2. 浙江省植物有害生物防控省部共建国家 重点实验室培育基地, 杭州 310021;
3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
4. 浙江大学动物科学学院, 杭州 310058
2. State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
3. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
4. College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
谷氨酰胺(glutamine,Gln)是一种条件性必需氨基酸,可促进蛋白质合成,在肠道上皮中作为生物活性物质,扮演信号分子的角色并调控信号通路,在保持肠道结构完整性和阻止肠腔有害微生物进行系统循环中起重要的调节作用[1]。Hubert-Buron等[2]研究报道,Gln可通过限制抑制因子Bα(IκBα)水解降低肠道细胞的炎症反应。闫静等[3]研究表明,Gln对化学性肝损伤的治疗作用不仅与其抗氧化、抗炎症反应有关,还可能通过改善肠道功能间接减轻肝损伤。郑善军等[4]用扫描电镜观察Gln对辐射损伤的大鼠肠面膜的保护作用,结果表明辐射组绒毛杂乱、窄小,排列无规律,绒毛顶端有明显溃烂,发生溃疡的绒毛数目较多;而补充Gln组动物肠黏膜绒毛宽大、钝圆,接近正常对照组的形态,排列整齐,绒毛顶端形成细小溃疡,但溃疡发生不普遍。
氧化应激是指由于机体内氧化与抗氧化作用失衡,导致产生对自身有负面作用的、具有氧化活性的中间产物,造成细胞损伤,引起机体衰老,甚至肿瘤等恶性疾病。活性氧簇作为细胞死亡途径的信号分子,通过线粒体释放促凋亡分子、激活天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)级联反应,并参与凋亡过程的调节。目前发现的细胞凋亡途径主要包括2种:1) 胞外信号激活胞内凋亡酶Caspase家族;2) 线粒体释放凋亡酶激活因子,从而激活Caspase家族,活化的Caspase可将胞内重要蛋白降解,从而引起细胞凋亡。氧化应激能使肠细胞生长抑制或死亡,Gln能抑制小肠黏膜细胞死亡[5]。Evans等[6]的研究表明,Gln能剂量依赖地抑制大鼠结肠上皮细胞凋亡,并且Gln抑制细胞凋亡的作用是特异性的,而谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Cly)均无此功能。过氧化氢(H2O2)能够氧化哺乳动物细胞,使其产生具损伤细胞的氧自由基[7]。自由基会攻击DNA双螺旋结构,导致其结构发生变化,从而影响细胞正常功能,最终可能导致细胞凋亡[8]。有研究显示,0.5、2.0和5.0 mmol/L Gln可显著降低H2O2引发的猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells, IPEC-1) 凋亡,其死亡细胞数量分别下降了14.2%、54.4%和95.4%[9]。因此,本试验旨在通过研究Gln对H2O2诱导的氧化应激状态下人结肠癌HT-29细胞抗氧化功能、细胞凋亡调控相关基因表达以及细胞凋亡状况,验证Gln是否具有抗氧化功能,并阐明其可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料HT-29细胞株由中国科学院上海生命科学研究院提供;RPMI1640培养基、DMEM培养基(含4 500 mg/L D-葡萄糖和110 mg/L丙酮酸钠,不含L-Gln)、0.25%胰酶细胞消化液、Gln和胎牛血清购自GIBCO公司(美国);Trizol试剂、琼脂糖、逆转录酶、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒购自大连宝生物公司(TaKaRa,日本);丙二醛(malondiadehyde,MDA)含量、氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定试剂盒购自南京建成生物技术研究所;细胞培养六孔板(Corning,美国)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate)/碘化丙啶(propidium iodide)双重荧光染料凋亡检测试剂盒购自联科生物有限公司。
1.2 细胞培养HT-29细胞用含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中常规贴壁培养。待细胞长满至培养瓶底面积80%之后传代,全部试验均用指数生长期细胞。
1.3 Gln和H2O2处理HT-29细胞将HT-29细胞传代培养在六孔板上,待HT-29细胞的覆盖率达到80%,吸干原培养基,加入无Gln的DMEM培养基后培养24 h,分别加入Gln和H2O2处理细胞,使得Gln的终浓度分别为0(对照组)、0.5、2.0、10.0 mmol/L;各组H2O2终浓度均为0.35 mmol/L。分别处理12、24、32 h后收集细胞用于后续的试验分析。
1.4 MDA含量和SOD活性测定 1.4.1 裂解细胞HT-29细胞经过Gln和H2O2分别处理12、24、32 h后,弃培养基,用4 ℃预冷生理盐水漂洗3遍后,加入0.3 mL预冷生理盐水,用细胞刮将细胞刮下并转移入2.0 mL EP管,加入0.2 mL生理盐水漂洗。将EP管置于冰水混合液中于超声粉碎仪上以10 s/次间隔10 s的频率反复破碎3次。4 ℃、5 000 r/min离心10 min,吸取上清液备测。
1.4.2 MDA含量测定MDA含量的测定原理为:过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合,形成红色产物,在532 nm处有最大峰值。具体操作参照试剂盒说明书。
1.4.3 SOD活性测定SOD活性的测定原理为:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基,后者与氧化羟胺作用形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,用分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时,则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用,使形成的亚硝酸盐含量减少,比色测定管的吸光度低于对照管,通过计算可求出被测样品中的SOD活性。具体操作参照试剂盒说明书。
1.5 总RNA提取和cDNA的制备采用Trizol法[10]提取总RNA,使用SuperScriptTM Ⅱ RTase反转录试剂盒进行反转录制备cDNA。
1.6 荧光定量PCR 1.6.1 引物设计和合成采用Primer Premier 6.0和Beacon designer软件设计荧光引物,由上海生物工程有限公司负责合成,目标基因[细胞表面诱导凋亡分子(FAS)、Caspase-3、核转录因子κB(NF-κB)、B淋巴细胞瘤- 2(Bcl-2)和B淋巴细胞瘤- 2相关X蛋白(Bax)]和18S rRNA的引物参数见表 1。
将反转的cDNA按照SYBR® Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒操作,采用25 μL反应体系,在CFX384多重实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)中进行荧光定量PCR。最佳反应条件为:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性10 s,62 ℃ 25 s;退火/延伸进行45个循环;熔解曲线为单峰。每个待测样品设置3个重复,对得到的3个Ct值取算术平均值,以备带入公式进行计算mRNA相对表达量。
1.7 流式细胞仪分析使用Annexin V-FITC和PI对HT-29细胞进行双染,然后使用流式细胞仪,分别通过FITC和PI的放射波长530和585 nm进行检测分析。采用双变量流式细胞仪的散点图进行检测分析,左下象限代表活细胞(FITC-/PI-);左上象限为坏死细胞(FITC-/PI+);右下象限为早期凋亡细胞(FITC+/PI-);右上象限代表晚期凋亡细胞(FITC+/PI+)。所以细胞的总凋亡率是右上象限(FITC+/PI+)和右下象限(FITC+/PI-)之和[11]。
1.8 数据处理所有数据均采用SPSS 16.0软件进行方差分析,结果以平均值±标准误表示,P<0.05为差异显著性水平。
2 结果 2.1 Gln对H2O2诱导的氧化状态改变的影响由图 1可知,处理12 h后,各组间SOD活性和MDA含量无显著差异(P>0.05)。处理24 h后,对照组SOD活性显著低于0.5、2.0 mmol/L Gln组(P<0.05),各组间MDA含量无显著差异(P>0.05)。处理32 h后,0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln组SOD活性与对照组比较,分别升高了46.40%(P<0.05)、67.99%(P<0.05) 和19.71%(P>0.05);与之对应的是MDA含量分别减少了17.79%(P<0.05)、37.66%(P<0.05) 和13.09%(P>0.05)。
由图 2可知,用0.35 mmol/L H2O2处理HT-29细胞,在12、24和32 h 3个时间段,促进细胞凋亡相关基因FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量相一致,均为先降低后升高;而抑制细胞凋亡的基因Bcl-2 mRNA相对表达量则相反,为先升高后降低。
处理12 h后,各组的Caspase-3和Bax mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,0.5 mmol/L Gln组NF-κB mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),0.5与2.0 mmol/L Gln组Bcl-2 mRNA相对表达量显著增加(P<0.05)。
处理24 h后,与对照组比较,0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln组Caspase-3、NF-κB和Bax mRNA相对表达量均能显著降低(P<0.05)。2 mmol/L Gln组FAS和Caspase-3 mRNA相对表达量分别比对照组降低了62.27%和71.13%(P<0.05),0.5 mmol/L Gln组NF-κB和Bax mRNA相对表达量分别比对照组降低了64.85%和65.05%(P<0.05),10.0 mmol/L Gln组FAS mRNA相对表达量与对照组无显著差异(P>0.05)。0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln组Bcl-2 mRNA相对表达量在较对照组分别升高了1 404.65%、1 559.21%和623.76%(P<0.05)。
处理32 h后,与对照组比较,2.0 mmol/L Gln组FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量分别降低了63.55%、45.11%、41.49%和30.22%(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量升高了44.30%(P<0.05)。与对照组比较,10.0 mmol/L Gln组FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量分别增加了31.78%、25.83%、34.77%和20.35%(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量与对照组无显著差异(P>0.05)。
2.3 流式细胞仪分析细胞的凋亡情况采用Annexin V-FITC/PI双染法对细胞染色,并用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。由图 3可知,处理24 h后,对照组和0.5、2.0、10.0 mmol/L Gln组活细胞数量分别为71.37%、76.69%、83.34%和78.30%,坏死细胞数量分别为12.78%、6.03%、0.12%和1.31%。Gln处理使活细胞数量提高了5.32%~11.97%,坏死细胞数量降低了6.75%~12.66%。
由图 4可知,处理32 h后,对照组和0.5、2.0、10.0 mmol/L Gln组活细胞数量分别为61.73%、66.70%、70.36%和63.12%,坏死细胞数量分别为21.61%、17.57%、17.04%和18.21%。Gln处理使活细胞数量提高了1.39%~7.63%,坏死细胞数量降低了3.40%~4.57%。
MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一,可通过MDA含量了解膜脂过氧化的程度,以间接反映膜系统受损程度;而SOD在清除自由基、抗氧化损伤和维持细胞的结构方面都起着很重要的作用。在本研究中,我们采用H2O2刺激HT-29细胞,建立氧化损伤模型,发现Gln可以提高HT-29细胞SOD活性;H2O2诱导的对照组脂质过氧产物MDA含量较高,0.5和2.0 mmol/L Gln处理细胞可以显著地降低MDA含量,表明Gln可提高抗氧化作用而改善氧化应激造成的细胞膜通透性的增加,从而对细胞损伤有一定的保护作用[12]。
细胞凋亡相关基因FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax和抑制细胞凋亡基因Bcl-2互为拮抗,在氧化应激引起的细胞凋亡中发挥着重要作用[6-7]。本试验结果表明,0.5和2.0 mmol/L Gln可以降低H2O2诱导氧化应激HT-29细胞FAS、Caspase-3、NF-κB和Bax mRNA相对表达量,而提高Bcl-2 mRNA相对表达量。Haynes等[13]指出,由于Gln的化学特性不能直接改变H2O2的存在形式,且肠道细胞的凋亡并不是接触H2O2开始,而是需要一个较长的时间(例如12 h)来影响基因表达和信号传导。因为H2O2扩散进入细胞是有限的,其经由水通道蛋白同系物穿过细胞膜进入细胞[14]。已有研究报道H2O2是通过激活氧化应激调节因子Caspase-3和NF-κB诱导细胞凋亡[15]。Caspase-3是其家族中最重要的一员,处于细胞凋亡的共同路径上,是细胞凋亡的关键执行者之一。正常情况下,Caspase-3在胞质中以无活性的酶原形式存在,只有当细胞外凋亡信号使之激活为有活性的Caspase-3时,才引起细胞质、细胞核及细胞构架的关键蛋白酶失活,导致细胞凋亡。在细胞内,H2O2激活FAS基因和提高细胞色素C从线粒体中的释放,这导致通过Caspase-8和Caspase-9途径激活Caspase-3,而Caspase-3导致细胞DNA片段化[16]。此外,H2O2激活NF-κB,增加“死亡”相关基因表达,抑制了“存活”相关基因表达[17]。Bcl-2及其同系物可阻止线粒体膜损伤和细胞色素C等促凋亡因子的释放,但Bax作用正好相反,促进线粒体膜损伤和细胞色素C的释放,Bcl-2/Bax比例通常是反映细胞程序性死亡的标准[18]。我们的研究结果得出,Gln增加氧化应激状态下HT-29细胞Bcl-2/Bax比例,说明Gln可以通过线粒体途径抑制氧化应激诱导细胞凋亡。目前,Gln促进Bcl-2 mRNA相对表达量的相关机制可能与Gln增加线粒体膜的稳定性有关,也可能通过诱导热休克蛋白70 (HSP70)的表达,进而增强Bcl-2的表达[19]。
本试验发现,当H2O2和Gln与HT-29细胞共培养32 h后,高浓度(10 mmol/L)Gln促进H2O2诱导应激的细胞凋亡相关基因的表达,FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量分别比对照组增加了31.78%、25.83%、34.77%和20.35%,且流式细胞仪分析也得到相一致的结果,即凋亡细胞数量与对照组接近,多于0.5和2.0 mmol/L Gln组。说明Gln抑制细胞凋亡存在一定的浓度依赖性。在一定的浓度范围内,Gln可有效地抑制由氧化应激引起的细胞凋亡,而超过一定浓度范围,细胞凋亡率与Gln浓度变化无直接线性关系,这与前人的研究结果[20-21]相一致。产生这种现象的原因可能是Gln通过谷氨酰胺酶反应生成谷氨酸和氨(NH3)[13],而在细胞培养时间较长,Gln浓度高的情况下,培养基中NH3浓度较高,高浓度NH3对细胞具有损伤作用。
4 结论Gln可以有效提高H2O2诱导的氧化应激HT-29细胞SOD活性,降低MDA含量,降低氧化应激状态HT-29细胞促进细胞凋亡基因FAS、Caspase-3、NF-κB和Bax表达,而提高抑制细胞凋亡基因Bcl-2表达,减少细胞氧化损伤和凋亡。
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