2. 哈尔滨医科大学附属第二医院, 哈尔滨 150086;
3. 东北林业大学野生动物资源学院, 哈尔滨 150040
2. The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Haerbin 150086, China;
3. College of Wildlife Resources, Northeast Forestry University, Haerbin 150040, China
大熊猫是我国特有的珍稀动物，1984年被列入世界10种濒危物种之一[1-2]。10月龄的亚成年大熊猫食性转变为以竹子为主的高纤维食物[3]，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12~38 kg[4]，大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素[5]。大熊猫的消化系统属于典型的肉食性哺乳动物消化系统[6]，2010年大熊猫的基因组序列公布，从中可以找到编码与肉食性动物消化系统相关的酶的基因，但不存在任何纤维素酶的基因[7]，因此大熊猫对纤维素的消化主要是由肠道微生物来完成的[8-10]。大熊猫的肠道只有小肠和大肠，肠道长度较短，且氧气含量较高，由此猜测大熊猫肠道更适宜需氧或兼性厌氧的微生物生长[11]。大熊猫肠道中任何一个微生物的改变都可能引起其消化系统紊乱，甚至导致死亡的发生。因此，研究大熊猫肠道微生物区系尤为重要，对肠道疾病可起到一定的预防作用，从而改善大熊猫的健康水平，并且也是研制大熊猫微生态制剂的基础。虽然自然界中存在着许多能够降解纤维素的微生物，但是大熊猫属于珍稀动物，更应该考虑喂养的安全性，从大熊猫粪便中筛选出的纤维素降解菌比从其他环境中分离得到的微生物更适合作为大熊猫的微生态制剂或饲料添加剂。
近年来，大熊猫肠道微生物得到了国内外的广泛关注。例如，张志和等[12]、Hirayama等[13]对大熊猫肠道菌群进行了分离、鉴定；蒋芳[14]从大熊猫粪便中分离、筛选出能产生纤维素酶的沙雷氏菌；谷武阳[15]从大熊猫粪便中分离、筛选出能产生纤维素酶的芽孢杆菌；Zhou等[16]从大熊猫肠道中分离出的芽孢杆菌不仅能够分解纤维素，还可以抑制肠道中病原菌的增殖。
本试验拟从雅安碧峰峡基地饲养的健康、无腹泻大熊猫林冰的粪便中分离得到一株需氧的纤维素降解菌，并对该纤维素降解菌的产酶条件进行优化，以丰富纤维素酶的微生物来源，并为大熊猫微生态制剂的制备提供参考数据。
1 材料与方法 1.1 样品来源试验样品为雅安碧峰峡基地饲养的健康、无腹泻大熊猫林冰(雌性，生于2009年)的新鲜粪便。
1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL[17]。
筛选培养基：牛肉膏3 g，羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 4 g，氯化钠5 g，琼脂16 g，蒸馏水1000 mL。
菌种保藏培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL[18]。
发酵培养基：磷酸二氢钾1 g，葡萄糖6 g，蛋白胨8 g，硫酸镁0.5 g，蒸馏水1 000 mL。
1.3 纤维素降解菌的筛选 1.3.1 富集培养在超净工作台中，称取新鲜粪便中间部分10 g，放入装有玻璃珠的90 mL无菌水中，连续振荡20 min，制成菌悬液。吸取1 mL菌悬液，加入到100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在37 ℃、150 r/min恒温振荡器中培养24 h[6]。
1.3.2 初筛将培养后的大熊猫粪便混合菌液做标准10倍稀释[19]，各吸取稀释度为10-5、10-6、10-7、10-8倍的菌液100 μL涂于筛选培养基上，每个稀释度做3个平行，倒置放入37 ℃培养箱中培养24 h。培养完成后滴加碘液染色[20]，静置3 min，观察培养基上是否产生透明圈。
1.3.3 复筛测量培养基中菌落的透明圈直径(D，cm)与菌落直径(d，cm)，计算二者的比值，选取比值较大的菌株测定纤维素酶活力[21]。
1.3.3.1 纤维素酶活力的测定采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)试剂法测定纤维素酶活力[22]，通常纤维素酶总活力用滤纸酶活力(filter paper activity, FPA)来表示，FPA定义：每小时底物产生1 μmol葡萄糖所需酶量为1个酶活力单位(U)。FPA(U/mL)计算公式如下：
FPA(U/mL)=(葡萄糖×酶液定容体积× 5.56)/(反应体系中加入的酶量×滤纸质量×时间)。
式中：5.56为1 mg葡萄糖的μmol数。
1.3.3.2 滤纸分解试验将筛选得到的菌株放入以滤纸为唯一碳源的液体培养基中[19]，空白对照组不接种菌株。在37 ℃、150 r/min恒温振荡器中连续培养7 d，每日同一时间拍照记录滤纸分解情况。
1.4 菌株鉴定 1.4.1 菌株的形态学观察及生理生化特征观察菌落的隆起形状、形态、透明度、质地、颜色、边缘等。细胞的形态学观察主要是通过革兰氏染色，借助显微镜对细胞的大小、结构、排练方式以及芽孢、鞭毛等进行观察[7]。菌株的生理生化特征描述参照Taxonomic Outline of the Procaryotes, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology[23]及《常见细菌系统鉴定手册》[24]进行。
1.4.2 菌株16S rDNA的PCR扩增及序列分析采用试剂盒对菌株基因组DNA进行提取，使用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′AGGAGGTGTCCAGCCGCA)对菌株的16S rDNA序列进行扩增。PCR循环条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃修复延伸10 min；4 ℃保存[25]。获得的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。16S rDNA序列在核糖体数据库(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)上比对。
1.5 纤维素降解菌产酶条件的优化 1.5.1 培养基初始pH对菌株产酶的影响用1 mol/L盐酸和1 mol/L氢氧化钠将培养基pH分别调为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。将菌液以4%接种量接入培养基装液量为100 mL的250 mL三角瓶中，然后摇床转速150 r/min、37 ℃条件下培养24 h，测定FPA。
1.5.2 培养温度对菌株产酶的影响将培养基初始pH调为6.5，并将菌液以4%接种量接入装液量为100 mL的250 mL三角瓶中，然后将接种的培养基分别放入33、35、37、39、41 ℃的培养箱中，摇床转速150 r/min条件下培养24 h，测定FPA。
1.5.3 摇床转速对菌株产酶的影响将培养基初始pH调为6.5，并将菌液以4%接种量接入装液量为100 mL的250 mL三角瓶中，然后将摇床转速分别设定为100、125、150、175、200 r/min，35 ℃条件下培养24 h，测定FPA。
1.5.4 装液量对菌株产酶的影响在250 mL三角瓶中分别装入60、80、100、120、140 mL培养基，培养基初始pH为6.5，将菌液以4%接种量接入培养基中，摇床转速125 r/min，35 ℃条件下培养24 h，测定FPA。
1.5.5 正交优化试验本试验选取培养基初始pH(A)、培养温度(B)、摇床转速(C)和装液量(D)4个因素，在单因素试验结果的基础上设计正交试验，正交试验采取L9(34)正交试验表，从而得到纤维素降解菌最适产酶条件。
1.6 数据处理试验数据使用SPSS 20.0软件进行统计分析，使用Origin 9.2软件绘制曲线图。
2 结果与分析 2.1 纤维素降解菌的筛选 2.1.1 初筛如图 1所示，培养24 h后用碘液染色，可清晰地看出菌落周围的透明圈，在培养基上共有2处菌落产生了透明圈(图 1中箭头所示)，其中左侧产透明圈的菌株命名为LD，右侧产透明圈的菌株命名为DL。
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图 1 菌株LD和DL在CMC-Na平板上的透明圈 Figure 1 Transparent circle of strains LD and DL on CMC-Na plate |
纤维素酶活力以FPA表示，FPA测定结果见表 1。通过比较FPA，确定菌株DL为筛选出的纤维素降解菌。将分离纯化的菌株移至菌种保藏培养基上，4 ℃保存。
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表 1 FPA测定结果 Table 1 Determination results of FPA |
将菌株DL接入培养基观察7 d。从图 2中可以看出，第2天培养基中完整的滤纸边缘出现絮状物；第3天培养基中的絮状物增加，滤纸有所缺失；第5天扇形的滤纸彻底变成纸屑，培养基变得浑浊；到第7天，三角瓶中出现挂壁现象，产生了大量的细菌，滤纸基本被分解，培养基变得更加浑浊。这说明从大熊猫粪便中筛选获得的菌株DL可以产生纤维素酶并具有纤维素降解能力。
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图 2 滤纸分解试验结果 Figure 2 Filter paper decomposition experiment results |
如图 3所示，菌落形态呈现圆形且菌落边缘呈不规则锯齿状，表面凸起，菌落不透明呈乳白色，直径为1.0~1.5 cm。
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图 3 菌株DL的菌落形态 Figure 3 Colonies morphology of strain DL |
从表 2中可知，菌株DL为革兰氏阳性菌，好氧，芽孢染色、接触酶、氧化酶、V-P试验均为阳性，甲基红、吲哚、硫化氢试验为阴性。菌株DL可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、淀粉及羧甲基纤维素钠，初步判定为芽孢杆菌或其变种。
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表 2 菌株DL的生理生化特征鉴定结果 Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics of strain DL |
菌株DL经过PCR扩增16S rDNA获得大小为1 400 bp的条带，具有16S rDNA的特征。测序结果(图 4) 经BLAST同源性分析，结果表明菌株DL与类芽孢杆菌(Paenibacillus cookii)LZ033亲缘关系最近，同源性为99%，在NCBI上的登陆号为JQ073763。采用MEGA 7.0构建系统发育树，如图 5所示。
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图 4 序列测定结果 Figure 4 Determination result of sequence |
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图 5 菌株DL 16S rDNA基因序列的系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strain DL |
培养基的pH对微生物生长有很大的影响，可影响代谢过程中酶的活性及微生物对营养物质的吸收[26]。菌体生长需要适合的pH，微生物才能进行正常代谢。如图 6中所示，pH在5.5~6.5范围内，FPA呈上升趋势，FPA在pH为6.5时达到了最大值88.7 U/mL。pH为7.0~7.5时，FPA呈下降趋势，在pH为7.5时，达到了最小值58.8 U/mL。由以上结果确定正交试验中培养基初始pH的水平为6.0、6.5和7.0。
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图 6 培养基初始pH对菌株DL产酶的影响 Figure 6 Effect of medium initial pH on the cellulase production of strain DL |
当培养温度在一定的范围内，微生物的生长及其代谢产物的合成在一定程度上是依赖于温度的升高的，如果温度过高，代谢产物的合成会受到抑制，特别对酶类物质会产生很大的影响。如图 7中所示，培养温度在33~35 ℃范围内，随着培养温度的升高，FPA是逐渐增大的，在35 ℃达到最大值91.1 U/mL。培养温度在在37~41 ℃之间，随着培养温度的升高，FPA逐渐下降，在41 ℃时FPA最低，这是由于培养温度过高，不适合菌株DL生长，导致产酶受影响。由以上结果确定正交试验中培养温度的水平为33、35和37 ℃。
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图 7 培养温度对菌株DL产酶的影响 Figure 7 Effect of culture temperature on the cellulase production of strain DL |
在菌株培养过程中，振荡可使菌株与氧气接触更加充分，通过振荡可使溶氧量增大。还可使菌株与培养基中的营养物质更好地接触，有利于营养物质的利用。如图 8中所示，摇床转速在100~125 r/min之间，随着振荡频率的提高，FPA呈上升趋势，125 r/min时FPA为89.0 U/mL。当转速超过125 r/min时，FPA下降，这可能是由于菌株DL的需氧量有限。由以上结果确定正交试验中摇床转速的水平为100、125和150 r/min。
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图 8 摇床转速对菌株DL产酶的影响 Figure 8 Effect of shaker speed on the cellulase production of strain DL |
在菌株培养过程中，装液量也会影响溶氧量，装液量过多会降低氧气含量，使好氧的菌株生长受到抑制，但是过低的装液量也不利于菌株的生长。如图 9中所示，随着装液量的增加，FPA逐渐增大。装液量为120 mL时，FPA达到最大值84.2 U/mL。但装液量增加到140 mL时，FPA则降低为58.7 U/mL，这可能是由于菌株DL本身为需氧型，氧气过低可能会影响菌株DL的生长使得产酶受抑制。由以上结果确定正交试验中装液量的水平为100、120和140 mL。
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图 9 装液量对菌株DL产酶的影响 Figure 9 Effect of liquid medium volume on the cellulase production of strain DL |
正交试验结果见表 3，从极差可知，4个因素对FPA影响从大到小的顺序依次为温度、摇床转速、装液量、培养基初始pH。最优的产酶条件应为A1B2C2D1，即培养基初始pH为6、培养温度为35 ℃、摇床转速为125 r/min、250 mL三角瓶装液量为100 mL。
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表 3 正交试验结果 Table 3 Results of orthogonal test |
最优的产酶条件A1B2C2D1未出现在正交表中，所以需要与正交表中FPA最高的组合(A1B2C2D2)进行比较，结果见表 4。
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表 4 验证试验结果 Table 4 The results of verification test |
如表 4所示，通过极差分析得到的组合A1B2C2D1所产生的FPA略高于通过正交试验得到的最优组合A1B2C2D1产生的FPA。因此可确定最佳的产酶条件：培养基初始pH为6、培养温度为35℃、摇床转速为125 r/min、250 mL三角瓶装液量为100 mL，此组合FPA为102.3 U/mL，与优化前相比提高了1.2倍。
3 讨论大熊猫的膳食以粗硬又难消化的竹子为主，常年食用大量竹子很容易对其消化道造成损伤，它排出的粪便几乎都是竹节，竹子利用力极低。Zhu等[27]对大熊猫肠道菌群的宏基因组进行了研究，发现存在纤维素酶基因，证明了大熊猫肠道内存在可降解纤维素的微生物。马海玲[19]对大熊猫粪便中的微生物进行培养，利用刚果红及滤纸崩溃试验筛选得到具有纤维素降解能力的真菌和放线菌。刘艳红等[28]对大熊猫粪便中的真菌进行分离培养，筛选出纤维素降解真菌。本试验采用牛肉膏蛋白胨培养基，旨在筛选出能产纤维素酶的细菌，因为细菌生长速度快、发酵时间较短；产纤维素酶的细菌更容易获得，表达水平高；产纤维素酶的细菌有很好的热稳定性，更适用于基因工程菌。
培养基以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源，利用碘液染色，染色形成的透明圈大小可以初步判断细菌降解纤维素的能力。羧甲基纤维素钠在纤维素酶的作用下分解为纤维素二糖和葡萄糖糖，碘液不能与纤维素二糖和葡萄糖形成棕色复合物，但碘液可以与羧甲基纤维钠形成棕色复合物，最后只有在纤维素降解菌周围产生透明圈。李争明[26]用碘液染色法从腐木、腐殖土壤中筛选获得产纤维素酶的菌株。碘液染色只能初步反映出纤维素降解菌产纤维素酶的特性，因此需要进行复筛。复筛时先测定纤维素酶活力并选取产酶活力较高的菌株做滤纸分解试验，滤纸的主要成分是纤维素，滤纸分解试验可进一步验证筛选出的菌株具有降解纤维素的能力，菌株如果可以在以滤纸为唯一碳源的液体培养基中生长，则滤纸会被分解，而且分解程度越大说明产纤维素酶能力越好。
对细菌进行种属鉴定最常用的方法就是16S rDNA序列同源性分析，再结合系统发育分析及生理生化特征就可以很好地对细菌进行分类，它是菌种鉴定的标准方法。樊程等[21]、荣华等[25]、杨伟平等[29]都从动物肠道中分离出了纤维素降解菌，种属鉴定时均使用了生理生化特征及16S rDNA序列分析。
在微生物生长繁殖过程中，菌体的培养条件对其生长和代谢产物的积累都有重要的影响。在选育菌种过程中，通常会选择生长速度快、产酶量高的菌株作为目标菌株，因此就需要通过改变培养条件来提高代谢产物的合成量。本试验通过改变培养基初始pH、培养温度、摇床转速及装液量从而提高纤维素酶活力。曹涵文等[5]从大熊猫粪便中筛选出1株纤维降解菌为好氧的假单胞菌并对其产酶条件进行优化，结果最适pH为6、培养温度26 ℃、摇床转速150 r/min、装液量30%，在此条件下产酶活力最高。本试验筛选出的菌株为Paenibacillus cookii LZ033，该菌株最适产酶条件是培养基初始pH为6、培养温度为35 ℃、摇床转速为125 r/min、250 mL三角瓶装液量为100 mL，在此条件下纤维素酶活力最高。这与曹涵文等[5]的试验结果不同，虽然都是从大熊猫粪便中分离出来的纤维素降解菌，但由于菌株不同，使得产酶条件存在差异。
此次筛选出的菌株Paenibacillus cookii LZ033，隶属于芽孢杆菌目，芽孢杆菌是目前研制微生态制剂中使用最广泛的益生菌之一。用生长速度快且产酶活力高的菌株研制微生态制剂喂养动物时，菌株在短时间内就可在肠道中繁殖，有助于维系肠道内微生态平衡[29]。本次试验获得的菌株Paenibacillus cookii LZ033可以分泌纤维素酶，它在饲料添加剂或大熊猫微生态制剂的制备上具有应用潜力。
4 结论① 从大熊猫林冰粪便中筛选出的纤维素降解菌DL经形态学观察、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析，鉴定为Paenibacillus cookii LZ033。
② 所筛选菌株DL的最佳产酶条件是培养基初始pH为6，培养温度为35 ℃，摇床转速为125 r/min，250 mL三角瓶装液量为100 mL，在此条件下培养24 h，FPA为102.3 U/mL。
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