2. 金湖兴达禽业有限公司, 金湖 211600;
3. 淮安市徐楼养殖有限公司, 涟水 223400
2. Jinhu Xingda Poultry Co., Ltd., Jinhu 211600, China;
3. Huaian City Xulou Breeding Co., Ltd., Lianshui 223400, China
在使用抗生素导致的细菌耐药性增强、动物源性食品中药物残留等问题日益严重的情况下,益生菌在实际生产中得到了较广泛地应用和认同[1]。国内外均有报道指出,饲粮中添加益生菌可以提高肉鸡生长性能[2-4]和饲粮养分利用率[5]、促进肠道发育[6-8]以及降低肠道中有害菌的数量[9-10]。目前有关益生菌的研究大多集中在肉鸡,针对蛋鸡早期的研究还很少,而育雏期和育成前期是蛋鸡生长发育阶段中非常重要的基础阶段,这个阶段蛋鸡对养分利用的能力及其肠道发育和肠道健康状况直接影响到育雏期和育成期的正常生长发育和产蛋期生产性能的发挥。如果从雏鸡开始使鸡只保持较好的生理健康状态,将有利于鸡只长期健康生长,并使其在产蛋期维持较高的生产水平。所以,本试验旨在研究饲粮中添加益生菌对蛋鸡早期生长、饲粮养分利用及肠道菌群的影响,以期明确蛋鸡早期饲粮中添加益生菌的作用,为益生菌在蛋鸡饲粮中的应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用益生菌制剂由枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌组成,2种菌的活菌数均为1×108 CFU/g,购自山东宝来利来生物工程股份有限公司;杆菌肽锌预混剂中杆菌肽锌含量为10%,购自天津新星兽药厂;试验动物为1日龄罗曼褐壳蛋鸡公鸡,由金湖县兴达禽业有限公司提供;饲粮预混料添加量为1%,由扬州市扬大饲料厂提供。
1.2 试验设计选取同一批出雏、体重接近的1日龄罗曼褐壳蛋鸡540只,随机分为3组:对照组饲喂不添加任何益生菌及抗生素的基础饲粮;抗生素组在基础饲粮中添加0.1 g/kg杆菌肽锌预混剂;益生菌组为基础饲粮中添加1 g/kg益生菌制剂。每个试验组设6个重复,每个重复30只鸡。基础饲粮为参照NRC(1994)[11]营养需要配制的粉状料,所用预混料中均不含有抗生素。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
试验期为70 d,采用舍内笼养,自由采食和饮水,每日观察并记录鸡只状况。
1.3 样品采集与指标检测 1.3.1 饲粮养分表观利用率测定70日龄时从各组的每个重复中选取1只接近平均体重的试验鸡,进行代谢试验。采用全收粪法收集粪便,连续收粪4 d。粪便中的粗蛋白质含量按照国标中规定的方法[12]测定;干物质含量、能量等参照张丽英[13]主编的《饲料分析及质量检测技术》中的方法测定。
1.3.2 盲肠菌群测定70日龄时,从每个重复选取1只接近平均体重的试验鸡进行屠宰,无菌操作,分离出盲肠,将盲肠内容物挤出,液氮速冻,迅速放入-70 ℃冰箱保存待测。采集的盲肠内容物经过总DNA的提取、总DNA的浓度及完整性检测、PCR引物的设计、PCR扩增及Real-time PCR定量后,在NGS Illumina MiSeq 2×300 bp平台进行高通量测序,对盲肠菌群种类和结构进行测定。
1.4 数据分析数据采用Excel 2007软件建立数据库,采用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)及Duncan氏多重比较进行数据分析,以P<0.05作为差异显著性判断,数据以“平均值±标准差”表示。
2 结果 2.1 饲粮添加益生菌对蛋鸡早期生长的影响饲粮添加益生菌对蛋鸡早期生长的影响见表 2。由表可知,70日龄时,益生菌组和抗生素组蛋鸡体重均显著高于对照组(P<0.05),而益生菌组与抗生素组间无显著差异(P>0.05)。
由表 3可知,益生菌组相比对照组具有提高粗蛋白质表观利用率的趋势(P=0.054),粗蛋白质的利用率提高了8.7%。抗生素组的能量表观利用率显著高于对照组和益生菌组(P<0.05),且对照组与益生菌组的能量表观利用率无显著差异(P>0.05)。益生菌组钙的表观利用率显著高于抗生素组和对照组(P<0.05),且抗生素组和对照组钙的表观利用率无显著差异(P>0.05);各组间干物质和磷的表观利用率均无显著差异(P>0.05);
操作分类单位(OTU)是群体遗传学研究中为了方便进行信息分析,人为地对某一个品系、属或种等分类单元设置的统一标志。通过对序列进行归类操作,将序列按照彼此间相似性分类归为很多小组,1个小组即为1个OTU。可以根据不同的相似水平对所有序列进行OTU归类,通常将在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。韦恩图可直观地表现出样品中的OTU组成及相似性情况。因韦恩图只能对2~5个样本或组进行分析,故在此做各组间分析。各组间韦恩图见图 1。由图可知,益生菌组OTU总数为466,大于抗生素组的453和对照组的450。
将每个样品在门水平和属水平上的物种构成绘制成柱状图(图 2和图 3)。由图 2可知,试验鸡盲肠中检出的13门不同的细菌中,拟杆菌门与厚壁菌门为优势菌,且这2类优势菌在益生菌组平均分别达到49.3%和41.8%,抗生素组分别为49.5%和40.9%,对照组分别为49.2%和41.7%。梭杆菌虽不属于优势菌群,但益生菌组的梭杆菌低于其他2组。另外,益生菌组放线菌平均数量为1.5%,低于抗生素组的1.9%和对照组的1.7%。抗生素组中,B2和B4变形菌高于其他样品。
在13门不同的细菌中共显示出168个不同属的细菌。由图 3可知,除未知菌属外,Barnesiella作为优势菌群在对照组、抗生素组及益生菌组的菌群中分别占到24.00%、27.49%和27.54%;拟杆菌属也为盲肠内优势菌,益生菌组的11.1%高于抗生素组的5.0%和对照组的7.3%;其中拟杆菌属的单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)的含量在高通量检测中也被检测出,抗生素组单形拟杆菌的0.98%低于益生菌组的2.96%和对照组的2.45%,而益生菌组脆弱拟杆菌的1.8%高于抗生素组的1.1%和对照组的0.7%,而抗生素组埃氏拟杆菌的0.56%低于益生菌组的0.85%和对照组的0.78%。
此外,抗生素使盲肠内芽孢杆菌(Bacillus)含量远不足0.001%,低于益生菌组的0.036%和对照组的0.012%。益生菌组肠杆菌科细菌含量为0.029%和抗生素组的0.010%低于对照组的0.044%。
3 讨论 3.1 饲粮添加益生菌对蛋鸡早期生长的影响益生菌可以在肠道中产出多种维生素、氨基酸以及各种消化酶促进营养物质的消化,并且可以利用掉肠道中多余的氧气,促进拟杆菌门等多种在肠道消化吸收中占主导地位的厌氧菌的生长繁殖,从而促进肠道对营养物质的代谢吸收,提高机体的生长性能。
有关益生菌对蛋鸡早期生长性能的影响的研究较少,在肉鸡上的研究较多。陆银等[14]利用含有蜡样枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和肠粪球菌组成的复合益生菌制剂添加到肉仔鸡饲粮中,结果表明添加益生菌能显著提高22~35日龄肉仔鸡的生长性能;Salim等[15]同样将复合益生菌制剂添加到饲粮中饲喂肉仔鸡,结果显示益生菌促进了鸡只的生长,显著提高了鸡只的重量;Zhang等[16]向肉仔鸡的饲粮中添加枯草芽孢杆菌制剂饲喂35 d后,相对与对照组,体重有显著地提高。本研究结果与上述结果一致,饲粮添加益生菌制剂显著促进了试验鸡的生长;谢全喜等[17]应用多种益生菌制剂与抗生素类饲料添加剂做比较试验,结果表明益生菌制剂具有同等甚至更好的促生长作用。
益生菌在肠道内生长繁殖及代谢活动中可以分泌出多种营养物质及消化酶类,提高营养物质的消化吸收。其具体促生长机理与机制还有待更进一步的研究。
3.2 饲粮添加益生菌对青年蛋鸡饲粮养分利用率的影响国内外的一些研究表明,在黄羽肉鸡及蛋鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌可显著提高粗蛋白质、钙和磷的利用率[18],对干物质利用率无显著影响[19]。然而Li等[5]、Apata[20]研究表明饲喂肉仔鸡益生菌后,干物质、粗蛋白质及能量的回肠表观利用率均得到显著提高。
本研究中,饲粮添加益生菌后对鸡只粗蛋白质的表观利用率虽未表现出显著影响,但相对于对照组,添加益生菌具有提高粗蛋白质利用率的趋势。另外,益生菌显著提高了钙的表观利用率,这与周立强等[18]、李俊波等[19]的研究结果一致。钙与蛋鸡骨骼发育、蛋壳形成密切相关,万阜昌[21]提出,枯草芽孢杆菌在生长繁殖过程中能合成B族维生素及维生素E、维生素K,可参与动物机体的新陈代谢,有促进钙、磷吸收等作用。Nahashon等[22]也证明了微生态制剂可以提高鸡只对钙的吸收利用,提出微生态制剂有利于产蛋时钙的充分供应。因此本研究中益生菌相比基础饲粮和抗生素,有显著提高鸡只对钙的利用率的作用,说明在蛋鸡早期饲粮中添加益生菌能通过促进机体对钙的吸收,从而促进生长发育,而如果继续在产蛋期使用益生菌还可促进蛋鸡产蛋性能的发挥。本试验中各组之间干物质表观利用率无显著差异,与李俊波等[19]研究结果一致。益生菌在肠道中生长繁殖的过程中会产生和分泌多种酶,其中芽孢杆菌最为突出,它可以增强淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性[23]。Wang等[24]的研究表明,添加益生菌后胰淀粉酶和胰蛋白酶活性得到显著提高,并可刺激机体淀粉酶和蛋白酶的分泌,从而促进对营养物质的吸收。还有研究指出,益生菌产生的消化酶和促生长因子等活性物质,可协同增强寄主对营养物质的消化和吸收[25]。本研究中抗生素组的能量表观利用率得到显著提高,说明添加益生菌和抗生素在不同方面均使动物对营养物质的利用率得到了提高,结合70日龄鸡只体重可知,添加益生菌和抗生素均提高了试验鸡的生长性能,这可能与营养物质的利用率得到提高有一定关系。
3.3 饲粮添加益生菌对蛋鸡早期盲肠菌群的影响本试验共统计得到477个OTU群落,其中3个组共有OTU数437个,各组均含特有OTU数4个,益生菌组和对照组2组特有OTU数16个,益生菌组与抗生素组特有OTU数9个,而抗生素组与对照组特有OTU数仅4个。由益生菌组OTU总数大于其他2组可知,益生菌增加了盲肠内菌群的种类数量,而抗生素减少了OTU的数量,曹广添[26]通过向肉鸡饲粮中添加抗生素和芽孢杆菌,通过高通量测序,结果表明,添加杆菌肽锌复合硫酸黏杆菌素显著降低了盲肠微生物中OTU数量,这与本试验结果相一致。
哺乳动物的菌群在门水平上主要为拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和变性菌门,其中优势菌群为厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌群,曹广添[26]在其研究中同样表明肉鸡盲肠中主要含有厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门和少量的柔壁菌门,其中厚壁菌门和拟杆菌门为其优势菌群。在本试验中,结果同样显示蛋鸡盲肠中主要为拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和柔壁菌门,而前两者为最主要的优势菌群,说明蛋鸡和肉鸡与哺乳动物相似,拟杆菌和厚壁菌均为其优势菌群。Choi等[27]研究证明鸡的消化道菌群主要为拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和酸杆菌门,而上述结果中主要的菌群结构差别可能和物种、品种、不同饲粮组成以及不同生存环境有关[28]。
在属水平上Barnesiella和拟杆菌属为主要的优势菌群,拟杆菌作为优势菌,对于宿主健康状态的维持非常重要[29]。其中益生菌组拟杆菌显著高于其他组,益生菌组脆弱拟杆菌显著增加。脆弱拟杆菌作为肠道中正常定殖的细菌,目前已被全面了解,作为条件致病菌,只有在机体中某部位受损或者有病理性改变时脆弱拟杆菌才会易位具有致病性。而机体中脆弱拟杆菌数量下降时,机体也会出现异常,沙素梅[30]研究发现,溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者与健康者相比较,肠道内脆弱拟杆菌数量偏低。也有研究表明脆弱拟杆菌与机体糖代谢有关,张勇[31]研究指出,脆弱拟杆菌可以间接的促进糖的代谢,还有研究指出其对多糖的利用能力突出。朱延旭等[32]将筛选出的脆弱拟杆菌BF-839添加到肉仔鸡饲料中,结果表明该菌可提高肉仔鸡的免疫功能。本试验中各组鸡只并未出现病变,所以益生菌组脆弱拟杆菌的增多,有可能是其相对于对照组消化功能和免疫功能增强的原因之一,具体原因及机理还需进一步探索。抗生素组的单形拟杆菌含量显著降低,说明抗生素可能通过影响该菌的数量从而影响机体的免疫功能。
本试验中抗生素和益生菌均使肠杆菌科细菌降低,而肠杆菌科细菌大多为埃希氏菌属、沙门氏菌属和志贺氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属等有害菌属,其中包括大肠杆菌、沙门氏菌和肠杆菌等致病菌,说明益生菌和抗生素均可抑制有害菌的数量。另外,本研究中益生菌显著增加了盲肠内芽孢杆菌属的数量,而添加抗生素很大程度上减少了芽孢杆菌数量。芽孢杆菌不仅可促进营养物质的消化吸收,还能抑制病原菌生长,对机体有重要的益生作用。与上述研究结果一致,王丽凤[33]将益生菌添加到试验鸡饲粮中,结果表明益生菌可使肠道内乳酸菌、双歧杆菌等有益菌数量增多,同时使有害菌的数量减少。结合本研究中各组70日龄体重及养分利用率的结果可知,益生菌可以通过增加盲肠内芽孢杆菌等有益菌的数量对机体产生积极影响;抗生素虽然抑制了有害菌的数量但同时也抑制了芽孢杆菌等有益菌的数量,不利于肠道健康。
4 结论① 饲粮中添加益生菌可提高蛋鸡早期的生长及营养物质利用率,改善肠道菌群结构。
② 饲粮添加抗生素虽然促进了蛋鸡早期生长发育和营养物质利用率,但不利于盲肠微生物定植以及菌群结构的稳定。
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