硒(Se)作为机体的一种必需微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的中心元素，因此适量的Se会提高该酶的活力，进而提升机体的抗氧化能力，清除体内因代谢而产生的过量氧离子，对细胞膜起到一定的保护作用^[1]。近几年有研究表明，含Se酶和含Se活性物质等Se不同的功能形式，均可影响到机体的代谢、免疫调节、自由基清除等生理活动^[2]。机体对于肿瘤的抵抗能力主要是来自抗氧化系统的抗氧化能力^[3]，癌症患者因为体内微量元素代谢的失调以及免疫功能的紊乱，机体组织便会因为缺氧、器官衰变而产生大量的自由基与氧负离子，使抗氧化剂的活力受到一定的影响，特别是GSH-Px的表达将受到限制^[2]，当机体内的活性氧自由基(ROS)超过自身清除的能力时，便会使机体进入一种氧化应激状态^[4]，导致机体细胞受到自由基的氧化损伤，从而影响机体正常生理功能。研究认为，GSH-Px可以使过氧化氢、游离的脂质过氧化物发生降解，而Se又是GSH-Px的中心元素，因此Se对提高细胞的抗氧化损伤能力有着非常重要的作用^{[5, 6]}。有试验表明，Se可以减轻黄曲霉毒素B₁(AFB₁)对肝脏脂质过氧化作用的影响，进而缓解由于脂质过氧化作用造成的DNA损伤和AFB₁的基因毒性^[7]。

近几年，在水产养殖动物方面，对Se提高动物机体抗氧化能力的研究也有了一定的报道，例如：陈锋等^[8]将添加Se的饲料饲喂凡纳滨对虾，结果显示对虾血清中超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px活力及总抗氧化能力(T-AOC)等抗氧化指标均有升高趋势；储霞玲等^[9]研究表明，饲料联合添加Se和谷胱甘肽(GSH)后凡纳滨对虾的生长要好于不添加组；田文静^[10]以含酵母硒的饲料饲喂中华绒螯蟹时发现，随着饲料中Se含量的升高，中华绒螯蟹肝胰腺和血清中GSH-Px的活力呈现先升高后降低的趋势，而脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量则是呈现先降低后升高的趋势；李小霞等^[11]使用含有酵母硒的饲料饲喂凡纳滨对虾，结果显示各个试验组对虾肝胰腺中SOD活力、T-AOC均高于对照组，MDA含量均低于对照组，且当饲料中Se含量为0.84 mg/kg时对虾的增重率和特定生长率最大；当海鲈鱼饲料中Se含量达到0.4 mg/kg时其肝脏和血清中GSH-Px的活力最高，且在0～0.4 mg/kg范围内逐渐升高^[12]。以上研究结果表明，饲料中适量的Se可以在一定程度上提高机体的抗氧化能力。

Boonyaratpalin等^[13]研究发现，AFB₁可以使斑节对虾肝胰脏中贮存细胞萎缩，用含100~2 500 μg/kg AFB₁的饲料饲喂8周后，肝胰腺出现病变，先发生萎缩性变化，再伤害小管上皮细胞，导致其坏死，当提高AFB₁浓度时，肝小管则严重退化；有学者在25 μg/kg AFB₁下观察到了肝胰腺的组织病变损害现象，且随AFB₁浓度的升高该损害程度加重^[14]；也有研究表明发病的严重与否和AFB₁的作用剂量、时间有着密切的联系，炎症初期管腔间质中会出现血细胞浸润，进而会发展为纤维变性和组织坏死及其边缘肝小管细胞坏死，并且会改变肝胰脏管道结构，直接影响肝脏的吸收、贮存和分泌功能，结果导致脏器发生严重炎症和萎缩，并失去正常机能^[15]。AFB₁属于肝毒素，可以引起肝癌、肝细胞凋亡等，虾体内ROS的产生可以引起细胞的凋亡，而过氧化氢酶(CAT)、SOD等抗氧化酶可以通过清除ROS来阻止细胞的凋亡；同时，GSH含量常常和细胞凋亡呈负相关，而AFB₁可以降低GSH含量，从而进一步促进细胞的凋亡。AFB₁引发细胞凋亡实质是破坏细胞的膜结构，如近球上皮细胞、肝实质细胞，AFB₁裂解肝脏及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路中的网状细胞，导致细胞缩水、膜水泡等形态变化^[16]。

目前，AFB₁对对虾肝胰腺氧化损伤的研究大都停留在宏观及现象观察水平，对微观水平的病理变化，特别是AFB₁导致对虾肝胰腺氧化损伤的机理研究，迄今为止，国内外尚未见系统研究报道。因此，本试验着重从细胞水平研究AFB₁对凡纳滨对虾肝胰腺细胞抗氧化能力的影响，以便更好地控制AFB₁导致的对虾肝胰腺损伤，同时也力求找到饲料中适宜的Se含量，以缓解AFB₁对对虾的毒性作用。

凡纳滨对虾虾苗购自于河北省沧州市黄骅鑫海生物技术公司，用随机抽样方法选出长势良好且健壮无病、平均体重为(0.30±0.02) g的虾苗，试验开始前将所选凡纳滨对虾放入实验室的水族箱内，以配合饲料作为饲料饲养8周后取肝胰腺细胞离体培养进行试验研究。

M199培养基(Gibco)、胎牛血清(Solarbio)、青链霉素(100×，Solarbio)、AFB₁纯品(Sigma)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、亚硒酸钠、24孔细胞培养板、显微镜、蒸汽灭菌锅、制冰机、超净工作台等。

培养液配制：在9 mL M199培养基中加入1 mL胎牛血清，再加入100 μL青链霉素，0.22 μm滤膜过滤除菌。

不同Se浓度对肝胰腺抗氧化系统的影响：设培养液中Se的浓度梯度为0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 μg/mL，每个浓度设置3个平行，即将每个Se浓度下处理的肝胰腺组织放入3个培养孔，每小时取1次样品进行测定。

Se对AFB₁毒性的缓解作用：设对照组(培养液中仅添加AFB₁)和试验组(培养液中同时添加AFB₁和Se)，培养液中Se浓度为0.45 μg/mL，AFB₁浓度为1 600 μg/L，并分别设置6个不同的时间梯度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)，每个时间设置3个平行。

取个体大、体色透明、活动力强的凡纳滨对虾，体表用75%酒精进行消毒处理，解剖取肝胰腺并去除包膜放入培养皿中，再用适量的PBS清洗3次，加入青链霉素浸泡30 min，剪成小于1 mm³的细胞块，加入少量培养液吹打至细胞团或单个细胞，使用微量移液器向24孔细胞培养板每孔中加4~5滴，然后加入1 mL M199培养基，按照试验设计浓度添加Se或AFB₁后，于28 ℃培养箱中培养^[17]。以上操作均在超净工作台中进行，且均为冰水浴环境。

MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定；CAT活力采用钼酸铵可见光法测定；GSH-Px活力采用二硫代二硝基甲酸法测定，上述指标测定所用试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。

试验结果采用平均值±标准差(mean±SD)表示，数据统计使用SPSS 17.0分析软件，经单因素方差分析(one-way ANOVA)后，若组间差异显著，再采用Duncan氏法进行多重比较，差异显著性水平为P<0.05。

由图1可以看出，不同浓度的Se对MDA含量的影响无显著差异(P>0.05)。Se浓度在0～0.45 μg/mL时MDA含量出现短暂增高后呈现下降趋势，当Se浓度大于0.45 μg/mL后MDA含量又出现回升趋势。

如图2所示，Se浓度在0～0.45 μg/mL之间时，CAT活力随着Se浓度的增加逐渐增加，但Se浓度在0.60～0.75 μg/mL范围内时，CAT活力则呈现出降低走势，且0.75 μg/mL组与0.15～0.60 μg/mL组之间有显著差异(P<0.05)，0.30～0.60 μg/mL组之间无显著差异(P>0.05)，以0.45 μg/mL组CAT活力表现为最高。

如图3所示，Se浓度在0～0.75 μg/mL之间时，GSH-Px活力表现为先升高后降低趋势，当Se浓度为0.45 μg/mL时，GSH-Px活力最高，并显著高于其他的浓度(除0.30 μg/mL)时(P<0.05)，其他浓度间无显著差异(P>0.05)。

图1（Figure 1）

Fig. 1

图1 不同浓度Se对MDA含量的影响 Fig. 1 Effect on the MDA content by different concentrations of Se

图2（Figure 2）

Fig. 2

图2 不同浓度Se对CAT活力的影响 Fig. 2 Effect on the CAT activity by different concentrations of Se

图3（Figure 3）

Fig. 3

图3 不同浓度Se对GSH-Px活力的影响 Fig. 3 Effect on the GSH-Px activity by different concentrations of Se

如图4所示，随着培养时间的增加，未添加Se的对照组MDA含量在0.5～2.0 h内基本呈现增加的趋势，之后趋于稳定，并且在2.0～3.0 h时显著高于0.5 h时(P<0.05)；虽然添加0.45 μg/mL Se的试验组MDA含量在1.0 h时有少量增加，但在0.5～3.0 h内其随培养时间的增加并没有产生显著差异(P>0.05)。

图4（Figure 4）

Fig. 4

图4 MDA含量随培养时间的变化 Fig. 4 The content change of MDA with culture time

如图5所示，随着培养时间的增加，对照组CAT活力表现为逐渐降低的趋势，2.5、3.0 h时显著低于0.5～1.5 h时(P<0.05)；而试验组CAT活力则先表现为逐渐升高的趋势，在2.5 h时活力到达最高值，且与0.50～2.0 h时存在显著差异(P<0.05)，在3.0 h时稍有下降，但与2.5 h时差异不显著(P>0.05)。

图5（Figure 5）

Fig. 5

图5 CAT活力随培养时间的变化 Fig. 5 The activity change of CAT with culture time

如图6所示，随着培养时间的增加，对照组GSH-Px活力表现为逐渐降低，且在3.0 h时显著低于0.5和1.0 h时(P<0.05)；而试验组GSH-Px活力则表现为先增加再降低，在1.5 h时活力到达最高值，但与其他时间点并不存在显著差异(P>0.05)。

图6（Figure 6）

Fig. 6

图6 GSH-Px活力随培养时间的变化 Fig. 6 The activity change of GSH-Px with culture time

机体健康程度的一个重要的评价标准就是其自身抗氧化能力的强弱^[18]。机体拥有一套完整的抗氧化系统，这套防御系统中最主要的便是酶促体系，CAT、GSH-Px又是这一酶促体系中2种主要的抗氧化酶，其活力的高低间接性地影响动物体内或细胞内脂质过氧化作用的最终代谢产物MDA的含量^[19]。因此，抗氧化酶活力的高低可以用来判断机体抗氧化能力的强弱。

Se作为机体的一种必需的微量元素，又是GSH-Px的中心元素，因此适量的Se会提高该酶的活力，从而提升机体的抗氧化能力。王宏伟^[20]在饲料中添加不同浓度的Se来研究其对中华米虾(Caridina denticulata sinensis)抗氧化酶活力的影响，结果显示当饲料中Se浓度为0.45 μg/g时，添加Se组的米虾细胞中SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活力要高于不添加Se组；韦宇^[21]的试验同样表明，饲料中Se浓度达到0.6 mg/kg时，各个试验组凡纳滨对虾细胞中CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活力到达最大值，而此时MDA含量则为最小值。本次试验的结果同样显示，在一定的浓度范围内，Se可以提高细胞中CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活力，并降低细胞脂质过氧化产物MDA的含量，且最适的浓度为0.45 μg/mL，此结果与前人研究结果相符，可以说明饲料中添加适量的Se可提高细胞抗氧化系统的抗氧化能力，进而增强机体的免疫能力。

机体内普遍存在着抗氧化剂和助氧化剂，且两者之间处在动态平衡状态，以维持正常的机体生长发育、免疫竞争、抗应激等生理现象。但是，有报道称，霉菌毒素可以打破这一平衡，当体内摄入霉菌毒素后，肝脏内GSH的含量呈现下降趋势，并且降低助氧化剂的浓度^[22]。研究显示，AFB₁感染体外培养的肝实质细胞致其中毒并导致GSH的消耗^[16]；有人用大鼠做过试验，当大鼠摄入AFB₁并在体内消耗后，其血液中GSH-Px的活力会降低^[23]；同时，当使用2 mg/kg的AFB₁对大鼠进行腹腔注射，测得其肝脏中CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活力都有降低的趋势^[24]；芮小丽等^[25]对肉鸡的研究表明，饲喂含有AFB₁的饲料可以使肉鸡肝脏中MDA的含量显著提高，并且伴随着GSH-Px等抗氧化酶活力的显著降低。本试验中，当加入高浓度的AFB₁后，细胞中CAT、GSH-Px等抗氧化酶活力均有了不同程度的降低，同时脂质过氧化产物MDA的含量却有增加的趋势，可见，此时细胞的抗氧化系统受到了AFB₁毒性的影响。

近年的报道表明，饲料中添加Se后可以减缓AFB₁对动物机体的毒性作用，例如：王钟翊等^[26]研究表明Se对AFB₁具有较好的拮抗作用，可以很好的改善动物的生长性能；符晨星等^[27]指出Se可以通过影响AFB₁在动物机体内代谢的关键酶的活力来改善机体的新陈代谢，从而缓解AFB₁的毒性；郭剑英^[28]同样使用Se来缓解AFB₁对肉鸡的毒性作用，结果显示Se可以使肝组织中的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、CAT等酶的活力升高，使脂质过氧化产物MDA的含量显著下降；Chen等^[29]研究表明，肉鸡饲粮中添加亚硒酸钠后可以阻止因AFB₁诱导而产生的体液免疫功能的损伤，增加法氏囊相对重量以及血清中免疫球蛋白数量，改善组织病理学损伤状况；Parveen等^[30]指出，硒代蛋氨酸可以减缓AFB₁给肾细胞带来的氧化应激压力，当硒代蛋氨酸浓度在1～4 mg/kg之间时，细胞中MAD含量显著减少，同时GSH含量和GSH-Px活力显著增加；芮小丽等^[25]的研究同样表明，在含有AFB₁的饲料中加入适量的Se时，机体的抗氧化酶CAT、GSH-Px等的活力增强且表达增多，MDA的含量降低，机体的抗氧化能力也随之增强。本次试验的结果表明，当加入适量的Se后，随着培养时间的增加，细胞中MDA含量有一定程度的改善，抗氧化酶CAT、GSH-Px的活力得到一定水平的恢复。由此可以推断，适量的Se可以较好的缓解AFB₁对凡纳滨对虾肝胰腺细胞的毒性作用。

随着Se的营养价值被人类发现之后，对其的研究愈发深入，特别是在关于动物黄曲霉毒素中毒防治方面，由于GSH-Px的活力中心为硒半胱氨酸，同时又是细胞膜上一种重要的酶，因此Se可能通过对GSH-Px活力的影响来保护细胞膜的完整性与流动性，同时降低或消除AFB₁对细胞的毒性，保护肝细胞膜结构及功能免遭AFB₁的损害^[31]；同时，GSH-Px作为细胞内酶性抗氧化系统的主要成分，可催化过氧化脂质分解，防止脂质过氧化作用所引起的链式反应，减少脂质过氧化产物对机体的损害。因此，通过添加外源Se可以提高凡纳滨对虾机体对于AFB₁毒性的缓解，并增强其抗氧化系统的抗氧化能力，修复毒素的损伤，上述研究结论无论是在理论指导上还是在实践养殖中都具有很好的意义。

适量的Se可以改善凡纳滨对虾肝胰腺细胞的抗氧化能力，且最适的浓度为0.45 μg/mL；同时，0.45 μg/mL的 Se可以使得经AFB₁侵染的肝胰腺细胞中CAT、GSH-Px等抗氧化酶活力得到一定水平的恢复，并在一定程度上改善细胞中MDA含量，缓解AFB₁对细胞的毒害。