核黄素(即维生素B2)是动物必需的一种水溶性维生素，在体内以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的组分形式存在。而FMN和FAD是体内许多氧化还原酶(如黄素蛋白酶)的辅基，广泛参与体内各种氧化还原反应，起到递氢的作用。因此，核黄素能促进糖、脂肪和蛋白质的代谢，对维持皮肤、黏膜和视觉的正常机能均有一定作用。当饲料中核黄素供应不足时，鱼体会出现缺乏症。鱼类缺乏核黄素后的症状不尽相同，仅有的共同症状为生长不良和厌食，其他的一些缺乏症状为特定研究对象所特有，包括高死亡率、游泳不协调、畏光、白内障、触鳍、短体和皮肤颜色变黑等[1]。
截至目前，国内外已有不少学者对鱼类核黄素的需要量进行了研究工作，鲤鱼(Cyprinus carpio)[2]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[2-4]、奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)[5]、杂交罗非鱼(Oreochromis mossambicus×Oreochromis niloticus)[6]、斑点叉尾 (Ictalurus punctatus)[7]、黄尾 (Seriola quinqueradiata)[8]、杂交条纹鲈(Morone chrysops×Morone saxatilis)[9]、大黄鱼(Pseudosciaena crocea R.)[10]、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)[10]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[11]和宝石鲈(Scortum barcoo)[12]等的核黄素需要量已被确定，其需要量在2.7~11.0 mg/kg。D-氨基酸氧化酶(D-AAO)是一种以FAD为辅基的典型黄素蛋白酶，可氧化D-氨基酸的氨基生产相应的酮酸和氨[13]。在鱼类的肝胰脏中，该酶具有较高的活力，且其活力与核黄素有密切关系，因此，肝胰脏中D-AAO活力被认为是评价鱼类核黄素需要量的敏感指标[14]。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)作为我国传统的四大家鱼之一，其养殖产量位居淡水鱼类之首，在水产养殖业中占有重要地位。本试验以草鱼幼鱼为对象，研究饲料中核黄素含量对其生长性能、肝胰脏中D-AAO与肠道中消化酶活力及体成分的影响，旨在探讨草鱼幼鱼对饲料中核黄素的需要量，以期为提升草鱼配合饲料的开发技术提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验饲料本试验以无维生素酪蛋白和明胶为蛋白质源，鱼油及玉米油为脂肪源，糊精为糖源配制成基础饲料(表 1)。在每千克基础饲料中分别添加0、2、4、6、10和20 mg的核黄素(Sigma，美国)，共配制6种等氮等能的纯化饲料。经高效液相色谱法[15]实测饲料中核黄素含量分别为0.54、2.32、4.08、5.78、9.28和19.35 mg/kg。试验饲料制作时，先将原料充分粉碎，全部能通过60目筛，再按配方比例配制，用搅拌机充分混匀，加适量水，用绞肉机挤压成径粒为1.2 mm的长条，在常温下风干，最后再制成粒径为0.5~1.2 mm的颗粒料，置-20 ℃冰柜中备用。
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表 1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
养殖试验在室内流水养殖系统中进行。试验用鱼为自行培育的苗种，先用基础饲料(不添加核黄素)驯养2周后再挑选体格健壮、大小均匀、初始均重为(11.21±0.16) g的草鱼幼鱼360尾，随机放养到18个圆柱形玻璃钢水槽中，每只水槽放鱼20尾，内盛水200 L，每种试验饲料饲喂3个水槽，试验期为8周。早(09:00)、晚(15:00)各投喂1次，日投喂量为鱼体重的4%~6%，视摄食和幼鱼生长情况作适当调整。整个饲养期间采用流水养殖，每个水槽水流量约为1.0 L/min，水温25~30 ℃，pH 7.3~7.6，溶解氧浓度6.2~7.4 mg/L，氨氮浓度0.05~0.10 mg/L，亚硝酸盐氮浓度0.02~0.07 mg/L。
1.3 样品采集及分析试验结束后停喂24 h，然后称量各水槽内的鱼总重和记录剩余尾数，并从各水槽内随机取5尾用于全鱼营养成分分析。剩余鱼逐一测量体长和体重后，置冰盘上解剖取其内脏、肝胰脏及全肠，用于计算脏体比、肝体比及肥满度等指标；保留肝胰脏及全肠样品，剔除脂肪和肠道内容物，置-70 ℃冰箱中保存，用于测定肝胰脏中D-AAO及全肠中消化酶活力。
试验饲料和全鱼营养成分测定参照AOAC(1984)[16]的方法进行：105 ℃常压干燥法测定水分含量；凯氏定氮法测定粗蛋白质含量；用无水乙醚为溶剂，索氏抽提法测定粗脂肪含量；箱式电阻炉550 ℃灼烧法测定粗灰分含量。
解冻肝胰脏和全肠，用滤纸吸干水分后称重，加入10倍的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，用玻璃匀浆器在冰浴中手工匀浆。随后在4 ℃下10 000 r/min离心10 min，获得的上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中待用。D-AAO活力参照Nagata等[17]的酮酸法测定，定义为：在pH 8.3、37 ℃条件下，每克组织蛋白质中每分钟生成1 μmol的丙酮酸为1个活力单位(U)，以U/g prot表示。蛋白酶活力采用福林试剂法[18]测定，定义为：在pH 7.5、37 ℃条件下，每分钟酶解酪蛋白生成1 μg酪氨酸为1个活力单位(U)，以U/mg prot表示。淀粉酶活力采用Bernfeld法[19]测定，定义为：在pH 6.9、25 ℃条件下，每分钟酶解可溶性淀粉生成1 μmol麦芽糖为1个活力单位(U)，以U/mg prot表示。脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，定义为：在37 ℃条件下，每分钟酶解1 μmol底物为1个活力单位(U)，以U/g prot表示。粗酶液中蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝法[20]，以牛血清白蛋白为基准物。
1.4 计算公式
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试验数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若差异显著再采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著。以增重率及肝胰脏中D-AAO活力为评价指标进行折线回归模型分析，确定草鱼幼鱼对饲料中核黄素的需要量。
2 结果与分析 2.1 饲料中核黄素含量对草鱼幼鱼生长性能、饲料效率及形体指标的影响投喂核黄素含量为0.54和2.32 mg/kg饲料 的草鱼幼鱼，在养殖中后期出现游泳失调、不正常抽搐，继而死亡，且摄食差、生长相对缓慢。由表 2可知，随着饲料中核黄素含量的升高，草鱼幼鱼的成活率先显著升高(P<0.05)，后趋于稳定(P>0.05)。增重率、特定生长率及饲料效率均随着饲料中核黄素含量的增加而呈现出先升高后稳定的趋势，且当饲料中核黄素含量为5.78 mg/kg及以上时，以上指标均无显著变化(P>0.05)。以核黄素含量为5.78 mg/kg时肝体比最大，其值显著高于0.54 mg/kg组(P<0.05)。饲料中核黄素含量对草鱼幼鱼的脏体比和肥满度无显著影响(P>0.05)。以增重率为评价指标，应用折线回归模型分析得出草鱼幼鱼对饲料中核黄素的需要量为5.54 mg/kg(图 1)。
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表 2 饲料中核黄素含量对草鱼幼鱼生长性能、饲料效率及形体指标的影响 Table 2 Effects of dietary riboflavin content on growth performance,feed efficiency rate and body profile indices of juvenile grass carp |
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图 1 饲料中核黄素含量与草鱼幼鱼增重率的关系 Figure 1 Relationship between dietary riboflavin content and WGR of juvenile grass carp |
由表 3可知，草鱼幼鱼肝胰脏中D-AAO与肠道中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力均随饲料中核黄素含量的增加呈先升高后稳定的趋势，当饲料中核黄素含量为5.78 mg/kg时，以上酶活指标均达到最大值。以肝胰脏中D-AAO活力为评价指标，应用折线回归模型分析得出草鱼幼鱼对饲料中核黄素的需要量为5.99 mg/kg(图 2)。
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表 3 饲料中核黄素含量对草鱼幼鱼肝胰脏中D-AAO及肠道中消化酶活力的影响 Table 3 Effects of dietary riboflavin content on hepatopancreas D-amino acid oxidase and intestinal digestive enzyme activities of juvenile grass carp |
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图 2 饲料中核黄素含量与草鱼幼鱼肝胰脏中D-AAO活力的关系 Figure 2 Relationship between dietary riboflavin content and hepaticpancreas D-AAO activity of juvenile grass carp |
由表 4可知，饲料中核黄素含量对草鱼幼鱼全鱼水分、粗蛋白质、粗脂肪及粗灰分含量均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 饲料中核黄素含量对草鱼幼鱼体成分的影响 Table 4 Effects of dietary riboflavin content on body composition of juvenile grass carp |
本试验中核黄素缺乏的草鱼幼鱼出现了厌食及生长相对缓慢的症状，这与已报道的大多数鱼类研究结果[1]相一致，该结论进一步证实了生长不良和厌食可能为鱼类核黄素缺乏的典型症状。核黄素以FMN及FAD形式广泛参与体内各种氧化还原反应，当其缺乏时，会影响糖、脂肪和蛋白质的代谢，从而可能影响鱼类的摄食和生长。在养殖中后期，草鱼幼鱼出现游泳失调、不正常抽搐，继而引发死亡，类似症状曾在虹鳟[4]中有过报道，其他诸如畏光、白内障、触鳍、短体和皮肤颜色变黑等症状尚未在本试验中发现，这可能与鱼的种类、规格和试验条件的不同有关。
草鱼幼鱼核黄素缺乏导致生长不良同时引起饲料效率下降和死亡率升高，类似结果在鲤鱼[2]、虹鳟[2-4]和杂交条纹鲈[9]的研究中也有报道。本试验得出草鱼幼鱼获得最佳生长时对饲料中核黄素的需要量为5.54 mg/kg，这与研究得出的宝石鲈(5.73 mg/kg)[12]的最佳生长需要量相近，略高于异育银鲫(3.76 mg/kg)[11]、杂交条纹鲈(4.10 mg/kg)[9]、斑点叉尾 (4.30 mg/kg)[7]及鲈鱼(4.89 mg/kg)[10]的最佳生长需要量，略低于大黄鱼(6.23 mg/kg)[10]的最佳生长需要量。鱼类生长所需的核黄素量可能与品种、规格、试验条件及评价指标等因素有关。此外，Serrini等[7]还认为合适的饲料营养组成能够降低鱼类对核黄素的需要量。
D-AAO作为一种黄素蛋白酶，其活力已被很多研究者用于确定鱼类核黄素的需要量[4-5, 7, 9-12]。 本试验中，饲料核黄素含量显著影响了草鱼幼鱼肝胰脏中D-AAO活力，并且较好地符合折线模型，这说明肝胰脏中D-AAO活力是评价草鱼幼鱼核黄素需要量的敏感指标。该结果与虹鳟[4]、奥利亚罗非鱼[5]、斑点叉尾 [7]、杂交条纹鲈[9]、鲈鱼[10]、大黄鱼[10]、异育银鲫[11]及宝石鲈[12]的研究结果相一致。D-AAO具有广泛的底物特异性，除了酸性氨基酸D-谷氨酸和D-天门冬氨酸外，能使其他所有的D-氨基酸发生不同程度的氧化脱氨作用，从而完成氨基酸代谢[13]。当饲料中核黄素缺乏时，以FAD为辅基的D-AAO参与的氧化脱氨反应将会受阻，进而影响到鱼类的正常代谢。本试验中草鱼幼鱼生长趋势与肝胰脏中D-AAO活力变化趋势基本一致，这可能是饲料核黄素含量对肝胰脏中D-AAO活力产生影响后间接影响到了草鱼幼鱼的生长。
肠道在无胃鱼的营养消化和吸收中扮演着重要角色，而其消化能力与消化酶活力密切相关[21]。草鱼作为无胃鱼，本试验特此研究了饲料核黄素含量对草鱼幼鱼肠道中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力的影响。截止目前，仅有Li等[22]在建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)的研究中有相关报道，本试验研究结果基本与其一致，即随着饲料中核黄素含量的增加，肠道中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力均先升高而后趋于稳定。Li等[22]认为这可能是核黄素含量增加导致鱼体肝胰脏生长和发育的结果，因为对于大多数鱼类来说都不存在腺窝，其消化酶均产自于肝胰脏，故而消化酶活力与肝胰脏的生长和发育是密切相关的，本试验中草鱼幼鱼肝体比随饲料中核黄素含量的增加先升高后趋于稳定也印证了此点。水产动物对食物的消化主要是依赖消化酶的催化分解作用，因而消化酶活力直接影响到饲料的转化效率，进而影响鱼体的生长[23]。本试验中草鱼幼鱼肠道中3种消化酶的活力变化趋势与生长趋势基本一致，这可能是饲料核黄素含量对消化酶产生影响后间接影响到了草鱼幼鱼的生长。
4 结 论在本试验条件下，饲料中核黄素含量可以提高草鱼幼鱼的生长性能，改善饲料利用效率，其获得最佳生长时对饲料中核黄素的需要量为5.54 mg/kg，而以肝胰脏中D-AAO活力为评价指标时，其对饲料中核黄素的需要量为5.99 mg/kg。
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