动物营养学报    2017, Vol. 29 Issue (8): 2743-2750    PDF    
引用本文
李敏, 崔亚利, 王丙雷, 陈宝江. 不同水平肌醇对獭兔皮肤中β-连环蛋白和激素敏感脂酶表达的影响[J]. 动物营养学报, 2017, 29(8): 2743-2750.  
LI Min, CUI Yali, WANG Binglei, CHEN Baojiang. Effects of Different Inositol Levels on β-Catenin and Hormone-Sensitive Triglayceride Lipase Expression in Skin of Rex Rabbits[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2017, 29(8): 2743-2750.  
不同水平肌醇对獭兔皮肤中β-连环蛋白和激素敏感脂酶表达的影响
李敏1, 崔亚利1, 王丙雷1, 陈宝江2     
1. 河北农业大学动物医学院, 保定 071000;
2. 河北农业大学动物科技学院, 保定 071000
收稿日期: 2017-01-21
基金项目: 国家兔产业技术体系（CARS-44-B-3）；吉林海资生物技术有限公司横向课题
作者简介: 李敏(1991—), 女, 河北衡水人, 硕士研究生, 研究方向为细胞生物学与分子免疫学。E-mail:844413347@qq.com
通信作者: 崔亚利, 副教授, 硕士生导师, E-mail:yalicui70@163.com; 陈宝江, 教授, 博士生导师, E-mail:chenbaojiang@vip.sina.com
摘要: 本试验旨在研究饲粮中添加不同水平的肌醇对獭兔皮肤中β-连环蛋白（β-catenin）和激素敏感脂酶（HSL）表达的影响。选取（40±1）日龄的同期断奶獭兔120只（公母各占1/2），随机分成4组，每组30只。在4组獭兔的饲粮中分别添加0、25、50、75 mg/kg的肌醇，试验期为3个月。在试验的第30天（2月龄）、第60天（3月龄）和第90天（4月龄），分别取腹部、背中部、臀部皮肤，采用免疫组织化学和蛋白质印迹（Western blot）法对β-catenin和HSL的蛋白质表达和定位进行检测。结果表明：β-catenin在毛囊中广泛表达，在毛根鞘细胞和毛乳头均有棕黄色阳性反应细胞。HSL在毛根鞘细胞，尤其是在内根鞘细胞内，呈现非常明显的棕黑色强阳性表达。饲粮中添加50 mg/kg肌醇可以极显著增加2~4月龄獭兔背中部皮肤毛囊中β-catenin和HSL阳性表达细胞的平均灰度值（P＜0.01），极显著增加4月龄獭兔背中部、腹部和臀部皮肤毛囊中β-catenin和HSL阳性表达细胞的平均灰度值（P＜0.01）。结果提示，肌醇能够通过上调4月龄獭兔毛囊中β-catenin和HSL的表达来促进毛囊的发育，在本试验中，饲粮肌醇水平达到50 mg/kg时效果最佳。
关键词: 肌醇     獭兔     毛囊     β-连环蛋白     激素敏感脂酶    
Effects of Different Inositol Levels on β-Catenin and Hormone-Sensitive Triglayceride Lipase Expression in Skin of Rex Rabbits
LI Min1, CUI Yali1, WANG Binglei1, CHEN Baojiang2     
1. College of Veterinary Medicine, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China;
2. College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China
Corresponding author: CUI Yali, associate professor, E-mail:yalicui70@163.com; CHEN Baojiang, professor, E-mail:chenbaojiang@vip.sina.com
Abstract: The aim of the present study was to investigate the effects of different inositol levels in diets on the expression of β-catenin and hormone-sensitive triglayceride lipase (HSL) in skin of Rex rabbits. A total of 120 (40±1)-day-old Rex rabbits (half male and half female) were randomly divided into 4 groups with 30 rabbits per group. Rex rabbits in 4 groups were fed diets with different levels of inositol (0, 25, 50 and 75 mg/kg, respectively), and the experiment lasted for 3 months. The skin of abdomen, dorsocentral region, hip were collected on days 30 (2-month-old), 60 (3-month-old), 90 (4-month-old), respectively, and the protein expression and location of β-catenin and HSL were studied by immunohistochemistry and Western blot methods. The results showed that the β-catenin was widely expressed in hair follicle, and the hair root sheath cells and hair papilla all had brown positive reaction cells. HSL was showed a very obvious dark brown strong positive expression in hair root sheath cells, especially in inner root sheath cells. The addition of 50 mg/kg inositol could extremely significantly increase the mean gray value of β-catenin and HSL positive cells in the hair follicles of the dorsocentral region skin of 2-to 4-month-old Rex rabbits (P < 0.01), extremely significantly increase the mean gray value of β-catenin and HSL positive cells in the hair follicles of the dorsocentral region, abdomen and hip skin of 4-month-old Rex rabbits (P < 0.01). The results suggest that inositol can promote the growth of hair follicle by increasing the expresstion of β-catenin and HSL of 4-month-old Rex rabbits, and the effect is the best when dietary inositol level is 50 mg/kg in this experiment.
Key words: inositol     Rex rabbits     hair follicle     β-catenin     HSL    

肌醇(环己醇)广泛分布于各种天然动植物及微生物的组织中[1]，主要在动物的肝脏、肾脏、大脑和睾丸[2-3]等部位合成，具有生物素与维生素B的类似作用，作为体内活性组织的组成部分发挥多种生理功能[4]，如促进细胞生长，参与蛋白质的生物合成；促进肝脏脂肪代谢，降低血液中胆固醇含量；作为细胞膜的组成成分之一，在膜磷脂平衡中扮演着重要的角色[5]；促进健康毛发的生长，防止脱发等。在食品工业中肌醇常作为营养强化剂被推广使用，但是肌醇在毛用动物饲粮中的应用研究很少。

毛囊是一种形态和结构较为复杂的皮肤附属结构[6]，它呈周期性地控制着毛发的生长，决定着动物被毛的品质和产量。毛囊的发育过程受到多种信号分子的调节，其中Wnt途径是最关键的信号通路[7]。而作为Wnt信号途径中下游成员之一的β-连环蛋白(β-catenin)，是Wnt信号途径的中心环节，对毛囊细胞的生长、分化、运动、凋亡的调节都具有重要的作用[8]。

肌醇有促进脂肪代谢的作用，而表皮Wnt/β-catenin作为信号级联反应中关键的启动因子能够诱导脂肪生成，表皮Wnt信号在脂肪细胞分化和被毛的生长周期同步化中具有重要作用[9]。虽然穆国柱等[10]对饲粮中添加脂肪对獭兔皮毛质量的影响进行了研究，但是探讨脂肪沉积影响因素对毛囊发育影响的研究却很少。激素敏感脂酶(HSL)是脂肪分解的限速酶[11]，也是影响动物脂肪沉积的关键酶之一。因此，本试验通过在饲粮中添加不同水平的肌醇，研究其对毛囊中β-catenin和HSL表达的影响，以探讨肌醇影响毛囊发育的可能机制，为肌醇在毛皮动物生产中的应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验动物选择和分组

选取同期断奶的(40±1) 日龄獭兔120只(公母各占1/2)，随机分为4组，每组30只，每笼3只，常规饲养，预试期7 d，正试期为3个月。对照组和试验1组、试验2组、试验3组獭兔分别饲喂在基础饲粮中添加0、25、50、75 mg/kg肌醇的试验饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。所有试验饲料均制成直径为2.5 mm的颗粒饲料。

表 1 基础饲粮组成及营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet
1.2 样品的采集

分别在试验开始后的第30天(2月龄)、第60天(3月龄)、第90天(4月龄)，每组随机各选取6只健康獭兔，颈静脉放血处死，去除预定部位的被毛后，分别取腹部、背中部和臀部皮肤(各约1 cm2)，一部分展平并贴附在吸水纸(防止皮样卷曲)上后，固定于多聚甲醛中，用于免疫组织化学分析；另一部分包裹于锡箔纸(180 ℃烘烤5 h)中，放于-80 ℃冰箱中冻存，用于组织蛋白质的提取。

1.3 试验试剂

鼠抗人HSL抗体购自Santa公司，鼠抗人β-catenin抗体购自CST公司，链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫组化染色试剂盒和浓缩型二氨基联苯胺(3, 3-N-diaminobenzidine tertrahydrochloride, DBA)显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，蛋白质抽提试剂盒和蛋白质Marker均购自CWBIO公司，硝酸纤维素膜(NC膜)购自Millipore公司。

1.4 皮肤组织的β-catenin和HSL的免疫组织化学染色

将皮肤切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢(H2O2)室温作用10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗2 min×3次；将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，电炉加热至沸腾后断电，间隔10 min后再重复1次，冷却后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2 min×2次；滴加5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温作用20 min；甩去多余液体，滴加1:50稀释的一抗(鼠抗人β-catenin/HSL)，4 ℃过夜；室温放置1 h，PBS冲洗2 min×3次；滴加生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)，37 ℃作用20 min，PBS冲洗2 min×3次；滴加试剂SABC，37 ℃作用20 min，PBS冲洗5 min×4次；DAB显色10 min，蒸馏水洗涤2 min×2次，苏木精轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。PBS代替一抗作为阴性对照。

用ImageJ软件对β-catenin和HSL在各组皮肤中的免疫组化染色结果进行测定，每个獭兔皮肤组织分别取3张切片，每张切片取3个视野，对每张图片进行8位灰阶、反向处理后测得其阳性表达细胞的平均灰度值。

1.5 皮肤组织中β-catenin和HSL的蛋白质印迹(Western blot)

取出液氮中冻存的獭兔皮肤组织，用预冷的蛋白质抽提试剂盒提取獭兔皮肤组织中的总蛋白，每孔上样20 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿转法转至NC膜，转膜1 h。将膜完全浸没3%BSA-TBST中室温轻摇30 min, 加入一抗(用3%BSA-TBST稀释，1:500)，室温孵育10 min，放4 ℃过夜。室温孵育30 min，TBST洗膜，3 min×5次。用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗:10 000]，室温轻摇40 min。TBST洗膜3 min×6次。ECL加到膜上后反应3~5 min，胶片曝光，显影2 min，定影。内参蛋白抗体使用鼠抗人β-肌动蛋白(β-actin)抗体，以1:5 000的比例进行稀释。

1.6 数据处理

试验数据采用SPSS 16.0进行描述性统计与方差分析，结果用“平均值±标准差”来表示。

2 结果 2.1 β-catenin在皮肤毛囊中的定位表达

免疫组织化学染色结果显示，β-catenin在毛囊中广泛表达，在毛根鞘细胞和毛乳头均有棕黄色阳性反应细胞(图 1)。

A、B、C、D分别代表对照组、试验1组、试验2组、试验3组。a，b所示为毛根鞘，c所示为毛根鞘和毛乳头。图中标尺长度为50 μm。 A, B, C and D showed control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively. a, b represented root sheath, and c represented root sheath and dermal papilla. Scale length in figure was 50 μm. 图 1 4月龄獭兔背中部皮肤组织β-catenin免疫组化染色结果 Figure 1 The results of β-catenin in the dorsocentral region skin from 4-month-old Rex rabbits showed by immunohistochemical staining

如表 2所示，2月龄獭兔β-catenin阳性表达细胞的平均灰度值，在背中部皮肤中试验1组与试验2组较对照组均极显著增加(P＜0.01)；在腹部皮肤中试验2组和试验3组极显著低于对照组(P＜0.01)；在臀部皮肤中各试验组均极显著低于对照组(P＜0.01)。3月龄獭兔β-catenin阳性表达细胞的平均灰度值，在背中部与腹部皮肤中各试验组较对照组均极显著增加(P＜0.01)；在臀部皮肤中各试验组较对照组均极显著降低(P＜0.01)。4月龄獭兔β-catenin阳性表达细胞的平均灰度值，在背中部皮肤中各试验组均极显著高于对照组(P＜0.01)；在腹部皮肤中试验2组和试验3组均极显著高于对照组(P＜0.01)，试验1组则极显著低于对照组(P＜0.01)；在臀部皮肤中试验2组和试验3组均极显著高于对照组(P＜0.01)。

表 2 皮肤毛囊组织中β-catenin阳性表达细胞的平均灰度值 Table 2 Average gray value of β-catenin positive cells in the hair follicle of skin
2.2 HSL在皮肤毛囊中的定位表达

免疫组织化学染色结果显示，毛根鞘细胞呈现棕黄色的HSL阳性表达(图 2)，尤其是在内根鞘细胞内，HSL呈现非常明显的棕黑色强阳性表达。

A、B、C、D分别代表对照组、试验1组、试验2组、试验3组。a所示为内根鞘，b所示为毛根鞘。图中标尺长度为50 μm。 A, B, C and D showed control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively. a represented inner root sheath, and b represented root sheath. Scale length in figure was 50 μm. 图 2 4月龄獭兔背中部皮肤组织HSL免疫组化染色结果 Figure 2 The results of HSL in the dorsocentral region skin from 4-month-old Rex rabbits showed by immunohistochemical staining

由表 3得出，2月龄獭兔HSL阳性表达细胞的平均灰度值，在背中部皮肤中试验1组和试验2组极显著高于对照组(P＜0.01)，试验3组极显著低于对照组(P＜0.01)；在腹部皮肤中试验2组和试验3组极显著低于对照组(P＜0.01)；在臀部皮肤中试验1组极显著高于对照组(P＜0.01)，试验3组极显著低于对照组(P＜0.01)。3月龄獭兔HSL阳性表达细胞的平均灰度值，在背中部与腹部皮肤中各试验组均极显著高于对照组(P＜0.01)；在臀部皮肤中各试验组均极显著低于对照组(P＜0.01)。4月龄獭兔HSL阳性表达细胞的平均灰度值，在背中部皮肤中各试验组均极显著高于对照组(P＜0.01)；在腹部皮肤中试验2组和试验3组均极显著高于对照组(P＜0.01)，试验1组则极显著低于对照组(P＜0.01)；在臀部皮肤中试验2组极显著高于对照组(P＜0.01)，试验3组极显著低于对照组(P＜0.01)。

表 3 皮肤毛囊组织中HSL阳性表达细胞的平均灰度值 Table 3 Average gray value of HSL positive cells in the hair follicle
2.3 不同部位皮肤组织中β-catenin和HSL的Western blot检测结果

Western blotting检测结果显示，獭兔皮肤总蛋白中存在分别与鼠抗人β-catenin和HSL的抗体发生免疫阳性反应的蛋白质条带，蛋白质的大小分别为92、120 ku，如图 3所示。

1、2、3、4泳道分别为对照组、试验1组、试验2组、试验3组4月龄獭兔腹部皮肤；5、6、7、8泳道分别为对照组、试验1组、试验2组、试验3组4月龄獭兔背中部皮肤。 Lanes 1, 2, 3 and 4 showed the skin of abdomen from 4-month-old Rex rabbits in the control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively; lanes 5, 6, 7 and 8 showed the skin of dorsocentral region from 4-month-old Rex rabbits in the control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively. 图 3 β-catenin和HSL Western blot检测结果 Figure 3 The results of β-catenin and HSL detected by Western blot
3 讨论

毛囊是产毛动物皮肤的重要组成部分，具有独特的复杂结构和生长的周期性。不同动物、不同部位的毛囊生长周期虽有一定的差异性，但是它们的基本结构是相同的，由内到外依次为毛干、内根鞘、外根鞘、结缔组织鞘[12]。毛囊是表皮与真皮之间经过一系列复杂的相互作用的产物，受多种信号分子的调节，伴随毛发周期毛囊有多达6 000种基因的表达发生改变。本试验通过在饲粮中添加不同水平的肌醇，研究各组獭兔毛囊中β-catenin和HSL的表达差异，探讨饲粮中肌醇水平对毛囊发育可能的影响机制。

3.1 不同水平肌醇对不同月龄獭兔皮肤毛囊中β-catenin表达的影响

毛囊的发育过程受到多种信号分子的调节，其中Wnt/β-catenin信号途径是最关键的途径，而β-catenin是Wnt信号途径中最重要的信号分子，它诱导毛囊的形态发生，维持毛囊生长、发育及毛囊干细胞的分化。

本研究结果显示β-catenin在毛囊内根鞘、外根鞘以及毛乳头中均有表达，与于秀菊等[13]对羊驼皮肤的研究结果一致，可见β-catenin是毛囊发育过程中不可缺少的分子。饲粮中肌醇水平不高于50 mg/kg时，3~4月龄獭兔背中部皮肤毛囊中β-catenin阳性表达细胞的平均灰度值随着肌醇水平的增加而增加，结合前期研究结果，饲粮中肌醇水平为50 mg/kg时，次级毛囊密度会随着肌醇水平的增加而变大[14]，可以得出肌醇水平对毛囊中β-catenin和次级毛囊密度的影响基本是相一致的，推断饲粮中的肌醇可能通过影响毛囊中β-catenin的表达从而影响次级毛囊的周期性发育，这与王卓[15]的推测相一致。不同肌醇水平对各个部位皮肤中β-catenin表达的影响有一定差异，其中背中部的变化最大。在本试验中，饲粮中添加50 mg/kg肌醇后，对2~3月龄獭兔3个部位皮肤中β-catenin表达的影响没有规律性，但是4月龄时背中部、腹部和臀部毛囊中β-catenin的阳性表达细胞的平均灰度值均极显著增加，表明β-catenin的表达上调。一般情况下4月龄獭兔正处于新老被毛替换和新被毛开始急剧生长期，推测β-catenin表达量的增加能够促进毛囊干细胞的分化和毛囊的发育。

3.2 不同水平肌醇对不同月龄獭兔皮肤毛囊中HSL表达的影响

本试验结果显示HSL主要表达于毛根鞘细胞。饲粮中不同水平肌醇对各个部位皮肤中HSL表达的影响程度不同，对背中部毛囊的影响最为明显。3~4月龄獭兔背中部皮肤毛囊中HSL阳性表达细胞的平均灰度值随着肌醇水平的增加而增加，对腹部和臀部皮肤毛囊中HSL的表达的影响没有规律性。饲粮中肌醇水平为50 mg/kg时，4月龄獭兔背中部、腹部和臀部皮肤毛囊中的HSL阳性表达细胞的平均灰度值均极显著增加。这可能是因为处于刚开始被毛急剧生长期的4月龄獭兔需要较多的能量供给，而毛囊中HSL表达量的增加，可通过促进脂肪降解为毛囊的生长发育提供充足的能量保证。结合前期研究结果，饲粮中肌醇水平不高于50 mg/kg时，次级毛囊密度会随着肌醇水平的增加而变大[14]，推测肌醇通过提高毛囊中HSL的表达来促进毛囊细胞脂肪的降解过程，从而为毛囊的生长发育提供能量。

4 结论

肌醇能够通过上调4月龄獭兔毛囊中β-catenin和HSL的表达来促进毛囊的发育，在本试验中，饲粮肌醇水平达到50 mg/kg时效果最佳。

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