定氮法、索氏抽提法和马福炉灰化法测定。全鱼和饲料水分含量采用103 ℃恒温干燥失重法测定;肌肉和肝胰脏水分含量采用冷冻干燥法测定。饲料胆碱水平与肝胰脏胆碱蓄积量的测定参照文献[15]。血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)、葡萄糖(glucose,GLU)、总蛋白(total protein,TP)含量及谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)活力均采用希森美康全自动生化分析仪进行测定(CHEMIX-800)。
1.5 数据处理试验数据采用统计软件SPSS 18.0中的单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏均值多重比较法进行差异显著性分析,所有数据均以平均值±标准误(mean±SE)表示,P<0.05为差异显著。采用折线分析法,确定大规格吉富罗非鱼幼鱼对饲料中胆碱的需要量。
2 结 果 2.1 饲料胆碱水平对大规格吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响由表2可知,饲料胆碱水平对试验鱼的成活率无显著影响(P>0.05),各组成活率均为100%。随饲料胆碱水平的提高,试验鱼的增重率呈先上升后保持稳定的趋势,饲料中胆碱水平≥308.9 mg/kg时,试验鱼的增重率显著高于45.1 mg/kg组(P<0.05),饲料中胆碱水平为540.5、946.0、1 486.5和1 756.8 mg/kg时,试验鱼的增重率各组之间差异不显著(P>0.05)。1 756.8 mg/kg组饲料效率最高,显著高于45.1 mg/kg组(P<0.05),但与308.9、540.5、946.0和1 486.5 mg/kg组差异不显著(P>0.05)。1 486.5 mg/kg组试验鱼肥满度显著大于45.1、308.9、540.5和946.0 mg/kg组(P<0.05),但与1 756.8 mg/kg组差异不显著(P>0.05),45.1、308.9、540.5、946.0 mg/kg组之间差异也不显著(P>0.05)。45.1 mg/kg组脏体比显著大于540.5、1 756.8 mg/kg组(P<0.05),而与308.9、946.0和1 486.5 mg/kg组差异不显著(P>0.05);308.9 mg/kg组脏体比显著大于540.5 mg/kg组(P<0.05),与其余各组差异不显著(P>0.05)。经折线模型回归分析,饲料胆碱水平(x)与大规格吉富罗非鱼幼鱼增重率(y)的关系为y=0.088 9x+250.46(R2=0.96),得出大规格吉富罗非鱼幼鱼获得最佳生长时对饲料胆碱的需要量为625.42 mg/kg(图1)。
2.2 饲料胆碱水平对大规格吉富罗非鱼幼鱼全鱼、肌肉与肝胰脏常规营养成分的影响饲料胆碱水平对大规格吉富罗非鱼幼鱼全鱼、肌肉与肝胰脏常规营养成分的影响见表3。全鱼粗蛋白质、粗灰分含量各组间无显著差异(P>0.05);1 756.8 mg/kg组全鱼粗脂肪含量显著低于946.0 mg/kg组(P<0.05),而与45.1、308.9、540.5、1 486.5 mg/kg组差异不显著(P>0.05);946.0 mg/kg组全鱼水分含量显著低于45.1 mg/kg组(P<0.05),而与308.9、540.5、1 486.5、1 756.8 mg/kg组无显著差异(P>0.05)。肝胰脏水分、粗蛋白质含量各组间差异不显著(P>0.05);肝胰脏粗脂肪含量随饲料胆碱水平的增加呈现先下降后稳定的趋势,45.1 mg/kg组粗脂肪含量显著高于540.5、946.0、1 486.5、1 756.8 mg/kg组(P<0.05),而与308.9 mg/kg组无显著差异(P>0.05)。肌肉水分含量各组之间差异不显著(P>0.05);肌肉粗脂肪含量随饲料胆碱水平的增加呈现先上升后保持稳定的趋势, 1 756.8 mg/kg组显著高于45.1、308.9 mg/kg组 (P<0.05),而与540.5、946.0、1 486.5 mg/kg组差异不显著(P>0.05);肌肉粗蛋白质含量随饲料中胆碱水平的增加与肌肉粗脂肪含量呈现出相同的变化趋势,以540.5 mg/kg组粗蛋白质含量最高,显著高于45.1 mg/kg组(P<0.05),与其余各组无显著差异(P>0.05)。
饲料胆碱水平对大规格吉富罗非鱼幼鱼血清生化指标的影响见表4。饲料胆碱水平对罗非鱼 血清TP、GLU含量无显著影响(P>0.05)。血清 AST、ALT活力随饲料胆碱水平的增加呈现先下降后保持稳定的趋势,其中45.1 mg/kg组血清AST、ALT活力均显著高于540.5、946.0、1 486.5、1 756.8 mg/kg组(P<0.05),540.5、946.0、1 486.5 mg/kg组之间血清AST、ALT活力差异不显著(P>0.05)。1 486.5 mg/kg组血清T-CHO含量显著高于45.1、308.9、540.5、946.0 mg/kg组(P<0.05),与1 756.8 mg/kg组无显著差异(P>0.05),308.9、540.5、946.0 mg/kg组之间差异不显著(P>0.05)。血清TG含量以1 486.5 mg/kg组最高,显著高于45.1、308.9、540.5、946.0、1 756.8 mg/kg组(P<0.05),45.1、308.9、540.5 mg/kg组之间无显著差异(P>0.05)。
如图2所示,大规格吉富罗非鱼幼鱼肝胰脏胆碱蓄积量随饲料胆碱水平的增加呈现先上升后稳定的趋势,45.1 mg/kg组肝胰脏胆碱蓄积量低于其他各组。以肝胰脏胆碱蓄积量为评价指标时,满足大规格吉富罗非鱼幼鱼需要的饲料胆碱水平为1 118.61 mg/kg。
本试验中,投喂添加适量胆碱饲料的试验鱼,其增重率、饲料效率与肥满度均有不同程度提高,表明饲料添加适量的胆碱对罗非鱼的生长是有利的,这一结果与帅继祥等[16]在星斑川鲽(Platichthys stellatus)、陈芳等[17]在黄鳝(Monopterus albus)、王道尊等[18]在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和Jiang等[19]在团头鲂(Megalobrama amblycephala)上的研究结果相似。而Shiau等[9]发现,当饲料胆碱添加量超过800 mg/kg时,奥尼罗非鱼幼鱼增重率出现下降的趋势;Duan等[20]发现,当饲料胆碱添加量超过4 400.44 mg/kg时,异育银鲫(Carassius auratus gibelio)的特定生长率也有下降趋势。但帅继祥等[16]发现,当饲料胆碱添加量低于1 160.99 mg/kg时,星斑川鲽幼鱼的增重率显著低于其余各组;邵辉等[12]发现,当饲料胆碱添加量低于375.04 mg/kg时,吉富罗非鱼成鱼的增重率显著低于其余各组;Twibell等[5]也发现,当饲料胆碱添加量低于230 mg/kg时,黄金鲈幼鱼的增重率显著低于其余各组。这进一步表明饲料中适量添加胆碱有利于鱼体生长,而当饲料胆碱添加不足或添加过量则会影响其他物质的代谢而不利于鱼类正常生长[10]。
本试验以增重率为评价指标,得出初始体重为(57.4±2.5) g的吉富罗非鱼幼鱼获得最佳生长时,对饲料胆碱的需要量为625.42 mg/kg。同样地,都是以罗非鱼为试验对象,黄凯等[10]以生长性能和血液指标为评价指标,得出初始体重为(0.56±0.04) g的奥尼罗非鱼对饲料胆碱的需要量为2 000~3 000 mg/kg;Shiau等[9]以增重率为评价指标,得出初始体重为(0.62±0.01) g的奥尼罗非鱼对饲料胆碱的需要量为1 000 mg/kg;邵辉等[12]以特定生长率为评价指标,得出初始体重为(220.00±8.34) g的吉富罗非鱼对饲料胆碱的需要量为506.43 mg/kg。以上结果与本试验结果不一致,其原因可能与试验用鱼的规格、生长阶段不同有关。鱼的生长阶段不同,对胆碱的需要量也不同;幼鱼期由于代谢快、生长快,因而对维生素的需要量高于成鱼[21]。此外,造成结果差异的原因也可能与饲料含硫氨基酸、甲基供体物质、甜菜碱与胆碱代谢存在着交互作用,导致鱼类胆碱需要量相异有关[9]。
3.2 饲料胆碱水平对大规格吉富罗非鱼幼鱼全鱼、肝胰脏和肌肉常规成分的影响本试验中,随饲料胆碱水平的增加,全鱼粗蛋白质与粗灰分含量差异不显著,水分与粗脂肪含量则差异显著,这与星斑川鲽[16]、异育银鲫[20]、军曹鱼(Rachycentron canadum)[22]和吉富罗非鱼[12]等的研究结果不一致。但有研究表明,饲料添加1 216 mg/kg胆碱显著提高黄金鲈鱼全鱼脂肪含量[5],而添加4 000 mg/kg氯化胆碱则显著降低草鱼全鱼脂肪含量[18]。肌肉是鱼体重要的脂肪沉积部位[23],研究发现,胆碱能够降低黄鳝[24]、草鱼[25]肌肉中脂肪含量。而本试验中,肌肉粗脂肪含量随饲料胆碱水平的增加而增加,这与星斑川鲽[16]、军曹鱼[22]和中华鲟[26](Acipenser sinensis)等的研究结果较为一致。
肝脏脂肪含量通常被看作评价鱼类胆碱营养的指标[16]。有关草鱼[25]、黄鳝[24]、斑点叉尾 [3]与奥尼罗非鱼[10]等的研究表明,肝脏脂肪含量随饲料胆碱水平的增加而呈现下降的趋势。本试验中,试验鱼肝胰脏粗脂肪含量随饲料胆碱水平的增加呈现下降的趋势,说明饲料中添加适量的胆碱可以有效降低肝胰脏脂肪含量,防止脂肪在肝胰脏中的过度蓄积,避免脂肪肝的形成[10]。但在黄金鲈鱼[5]与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[27]上的研究发现肝脏脂肪含量则不受饲料胆碱添加量的影响,而在美国红鱼(Sciaaenops ocellatus)[28]与中华鲟[26]等上研究则发现肝脏脂肪含量与饲料胆碱水平呈正相关。
3.3 饲料胆碱水平对大规格吉富罗非鱼幼鱼血清生化指标及肝胰脏胆碱蓄积量的影响血液中的脂类(血脂)包括TG、T-CHO和游离脂肪酸等,虽然血脂只占全身脂类总量相当少的一部分,但血脂可以转运于机体各组织之间,从而反映出机体内脂类代谢状况[29]。饲料胆碱水平不足时会使合成脂蛋白的原料——磷脂酰胆碱合成量不足,进而引起肝脏脂蛋白合成减少,从而影响脂肪向血液中转运,最终导致脂肪积累和向血液运输的脂肪减少[18]。本试验结果显示,随饲料胆碱水平的增加,肝胰脏粗脂肪含量下降,而血清TG与T-CHO含量升高,这与吉富罗非鱼[12]、草鱼[18]、奥尼罗非鱼[9]及星斑川鲽[16]等研究结果一致,说明饲料中胆碱降低肝脏脂肪含量是通过直接或间接参与肝脏脂肪运输来实现的[10]。
AST和ALT是广泛存在于动物组织细胞线粒体内的重要转氨酶,其血清中活力是反映肝细胞受损伤的主要依据之一[30]。正常情况下的动物体,血清中这2种酶的活力往往较低;当组织异常时会引起细胞膜通透性增加,或当损伤组织部位较大时会引起细胞主动转运体系发生障碍,或细胞解体时,细胞内大量AST和ALT渗入血液,从而使肝脏等组织中转氨酶活力降低,而血液中转氨酶活力则相应升高[31, 32]。本试验中,随饲料胆碱水平的增加,试验鱼血清AST和ALT活力均持续下降,与星斑川鲽[16]、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)[33]等的研究结果一致,表明饲料中胆碱的适量增加能够减轻肝细胞损伤[10]。
鱼类对胆碱需要量的确定,一般以肝脏胆碱蓄积量、肝脏脂肪含量以及生长性能等指标作为评定标准[25]。在本试验中,试验鱼肝胰脏胆碱蓄积量随饲料胆碱水平的增加而增加,但当试验鱼摄食饲料胆碱水平超过1 118.61 mg/kg时,肝胰脏胆碱蓄积量则趋于稳定,这与斑点叉尾 [33]和军曹鱼[21]等的研究结果类似。根据饲料胆碱水平与肝胰脏胆碱蓄积量的关系,经回归分析得出大规格吉富罗非鱼幼鱼肝胰脏胆碱蓄积量最大时,其对饲料胆碱的需要量为1 118.61 mg/kg,以增重率为评价指标时的需要量为625.42 mg/kg。由此可知,与生长相比较,大规格吉富罗非鱼需要更多的胆碱来维持机体的特定生理功能,该结果与在团头鲂[19]、异育银鲫[20]和军曹鱼[22]上的研究发现相一致。
4 结 论在本试验条件下,饲料中添加胆碱可以提高大规格吉富罗非鱼幼鱼的生长性能,改善饲料利用效率,其获得最佳生长时对饲料中胆碱的需要量为625.42 mg/kg;而以肝胰脏胆碱蓄积量为评价指标时,其对饲料中胆碱的需要量为1 118.61 mg/kg。
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