淀粉是奶牛饲粮中重要的能量来源。淀粉是瘤胃中丙酸生成的前体，同时作为葡萄糖的来源直接在小肠被消化吸收。淀粉占谷物中非结构碳水化合物的70%~80%，通常在瘤胃被迅速降解，几乎全部被消化(很多谷物淀粉的消化率在90%以上)。谷物在奶牛中被普遍应用于满足奶牛对淀粉和能量的需求。随着发展中国家和生物燃料市场对谷物需求量的日益增加，谷物价格持续上涨。显然，谷物价格的上涨将会影响到奶牛场的盈利，所以低淀粉饲粮引起牛场经营者的关注。目前普遍推荐泌乳奶牛饲粮淀粉水平为23%~30%(干物质基础)[1]。Dann[2]综述表明，泌乳牛饲粮中副产品饲料(比如豆皮和甜菜颗粒等)替代部分玉米情况下，低淀粉水平(18%~21%)饲粮对奶牛瘤胃发酵和泌乳性能没有负面影响。
饲粮淀粉在瘤胃中降解的速率和程度由几个因素共同决定，包括饲粮淀粉来源、饲粮组成、单次采食量、机械作用(谷物加工和奶牛咀嚼)、化学作用(糊化度)和瘤胃微生物对饲粮的适应程度[3]。NRC(2001)[4]给出了泌乳牛全混合日粮中中性洗涤纤维(NDF)最小推荐量和非纤维性碳水化合物(NFC)最大推荐量，而瘤胃降解淀粉(RDS)水平的变化会影响瘤胃液pH[5]、瘤胃挥发性脂肪酸(VFA)组成[6-7]、干物质采食量(DMI)[5, 8-9]、消化率[8, 10]、乳脂率[8]和氮利用率[7, 11]，所以，饲粮RDS水平会影响饲粮中NDF和NFC的适宜用量，适宜的RDS水平对奶牛生产性能发挥十分必要。在我国，玉米是奶牛饲粮的主要来源，压片玉米和粉碎玉米是奶牛场常用的玉米加工和饲喂形式，压片玉米相比粉碎玉米提高了淀粉的瘤胃降解率(80.3% vs. 67.9%)[12]。本试验通过改变饲粮中粉碎玉米和蒸汽压片玉米的比例设计出3种不同RDS水平的饲粮，通过体外产气法，研究低淀粉饲粮[淀粉含量约为22%(干物质基础)]条件下不同RDS水平对体外瘤胃产气参数、发酵参数和微生物区系的影响，为低淀粉饲粮和淀粉在奶牛生产中的有效应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 饲料样品的制备及成分分析以玉米作为淀粉来源，参照我国《奶牛饲养标准》[13](NY/T 34—2004) 配制3种不同RDS水平的低淀粉饲粮：低RDS水平饲粮(饲粮RDS水平为61.07%，L-RDS组)、中RDS水平饲粮[饲粮RDS水平为67.82%，M-RDS组]和高RDS水平饲粮[饲粮RDS水平为73.74%，H-RDS组]，试验饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
饲粮RDS水平采用半体内尼龙袋法[14]测定。试验选用3头带有永久性瘤胃瘘管的健康中国荷斯坦奶牛[体重：(678±27) kg；产奶量：(20.6±2.5) kg；泌乳天数：(276±19) d]，试验牛饲粮由28.9%的玉米青贮、24.2%的羊草和46.9%的精料(均为干物质基础)组成。每天饲喂2次，挤奶2次，自由采食与饮水，单栏栓系饲养。饲粮粉碎通过3 mm孔径筛，准确称取5 g待测样品，装入已知重量标号的尼龙袋(10 cm×20 cm, 孔径为50 μm；Ankom公司提供)，样品分别在瘤胃中培养0、2、4、8、12、24、48和72 h。尼龙袋瘤胃培养和培养后操作步骤参照Yu等[21]，样品65 ℃烘48 h，回潮至恒重，粉碎过1 mm孔径筛用于饲粮淀粉瘤胃降解参数的测定。饲粮淀粉瘤胃降解参数见表 2。
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表 2 饲粮淀粉瘤胃降解参数 Table 2 Starch degradation parameters of diets |
2016年6月在黑龙江省双城市雀巢奶牛养殖培训中心奶牛场选用3头体重约600 kg的安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体牛，于晨饲前2 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃液，混合后装于预加热保温瓶中迅速带回实验室，将采集的瘤胃液充分混合后经4层纱布过滤[过滤同时通入二氧化碳(CO2)]备用，整个操作在39 ℃温水浴中进行。
1.3 体外发酵体外发酵装置采用德国Endress+Hauser公司生产的产气全自动记录装置(Cerabar T PMP131，Memograph M RSG40) 和软件系统(奥特奇公司提供)。将试验所用样品粉碎并全部通过孔径为1 mm的样品筛。准确称取0.5 g样品放入150 mL厌氧发酵瓶中，每组6个重复，并做3个空白。接种时边搅拌边加入已在39 ℃预热的缓冲液50 mL和新鲜瘤胃液25 mL，所用液体培养基采用Menke等[15]方法配制，向瓶中持续通入CO2 5 s后，将每个产气装置的传感器与数据记录仪相连接，发酵瓶于39.2 ℃下连续培养24和48 h。
1.4 样品收集和预处理体外培养24和48 h后各样品组分别取出3个发酵瓶，24 h时取10 mL发酵液快速转移至-80 ℃冰箱内保存，用于微生物总DNA的提取。48 h时结束发酵，立即测定发酵液pH，从发酵瓶中采集50 mL发酵液分装于离心管中，按与发酵液1 : 5的比例添加25%偏磷酸溶液，混匀后于-20 ℃冷冻保存，用于微生物蛋白(MCP)、氨态氮(NH3-N)和VFA浓度的测定。尼龙袋(孔径：40 μm; 规格:45 mm×55 mm)过滤体外培养48 h发酵液，将尼龙袋过滤的滤渣连同尼龙袋在水龙头下冲洗至水澄清，在65 ℃烘箱内烘至恒重，计算样品的体外干物质消失率(DMD)。
1.5 测定指标及方法干物质、粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪和无机物含量的测定参照AOAC(1990)[16]中方法。pH采用Sartorius Basic pH Meter PB-20型酸度计(赛多利斯科学仪器北京有限公司)测定。淀粉含量测定采用淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶方法，试剂盒购自爱尔兰Megazyme公司。酸性洗涤纤维(ADF)和NDF含量参照Van Soest等[17]方法，采用Ankom 220纤维分析仪(美国ANKOM公司)测定。
NH3-N浓度采用Broderick等[18]所述的靛酚比色法测定，仪器采用UV-2000型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。
MCP浓度采用Makkar等[19]所述的嘌呤法测定，具体方法为：利用酵母RNA制作标准曲线，取8 mL发酵液在13 200 r/min下离心20 min，进行前处理后利用UV-2000型分光光度计在260 nm波长下进行比色，根据吸光度(OD)值和标准曲线计算样品RNA测定值。MCP浓度计算公式为：
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VFA浓度采用日本岛津GC-200气相色谱仪测定[20]，测定时气谱条件为：气化室参数为载气氮气(N2)，分流比40 : 1，进样量0.4 μL，温度220 ℃；色谱柱参数为HP-INNOwax毛细管色谱柱恒流模式，流量2.0 mL/min，平均线速度38 cm/s；柱温箱参数为程序升温120 ℃(3 min)→10 ℃/min→180 ℃(1 min)；检测器参数为氢气(H2)流量40 mL/min，空气流量450 mL/min，柱流量+尾吹气流量45 mL/min，火焰离子检测器(FID)温度250 ℃。
微生物区系测定：采用珠磨-十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取瘤胃微生物总DNA[21]。提取后，用紫外可见分光光度计测定所提取总DNA的浓度和纯度，确保260与280 nm处OD的比值在1.6~1.8之间。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测微生物相对数量，所用仪器为ABI7500型PCR仪，RT-qPCR的反应条件参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂建立20 μL反应体系。从瘤胃微生物总DNA中扩增细菌16S rDNA。PCR反应体系：10×缓冲液2 μL，10 mmol/L的dNTP 0.4 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，25 mmol/L的氯化镁(MgCl2)1.6 μL，模板(瘤胃总DNA)0.4 μL，TaqDNA聚合酶2 μL，双蒸水(ddH2O)为13.6 μL，总体积为20 μL。PCR反应参数：95 ℃变性7 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。引物序列及参考文献见表 3，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
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表 3 实时荧光定量PCR所用引物 Table 3 Primers used for RT-qPCR |
根据瘤胃动力学数学指数模型计算饲粮RDS水平[27]，运用SAS 9.2非线性回归最小二乘法对数据进行处理。
采用动态发酵模型GP=a+b(1-e-ct)[28]，根据非线性最小二乘法原理，求出a、b和c值，其中a为快速发酵部分的产气量(mL)；b为慢速发酵部分的产气量(mL)；c为b的产气速率(%/h)；a+b为潜在产气量(mL)；GP为t时的产气量(mL)。
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根据以下公式将瘤胃微生物相对数量表示为相对于瘤胃总细菌16S rDNA的百分比：
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式中：Ct目标菌为以目标菌引物所测的Ct值；Ct总细菌为以总细菌为引物所得的Ct值。
1.7 统计分析试验数据采用Excel 2010软件处理后，采用SAS 9.1软件中MIXED模型进行统计分析，对饲粮RDS水平的线性和二次曲线效应进行正交多项式对比分析，P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示具有差异显著的趋势。
2 结果与分析 2.1 不同RDS水平饲粮对体外培养48 h产气量、产气参数及干物质消失率的影响由表 4可知，随着饲粮RDS水平的提高，体外培养48 h的产气量、潜在产气量、产气速率和干物质消失率呈线性升高(P < 0.05)，快速发酵部分产气量则呈线性降低(P < 0.05)。L-RDS组和M-RDS组间的所有指标均不存在显著差异(P>0.05)。除了快速发酵部分产气量显著低于L-RDS组(P < 0.05) 外，H-RDS组的其他指标均显著高于L-RDS组(P < 0.05)。H-RDS组的产气量和潜在产气量显著高于M-RDS组(P < 0.05)，两者间的其他指标无显著差异(P>0.05)。
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表 4 不同RDS水平饲粮对体外培养48 h产气量、产气参数及干物质消失率的影响 Table 4 Effects of different RDS level diets on GP, gas production parameters and DMD after 48 h in vitro incubationa |
由表 5可知，饲粮RDS水平对发酵液pH、NH3-N浓度和乙酸/丙酸值没有显著影响(P>0.05)。随着饲粮RDS水平的提高，发酵液MCP、乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度呈线性升高(P < 0.05)，其中M-RDS组除MCP浓度显著低于H-RDS组(P < 0.05) 外，其他指标2组间无显著差异(P>0.05)，而H-RDS组上述指标都显著高于L-RDS组(P < 0.05)。L-RDS组发酵液MCP、丙酸和丁酸浓度与M-RDS组无显著差异(P>0.05)，但乙酸和TVFA浓度显著低于M-RDS组(P < 0.05)。
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表 5 不同RDS水平饲粮对体外培养48 h发酵液pH及MCP、NH3-N、VFA浓度的影响 Table 5 Effects of different RDS level diets on fermentation fluid pH and MCP, NH3-N andVFA concentrations after 48 h in vitro incubation |
由表 6可知，随着饲粮RDS水平的提高，发酵液中白色瘤胃球菌(R. albus)和嗜淀粉瘤胃杆菌(R. amylophilus)的相对数量呈线性升高(P < 0.05)，其中H-RDS组R. albus和R. amylophilus的相对数量显著高于L-RDS组和M-RDS组(P < 0.05)，L-RDS组和M-RDS组间差异不显著(P>0.05)。饲粮RDS水平对发酵液中黄色瘤胃球菌(R. flavefaciens)、琥珀酸丝状杆菌(F. succinogenes)、溶纤维丁酸弧菌(B. fibrisolvens)、牛链球菌(S. bovis)和溶淀粉琥珀酸单胞菌(S. amylolytica)的相对数量的影响不显著(P>0.05)。
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表 6 不同RDS水平饲粮对体外培养24 h发酵液微生物区系的影响 Table 6 Effects of different RDS level diets on fermentation fluid microflora after 24 h in vitro incubation |
体外培养产气量是评定饲料可发酵程度的重要指标，即饲料的可发酵性越强，瘤胃中微生物的活性越高，产气量越大，反之则越少。本试验体外培养48 h的产气量随饲粮RDS水平的提高而升高，这与Palizdar等[29]和张婷等[30]报道的结果一致，因为饲粮中压片玉米替代粉碎玉米使淀粉更容易被微生物和酶利用[31]，淀粉降解产生大量能量促进微生物的生长繁殖，提高了发酵产气量。本试验结果表明高RDS水平饲粮提高了潜在产气量和产气速率，这与Palizdar等[29]的研究结果一致，淀粉的快速降解促进微生物对营养物质的利用，促进了发酵，干物质消失率提高提供部分解释；而快速发酵部分产气量随饲粮RDS水平的提高呈下降趋势，可能归因于饲粮淀粉瘤胃培养可溶部分的降低。
3.2 不同RDS水平饲粮对体外培养48 h发酵液pH及MCP、NH3-N、VFA浓度的影响pH作为瘤胃内环境变化的重要指标，受饲粮的组成、唾液分泌量和有机酸的累积等多种因素影响。普遍观点认为提高可发酵碳水化合物水平会增加短链脂肪酸产量和瘤胃酸中毒的风险，导致瘤胃pH降低[32]。本试验结果表明饲粮RDS水平对体外培养48 h发酵液pH没有显著影响，这与张婷等[30]的体外试验的结果一致。其原因可能是随着体外培养时间的延长，各组淀粉降解率趋于相似，而pH与淀粉降解的相关性很高[33]，所以培养48 h时各组间发酵液pH差异不显著。瘤胃中NH3-N浓度是反映瘤胃氮代谢的重要指标，其浓度大小可反映蛋白质的降解程度和微生物利用氨氮的能力。Murphy等[34]报道微生物发酵的最佳NH3-N浓度为6.3~27.5 mg/dL，本试验各组发酵液NH3-N浓度均在适合微生物发酵的范围内。本试验结果还表明，提高饲粮RDS水平对发酵液NH3-N浓度的影响不显著。张婷等[30]研究得出体外发酵压片玉米替代粉碎玉米饲粮对发酵液NH3-N浓度的影响不显著，本试验结果与此一致。而与Zhong等[8]和Aldrich等[35]体内试验报道的通过蒸汽压片玉米提高RDS水平降低了瘤胃NH3-N浓度的结果不一致。结果不一致原因可能是：一方面，谷物加工后增加4~8 h时间段体外培养淀粉降解率[36]，此时能氮释放同步性能促使微生物生长繁殖和MCP的合成，提高了微生物对NH3-N的利用，而培养时间延长使各组淀粉降解率趋于相似，促使微生物对NH3-N利用能力趋于一致；另一方面，蒸汽压片技术破坏玉米蛋白质空间结构，提高了蛋白质瘤胃降解率[37]，导致蛋白质的分解和NH3-N的生成。
本试验结果表明提高饲粮RDS水平提高了MCP的合成，与之前Plascencia等[6]和Theurer等[38]的报道一致，MCP合成取决于瘤胃可利用能量和可利用氮的数量以及发酵速度的同步性。高饲粮RDS水平下R. albus和R. amylophilus的相对数量较高，表明高饲粮RDS水平促进了有关微生物的生长，这可能因为高RDS水平有更高的瘤胃降解有机物水平[39]，为瘤胃微生物生长繁殖提供能量，同时，压片玉米蛋白瘤胃降解率的提高可能是提高MCP浓度的另一原因。也有相关报道表明提高饲粮RDS水平对MCP浓度的影响不显著[11]，结果不一致可能是由于瘤胃内快速降解淀粉降低了瘤胃内纤维物质消化率，对瘤胃发酵产生负面效应，减少了瘤胃降解有机物水平，影响了MCP的合成。VFA是反刍动物能量代谢的主要能量来源，而乙酸、丙酸和丁酸的量占主要能源物质的80%。本试验发现，提高饲粮RDS水平可不同程度地提高乙酸、丙酸和丁酸的浓度。张婷等[30]体外试验表明饲粮中压片玉米代替普通玉米有升高乙酸浓度的趋势，使丙酸和丁酸浓度显著升高，与本试验结果类似。而相关体内试验表明提高饲粮RDS水平降低了乙酸浓度[7]，提高了丙酸浓度[10]，对丁酸浓度无显著影响[7, 10]。试验饲粮中压片玉米中淀粉相比粉碎玉米中淀粉更易被微生物和酶利用，淀粉的快速降解导致丙酸浓度升高，而乙酸和丁酸浓度升高可能是由于高RDS水平有更高的瘤胃降解有机物水平[39]，可为微生物生长提供能量，促进了微生物对营养物质的分解，提高了乙酸和丁酸的产量。本试验结果表明饲粮RDS水平对乙酸/丙酸值没有显著影响，结果与张婷等[30]所得结果一致，与Shen等[7]所得结果不一致，可能是因为不同饲粮情况下RDS对瘤胃发酵的影响不同，导致了乙酸和丙酸浓度的差异。
3.3 不同RDS水平饲粮对体外培养24 h发酵液微生物区系的影响瘤胃中的纤维分解菌主要有R. flavefaciens、R. albus和F. succinogenes，本试验结果表明体外培养24 h发酵液R. albus相对数量随饲粮RDS水平的提高而升高，而各组R. flavefaciens和F. succinogenes相对数量差异不显著。李飞[40]研究表明，饲粮中不同比例的小麦替代玉米饲喂奶山羊，瘤胃液中R. flavefaciens相对数量呈线性下降，F. succinogenes相对数量呈二次曲线变化趋势，对R. albus相对数量的影响不显著。胡红莲[41]研究表明，随着饲粮中玉米比例的提高，奶山羊瘤胃液中3种纤维分解菌(R. flavefaciens、F. succinogenes和R. albus)的相对数量逐渐下降。上述研究结果不一致可能是由于瘤胃液pH不同造成的，因为提高可发酵碳水化合物水平会增加短链脂肪酸产量和瘤胃酸中毒的风险，导致瘤胃pH降低[32, 42]，纤维分解菌普遍对瘤胃pH敏感，当pH低于6.0时，瘤胃球菌和F. succinogenes等主要的纤维降解菌的生长将受到抑制[43]。而本试验中各组发酵液pH处于正常范围，同时NH3-N浓度在适合微生物发酵的范围内，R. albus相对数量的增长可能是因为高RDS水平提供了更多的瘤胃降解有机物[39]，从而为瘤胃微生物的生长繁殖提供了能量。B. fibrisolvens的不同菌株表现差异较大，有的菌株具有很强的淀粉降解活性，有的菌株具有很强的纤维降解活性，本试验中各组发酵液中B. fibrisolvens相对数量差异不显著，此结果与申军士[44]所得结果一致。S. bovis、R. amylophilus和S. amylolytica是主要的淀粉降解菌，申军士[44]研究表明，饲粮中压片玉米替代粉碎玉米饲喂奶牛，瘤胃液S. bovis相对数量上升，R. amylophilus相对数量下降，S. amylolytica相对数量没有显著变化。李飞[40]研究表明，饲粮中压片玉米替代粉碎玉米饲喂奶牛，瘤胃液S. amylolytica相对数量升高，对S. bovis和R. amylophilus相对数量无显著影响。上述研究结果不完全一致，可能与饲粮RDS水平和淀粉降解速率的差异有关，其原因有待进一步研究。
4 结论低淀粉饲粮条件下提高饲粮RDS水平提高了体外培养48 h的产气量、潜在产气部分和产气速率，提高了体外培养48 h发酵液MCP、乙酸、丙酸、丁酸和TVFA浓度，而对pH和氨态氮浓度无显著影响，并提高了体外培养24 h发酵液白色瘤胃球菌和嗜淀粉瘤胃杆菌的相对数量。由此得出，低淀粉饲粮条件下提高饲粮RDS水平有利于瘤胃发酵。
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