胆碱是人类、畜禽以及水产动物生长发育必需的有机化合物，在体内主要以卵磷脂、溶血卵磷脂、磷酸胆碱、神经胆碱等形式存在，在维持细胞膜完整性及甲基代谢途径等方面起着重要作用。在家兔上，已有研究发现饲粮中添加氯化胆碱可以增强家兔的免疫力，提高毛皮品质，提高日增重和饲料转化效率[1]。除促生长作用外，胆碱对畜禽的脂肪代谢也有重要的调节作用。在大鼠[2]、鹅[3]、肉鸡[4]和乳牛[5]上的研究发现，饲粮中胆碱缺乏时，肝脏合成甘油三酯(TG)的能力超过了脂蛋白的合成与运输能力，从而导致多余的TG在肝脏中累积，加剧了脂肪肝的发生[2-5]。胆碱影响机体脂肪代谢主要是通过磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶(PEMT)实现的。卵磷脂是动物细胞膜的主要成分，而脂肪酸则是合成细胞膜磷脂的主要基底物质，在肝脏内，胆碱负责合成大约70%的卵磷脂，PEMT途径合成近30%的卵磷脂，但PEMT敲除的小鼠中，PEMT途径合成的卵磷脂减少，使过多的脂肪酸用于合成TG，从而导致脂肪累积，当补充胆碱后使脂肪酸合成卵磷脂和TG的过程得到重新分配，改善了肝脏内脂肪的异常累积[6]。獭兔是一种皮肉兼用兔，从出生到3月龄是以增加体重为主，从3月龄到5月龄则生长速度变慢，以毛皮的熟化为主，在此阶段，獭兔的免疫机能已经基本完善，食欲旺盛，采食量增加，体内脂肪积累增加，易发脂肪肝，同时也造成了能量的浪费，在饲粮中添加胆碱能否改善3~5月龄獭兔肝脏内脂肪含量目前尚未知晓。鉴于此，本试验拟通过在饲粮中添加不同水平的氯化胆碱，研究3~5月龄獭兔肝脏内脂肪代谢的变化，确定胆碱调节家兔肝脏内脂肪代谢的机制。
1 材料与方法 1.1 试验动物及饲养管理选取体重[(1 951±125) g]相近的3月龄獭兔200只(公母各占1/2)，随机分为5组(每组40个重复，每个重复1只)，分别饲喂在基础饲料基础上添加0(对照)、200、400、600和800 mg/kg的50%氯化胆碱(折算为胆碱的添加水平后分别为0、87、174、261和348 mg/kg)的试验饲粮，试验饲粮实测胆碱水平分别为812、902、993、1 086和1 170 mg/kg。试验用50%氯化胆碱购自特明科氯化胆碱(上海)有限公司，基础饲粮参考De Blas等[7]的生长兔饲养标准配制而成，其组成及营养水平见表 1。试验兔单笼饲养，试验期间每天饲喂2次。采用常规饲养管理和免疫程序，自然采光和通风，自由采食和饮水。预试期7 d，正试期53 d。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验结束后每组随机选取8只兔，心脏采血，室温避光静置15 min后，3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-20 ℃下冷冻保存；屠宰后分离肝脏和背腰最长肌处肌肉组织样品，用液氮冷冻后，与-70 ℃冰箱中保存待测。
1.3 测定指标与方法血清中生长激素(GH，XY-10032)、瘦素(LEP，XY-10065)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1，XFFM1880) 含量测定应用竞争性放射免疫分析法，采用相应的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自上海信帆生物科技研究所)，在Biotek ELX808超级酶标仪上完成。
血清中极低密度脂蛋白(VLDL，H249)、TG(F001-1) 含量及肝脂酶(HL，A067) 和脂蛋白脂酶(LPL，A067) 活性采用相应的ELISA试剂盒测定(购于南京建成生物工程研究所)。血清中总脂酶(TE)活性为HL和LPL活性之和，即TE=HL+LPL。
脂肪酸含量测定：将待测样品切碎，称取1.0 g左右，置于10 mL具塞玻璃试管中，再加入2 mL的苯与石油醚的等体积混合液，浸提12 h；然后再加入2 mL 0.4 mol/L的氢氧化钾甲醇溶液，进行甲酯化；充分摇匀混合后静置15 min，用移液器沿瓶壁转动玻璃管缓缓加入蒸馏水，使液面上升至瓶口处，取上清液待测，如果出现浑浊可加入几滴无水乙醇。利用岛津GC-2014型气相色谱测定脂肪酸组成，各种主要脂肪酸的相对含量采用面积归一法计算，其定性采用与标准品保留时间对比来判定。标准品购买于美国NU-CHEK公司，共包含C14 : 0~C22 : 6等共16种脂肪酸甲酯。
肝脏总RNA的提取及实时荧光定量RCR：Trizol法提取样品总RNA，将提取的总RNA反转录为cDNA，所用的试剂盒均由TaKaRa提供。使用大连宝生物有限公司提供的试剂盒(DRR041A)，采用SYBR Green Ⅰ染料法，在美国ABI7500荧光定量RCR仪上进行实时荧光定量PCR。引物序列见表 2。数据采用用2-ΔΔCT法分析。目的基因的mRNA用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA标准化(ΔCT)。在CT值的基础上，GAPDH mRNA的表达量在整个试验阶段是稳定的(P>0.10)。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
试验数据采用SAS 8.0统计软件的ANOVA程序进行单因素方差分析，如果处理效应差异显著(P < 0.05)，采用Duncan氏法进行多重比较，数据以平均值和均方根误差(R-MSE)表示，P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮中胆碱添加水平对3~5月龄獭兔肝脏脂肪酸组成的影响由表 3可知，饲粮中添加不同水平的胆碱对獭兔肝脏中饱和脂肪酸(SFA)的含量没有显著影响(P>0.05)，但对肝脏中单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)的含量有显著影响(P < 0.05)。肝脏中MUFA的含量随胆碱添加水平的增加呈先升高后降低的趋势，在261 mg/kg胆碱添加组达到最大值，在348 mg/kg胆碱添加组达到最小值；而肝脏中PUFA的含量随胆碱添加水平的增加则呈先降低后升高的趋势，在261 mg/kg胆碱添加组达到最小值，在348 mg/kg胆碱添加组达到最大值。与对照组相比，饲粮中添加348 mg/kg的胆碱显著降低了肝脏中C16 : 1的含量(P < 0.05)，却显著增加了C18 : 2的含量(P < 0.05)；与对照组相比，饲粮中添加174、261 mg/kg的胆碱显著增加了肝脏中C18 : 1的含量(P < 0.05)。
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表 3 饲粮中胆碱添加水平对3~5月龄獭兔肝脏脂肪酸组成的影响 Table 3 Effects of choline supplemental level on fatty acid composition in live of 3-to 5-month-old Rex rabbits (n=8) |
由图 1可知，与对照组相比，饲粮中添加87、174、261和348 mg/kg的胆碱显著增加血清中IGF-1和LEP的含量(P < 0.05)；与对照组相比，饲粮中添加174和261 mg/kg的胆碱显著增加血清中GH的含量(P < 0.05)。饲粮中添加不同水平的胆碱对獭兔血清中TG含量及HL和TE活性的影响不显著(P>0.05)；与对照组相比，饲粮中添加261和348 mg/kg的胆碱显著增加血清中LPL的活性和VLDL的含量(P < 0.05)。
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数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。 Date columns with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below. 图 1 饲粮中胆碱添加水平对3~5月龄獭兔血清脂肪代谢物含量及相关酶活性和激素含量的影响 Figure 1 Effects of choline supplemental level on metabolin, hormone and enzyme contents/activities involved in lipid metabolism in serum of 3-to 5-month-old Rex rabbits (n=8) |
由图 2可知，饲粮中添加不同水平的胆碱对獭兔肝脏中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA表达水平的影响不显著(P>0.05)；与对照组相比，饲粮中添加261 mg/kg的胆碱显著提高肝脏中肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)mRNA的表达水平(P < 0.05)。
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图 2 饲粮中胆碱添加水平对3~5月龄獭兔肝脏脂肪代谢相关基因表达的影响 Figure 2 Effects of choline supplemental level on gene expression involved in lipid metabolism in liver of 3-to 5-month-old Rex rabbits (n=8) |
胆碱能够提供不稳定的甲基供体，在动物脂肪沉积的调控中起着尤为重要的作用，以降低肝脏脂肪含量的作用最为明显。研究报道，饲粮中添加胆碱可以降低肉仔鸡肝脏脂肪含量[8-9]。本试验中，饲粮中添加174和261 mg/kg胆碱后显著增加了獭兔肝脏中MUFA的含量(主要是通过增加C16 : 1和C18 : 1的含量)，却显著降低了肝脏中PUFA的含量(主要是通过降低C18 : 2的含量)，暗示胆碱能促进PUFA向MUFA转化，说明胆碱影响獭兔的肝脏脂肪酸组成。此外，胆碱对獭兔肝脏脂肪酸代谢的影响可能是通过CPT1实现的。CPT1是家兔脂肪酸氧化的限速酶，在本试验中发现，饲粮中添加261 mg/kg胆碱后显著增加了肝脏中CPT1 mRNA的表达水平，说明胆碱可以增加肝脏脂肪酸的β氧化过程，主要机制可能是胆碱提供以S-腺苷蛋氨酸为活性的甲基供体，间接参与肉碱的合成，调节体内的肉碱平衡，进而影响机体细胞内脂肪酸氧化，促进机体内脂肪酸的分解代谢[10]。ACC是催化脂肪酸合成第1步反应的限速酶，关于胆碱对獭兔ACC活性影响的研究尚未报道。本试验结果表明，饲粮中添加胆碱獭兔对肝脏ACC mRNA表达水平的影响不显著，说明胆碱并未影响到獭兔肝脏脂肪酸合成过程。这一现象与Wu等[2]在大鼠上得出的结果不一致，Wu等[2]发现胆碱可通过促进甲基代谢，使氨基酸转化，影响脂肪酸合成过程。上述研究结果的差异说明胆碱对脂肪酸代谢的影响具有物种的差异性。
3.2 饲粮中胆碱添加水平对3~5月龄獭兔血液中脂类代谢相关指标的影响肝脏内合成的TG可在肝脏中储存，也可经过组装后以VLDL的形式输出。在肝脏中，胆碱在胆碱激酶的催化下发生磷酸化，可合成磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱是磷脂的重要组分，由磷脂酰胆碱构成的磷脂与肝脏内其他脂类物质合成VLDL。本研究发现，饲粮中添加261和348 mg/kg的胆碱显著增加了獭兔血清中VLDL的含量，这一结果与在肉鸭[11]上得出的结果相一致，暗示胆碱加强了肝脏内合成的TG的输出能力。
LPL和HL在血浆脂蛋白胆固醇代谢中发挥着关键性作用。LPL是TG降解的限速酶，它参与各种脂蛋白的代谢并对其进行调控，使血浆中富含脂质的脂蛋白降解。到达血液中的VLDL经LPL分解，然后生成甘油和脂肪酸，或者氧化为二氧化碳和水，储存能量进一步供能[12]。本试验中，饲粮中添加261和348 mg/kg的胆碱同时也提高了獭兔血清中LPL的活性，加强了机体对血液中VLDL利用，使TG和甘油的量增加，但在本试验中，胆碱的添加并未改变血清中TG的含量，这一结果可能与升高的HL活性有关，HL主要在肝脏中合成，能够水解TG和磷脂等。
3.3 饲粮中胆碱添加水平对3~5月龄獭兔血液激素代谢的影响畜禽的脂肪代谢还受到一些激素的调节，如GH、LEP和IGF-1。GH的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长，促进机体蛋白质合成，刺激骨关节软骨和骨垢软骨生长。近期研究发现GH对脂肪代谢也有重要的调节作用，如彭永佳[13]发现GH能够降低小鼠肝脏内脂肪酸合成过程。在本试验中，饲粮中添加174和261 mg/kg的胆碱显著增加了獭兔血清中GH的含量，说明GH可能参与胆碱对獭兔肝脏脂肪代谢过程的调控。
IGF-1是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物。IGF-1作用于脂肪细胞能促进脂肪分解和糖原合成，降低血液中总TG和VLDL的含量[14]。本试验发现胆碱的添加使獭兔血清中IGF-1的含量显著增加，说明IGF-1可能参与胆碱调节机体对TG和VLDL的利用过程。此外，IGF-1可抑制GH的合成分泌，但GH对IGF-1有正调控作用。李光玉[15]研究指出，血清中GH含量的变化与IGF-1含量的变化具有同步性，GH含量的升高或降低伴随着IGF-1含量的升高或降低，本试验所得结果与此一致。因此，胆碱添加后血清中IGF-1含量升高也可能是继发性的，是由GH含量的升高引起的。
LEP是一种由脂肪组织分泌的激素，参与糖、脂肪及能量代谢的调节，并能使机体减少采食量，增加能量释放，抑制脂肪细胞的合成。已有研究表明，LEP对脂肪代谢的影响主要是通过控制CPT1的活性来实现的[16]。本试验中发现胆碱的添加显著升高了血清中LEP的含量，表明LEP信号也参与胆碱调节獭兔脂肪代谢过程，肝脏中CPT1 mRNA表达水平的增加可能也与LEP含量的升高有关。
4 结论饲粮中添加261 mg/kg的胆碱(饲粮实测胆碱水平为1 000 mg/kg)改变了3~5月龄獭兔肝脏中脂肪酸的组成，促进了肝脏中脂肪酸氧化关键基因CPT1的表达，同时加强了肝脏中TG的输出过程。
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