在饲料可消化养分含量的估测模型中，定标样品的选择直接影响估测模型的准确性与估测精度^[1]。因此，建立定标样品的选择依据非常重要。目前，在饲料有效能值估测方程的建模中，人们通常随机采集一定数量的样品，在获得了饲料原料的化学成分数据集与有效能的实测数据后，通过逐步回归建立有效能值的估测模型^[2-3]。这种建模方法可能会出现因定标样品库自变量或因变量的变异幅度小而影响模型的估测精度及稳定性^[4-5]。同时，也可能出现因定标样品的变异程度不一致，而使不同学者针对同种饲料原料有效能值的估测模型在估测因子及权重上差异较大^[6]。根据回归分析的基本原则，自变量或因变量的水平变异应呈等差距设置^[7]，考虑到生物学法能检测到饲粮处理间鸡代谢能值的差异一般为0.21~0.42 MJ/kg的经验^[8]，本研究假设从23个玉米干酒糟及其可溶物 (dried distiller’s grains with solubles, DDGS)(定义为全样品库) 中以酶水解物能值 (enzymatic hydrolyzate gross energy，EHGE) 相差0.21 MJ/kg左右的尺度选择的9个定标玉米DDGS (定义为选择性样品库，剩余的14个玉米DDGS样品定义为非选择性样品库) 在化学成分的变异、化学成分对EHGE的回归关系上可以代表 23个玉米DDGS的特性。为此，本研究通过比较选择性样品库与非选择性样品库在化学成分上的显著性差异与变异程度，以全样品库的主成分分析比较选择性样品库与非选择性样品库在第一、二主成分上的分布差异，以及比较以化学成分对EHGE的估测关系在选择性样品库与全样品库的一致性，探讨以饲料EHGE作为有效能值估测模型中定标样品的选择依据是否可行。

1 材料与方法 1.1 饲料原料

采集来源于美国以及我国山东、河南、安徽、吉林、黑龙江等地的玉米DDGS样品23个。采用四分法取样后分为2份，一份用万能粉碎机粉碎并过40目筛，用于化学成分检测；另一份粉碎后过60目筛，用于EHGE的测定。所有样品采用抽真空-充氮气密封，-20 ℃保存备用。玉米DDGS的来源及其化学成分见表 1。

1.2 试验设计

将23个玉米DDGS样品 (全样品库) 的EHGE (EHGE极差为2.39 MJ/kg) 从低到高排列，按梯度相差0.21 MJ/kg左右的尺度选择9个定标玉米DDGS样品，定义为选择性样品库；将剩余14个玉米DDGS样品定义为非选择性样品库。首先统计全样品库、选择性样品库、非选择性样品库的化学成分含量及变异系数，并比较选择性样品库与非选择性样品库化学成分的差异显著性。然后对23个玉米DDGS样品的化学成分及EHGE进行主成分分析，检验选择性样品库与非选择性样品库的第一、二主成分得分是否重叠。最后，分别建立全样品库 (23个玉米DDGS样品) 和选择性样品库 (9个定标玉米DDGS样品) 的化学成分与EHGE之间的回归模型，以此2个模型计算非选择性样品库的EHGE，比较两者之间的差异显著性。综合上述统计分析检验基于EHGE选择的9个定标玉米DDGS样品是否可以代表 23个玉米DDGS样品的变异情况。

1.3 测定指标及方法

按GB/T 6435—2014^[9]测定样品的水分并计算其干物质含量，并根据ISO 9831:1998的规定测定饲料样品及经仿生消化系统消化后未水解残渣的总能 (GE)。饲料样品的粗蛋白质 (CP)、粗灰分 (Ash)、粗脂肪 (EE)、粗纤维 (CF)、中性洗涤纤维 (NDF)、酸洗涤纤维 (ADF) 含量分别按照GB/T 6432—1994^[10]、GB/T 6438—2007^[11]、GB/T 6433—2006^[12]、GB/T 6434—2006^[13]、GB/T 20806—2006^[14]、NY/T 1459—2007^[15]进行测定。EHGE的测定参照赵峰等^[16]关于单胃动物仿生消化系统 (SDS-2) 测定鸡饲料EHGE的操作过程进行。透析袋的型号与前处理、胃缓冲液、小肠前段缓冲液、小肠后段缓冲液及模拟消化液的制备按照《鸡饲料酶水解物能值测定技术规程》进行制备。

1.4 数据处理与统计分析

以SAS 9.3的MEANS模块对全样品库、选择性样品库、非选择性样品库中玉米DDGS化学成分的基本统计量进行计算。根据2样本均值差异显著性的统计原理，以TTEST模块对选择性样品库与非选择性样品库的各化学成分含量差异显著性进行检验。以PRINCOMP模块对全样品库的化学成分进行主成分分析，得出第一、二主成分组成的特征向量及选择性样品库与非选择性样品库样品主成分得分，并通过Simca-P 11.5作特征向量与主成分得分载荷图。以REG模块的Stepwise选项对选择性样品库与全样品库样品的化学成分对EHGE进行逐步回归，分别建立以化学成分估测EHGE的模型，命名为模型1、模型2。根据上述模型计算非选择性样品库玉米DDGS的EHGE，以MEANS模块比较2个模型EHGE计算值的差异。

2 结果与分析 2.1 选择性样品库与非选择性样品库玉米DDGS化学成分含量的差异与变异

由表 2可见，在由23个玉米DDGS样品组成的全样品库中，根据EHGE分成的选择性样品库和非选择性样品库的玉米DDGS在CP、Ash、EE、CF、NDF、ADF含量及EHGE平均值上均无显著性差异 (P>0.05)。在各化学成分含量的变异上，选择性样品库和非选择性样品库的玉米DDGS在CP、Ash、EE、CF、ADF、NDF、GE、EHGE的方差上无显著性差异 (P>0.05)。

2.2 选择性样品库与非选择性样品库玉米DDGS化学成分含量的主成分分析及得分分布

由图 1、图 2可见，由23个玉米DDGS样品的CP、Ash、EE、CF、NDF、ADF、GE及EHGE获得的第一、二主成分对总变异的贡献分别为51.97%和19.89%，两者累计占总变异的71.86%。第一主成分中，EE、EHGE、CF、GE为主要权重因子。第二主成分中，Ash、ADF、NDF为主要权重因子。选择性样品库 (n=9) 和非选择性样品库 (n=14) 在第一、二主成分得分载荷上，选择性样品库中仅1个样品 (B23) 在95%的置信区间外，得分散点图显示选择性样品库和非选择性样品库未出现明显的分组，因此，2组样品在化学成分的总体变异上是类似的。

2.3 全样品库与选择性样品库玉米DDGS化学成分含量对EHGE估测模型的差异

在23个玉米DDGS组成的全样品库中，Ash、EE含量及GE与EHGE呈显著或极显著正相关关系 (P < 0.05或P < 0.01)，而CP、CF、NDF含量与EHGE呈显著或极显负相关关系 (P < 0.05或P < 0.01)。而由9个玉米DDGS组成的选择性样品库中，CP含量与EHGE呈显著负相关关系 (P < 0.05)，EE含量、GE均与EHGE呈极显著正相关 (P < 0.01)，其他化学成分含量与EHGE相关性较低。由于Ash含量与EHGE呈简单正相关关系不符合营养学的基本原理，因此，排除Ash后通过玉米DDGS化学成分组成对EHGE的逐步回归分析得出，选择性样品库的玉米DDGS的回归模型 (模型1) 为EHGE=(3 566+53.94×EE-32.68× NDF)×4.184/1 000 (R²=0.798 1，RSD=0.43 MJ/kg)，全样品库的玉米DDGS的回归模型 (模型2) 为EHGE=(3 742+29.67×EE-29.71×NDF)×4.184/1 000 (R²=0.535 0，RSD=0.44 MJ/kg)。2个模型中，估测因子相同。

由表 4可见，为了进一步比较2个EHGE估测模型的等效性，以非选择样品库为对象计算各样品的EHGE。结果表明，由模型1、2计算的EHGE平均值分别为13.68和13.61 MJ/kg，差异不显著 (P>0.05)。由模型1获得的EHGE计算值与实测值平均相差0.47 MJ/kg。除了B24号样品外，单个样品相差都在0.69 MJ/kg以内。由模型2获得的EHGE计算值与实测值平均相差0.33 MJ/kg。除了B24号样品外，单个样品的计算值与实测值相差在0.62 MJ/kg以内。模型1、2的估测标准误 (SEP) 分别为0.56和0.39 MJ/kg (排除B24号样品外，SEP=0.45和0.34 MJ/kg)。上述统计结果表明，2个模型在估测玉米DDGS的EHGE的准确性上是类似的。

3 讨论 3.1 估测模型中定标样品的选择依据

在对饲料原料某一化学成分含量建立估测模型时，选择合适的定标样品不仅可以减少工作量，而且还能提高所建估测模型的精度和通用性^[18]。在近红外光谱法估测饲料化学成分的建模 (GB/T 18868—2002) 中，定标样品的选择或依据光谱的每一主成分得分最大值和最小值选取定标样品，或依据光谱聚类分析后样品间Mahalanobias距离相差0.6以上选取定标样品^[19]。该原则选择定标样品实质上是根据多元统计分析自变量间的内在关系以降维的手段表达样品集所有自变量的整体变异，可以排除定标样品库在某一区间范围内样品数量过度集中的问题。因此，从理论上是具有很好的代表性。赵峰^[20]在建立鸭对玉米代谢能值的估测模型中，为了使定标样品具有较好的代表性，在调查了427个玉米概略养分的基础上，以玉米及玉米加工副产物拟合了30个定标样品，并使定标样品集在概略养分的正态分布上与427个玉米类似。通过该定标样品集建立以EHGE或概略养分估测的代谢能模型达到了满意的效果。然而，以该原则建立的定标样品集虽然考虑了某一化学成分的分布概率，但未考虑样品化学成分间的相关关系。Meloche等^[21]在建立肉鸡 (10~18日龄) 对低油玉米DDGS代谢能值的估测模型中，虽然根据样品的EE范围 (3.15%~13.23%) 选择了15个定标样品，但是，仍出现了2个样品集中的区域 (EE含量在9.6%~10.8%的样品占6个，11%~12%的样品占4个)。并且，通过该原则选择样品，并未考虑其他化学成分的变异范围是否具有代表性。本试验中，以EHGE作为玉米DDGS定标样品的选择依据，由于其与化学成分有显著的相关性，通过控制样品集EHGE的变异就可以间接地控制化学成分的变异。此外，从选择性样品库与非选择性样品库化学成分的差异不显著这一统计结果也表明，通过EHGE选择的定标样品在化学成分的差异上与未入选的样品是类似的，从而可以排除相似性样品进入定标样品库中。因此，以EHGE为指标选择玉米DDGS的定标样品具有可行性。

3.2 定标样品代表性的判别

样本的代表性指所选择的样本与样本总体在化学成分含量和生物学效应等方面的相似度。一般从统计分析的角度比较选择的样品集在考察指标符合同一概率分布的前提下，平均值、方差是否与样品总体相等来判别样品的代表性^[20]。近年来，人们通过对不同来源的样品进行主成分分析，根据样品在第一、二主成分得分的载荷图直观地表述样品集是否出现分离，从而判断哪些样品属于同一类或哪些是异常样品^[22-23]。因此，该方法也可以作为判断定标样品是否具有代表性的参考依据。本研究中，选择性样品库与非选择性样品库在化学成分、EHGE的方差及平均值上均无显著性差异，并且在化学成分的第一、二主成分得分载荷分布上，2个样品库也是重叠的。这表明，选择性样品库在化学成分的含量及变异上可以代表非选择性样品库，因此，可以以选择性样品库作为定标样品。在选择性样品库与非选择性样品库化学成分含量的内在关系上，由选择性样品库建立的化学成分含量对EHGE的估测模型与通过全样品库建立的化学成分对EHGE的估测模型计算的非选择性样品库的EHGE无显著性差异，这表明选择性样品库化学成分与EHGE的内在关系也可以代表非选择性样品库。综合上述3个方面，表明通过EHGE的梯度差选择玉米DDGS定标样品具有满意的代表性，因此，可以此作为定标样品库。

4 结论

利用玉米DDGS样品之间EHGE相差0.21 MJ/kg左右的原则选择的样品组成的定标样品库在化学成分的含量与变异、化学成分含量与EHGE的相关性上能够代表全样品库。因此，根据EHGE选择玉米DDGS有效能估测模型中的定标样品是可行的。