2. 山东农业大学动物科技学院, 泰安 271018
2. College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China
鸡腿肉是目前市场上深受消费者喜爱的主要肉产品之一，其肌内脂肪含量的增加可以提高其肌肉风味和肌肉嫩度。随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们对于肉类的消费理念发生了巨大变化，在大量消费鸡腿肉的同时，对鸡腿肉品质的要求也在不断提高。因此，在保证鸡腿肉总产量持续增长的同时，如何增加肌内脂肪含量，进而改善鸡腿肉品质、保障人民肉类消费质量和食品安全成为我们面临的新课题。动物的消化道内存在着大量的微生物，它们对于维持动物胃肠道环境的相对稳定以及促进营养物质的消化吸收起着非常重要的作用。近年来研究发现，肠道微生物具有降低宿主骨骼肌脂肪分解和提高宿主脂蛋白脂酶(LPL)活性的能力[1]。那么，我们是否可以通过外源添加微生态制剂的方法来改变肉鸡肠道中的菌群结构，进而影响肉鸡骨骼肌的脂肪沉积，最终达到改善肉鸡肌肉品质的目的，这有待于进一步证明。丁酸梭菌是一种产丁酸、厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，前人研究表明，丁酸梭菌具有很好的改善肉鸡肠道微生物区系的作用[2-4]。因此，本研究旨在通过探讨饲粮中添加丁酸梭菌对肉鸡腿肌脂肪代谢的影响，为丁酸梭菌在肉鸡生产上的应用提供新的试验依据，同时也为肉鸡腿肌肌内脂肪沉积的调控提供新的途径。
1 材料与方法 1.1 试验材料丁酸梭菌(CCTCCM2011384)：菌粉中活菌含量为5×108 CFU/g，由山东宝来利来生物工程股份有限公司提供。
1.2 试验设计试验选用1日龄爱拔益加(AA)肉公鸡192只，随机分为2个组，每个组6个重复，每个重复16只鸡。对照组饲喂基础饲粮，为参照NRC(1994)[5]鸡的营养需要配制的配合饲料，基础饲粮组成及营养水平见表 1；试验组饲喂在基础饲粮中添加1×109 CFU/kg丁酸梭菌的试验饲粮。为保证丁酸梭菌活力，饲粮均采用粉料，试验期为42 d。肉仔鸡采用网上平养，自由采食，充足饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
分别于试验的第21和42天，每个重复选取1只健康肉鸡空腹12 h后翅静脉采血，分离血清，-20 ℃保存，用于测定血清激素含量；颈静脉放血处死，分割左侧相同部位腿肌用于肌内脂肪含量的测定；取相同部位右侧腿肌液氮速冻，-40 ℃保存，用于测定脂肪代谢酶活性，另取相同部位右侧腿肌置于非液氮型样品RNA保存液(北京百泰克生物技术有限公司)中，4 ℃过夜后置于-20 ℃保存，用于测定脂肪代谢相关基因表达量。
1.4 检测指标 1.4.1 肌内脂肪含量采用乙醚浸提法，用脂肪占肌肉鲜样比例表示。
1.4.2 脂肪代谢酶活性腿肌LPL活性采用总脂酶测试盒[LPL/肝脂酶(HL)测试盒]和总蛋白定量测试盒(带标准，考马斯亮兰法)测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，测定过程按照试剂盒说明书进行操作。
腿肌激素敏感脂肪酶(HSL)活性参照赵旭[6]方法进行操作。
1.4.3 血清激素含量采用放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所有限公司)测定血清中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)含量。
1.4.4 脂肪代谢相关基因表达量腿肌总RNA采用TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, 美国)方法进行提取，反转录和实时荧光定量PCR过程均参照TaKaRa试剂盒说明书进行操作。心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、肉碱脂酰转移酶1(CPT1)、肉碱脂酰转移酶2(CPT2)、长链乙酰辅酶A脱氢酶(LCAD)、LPL和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)实时荧光定量PCR引物序列见表 2，由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。用2-△△Ct法来计算目的基因的表达量。
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表 2 实时荧光定量PCR引物 Table 2 Primers for real-time qPCR |
数据采用SAS 9.2统计软件进行独立样本t检验，结果以平均值±标准误表示，P < 0.05为差异显著，0.05≤P < 0.10为显著趋势。
2 结果 2.1 丁酸梭菌对肉鸡腿肌肌内脂肪含量的影响由图 1可知，与对照组相比，饲粮中添加丁酸梭菌显著提高了21日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量(P < 0.05)，但对42日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量无显著影响(P > 0.05)。
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数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下图同。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 1 丁酸梭菌对肉鸡腿肌肌内脂肪含量的影响 Figure 1 Effects of Clostridium butyricum on thigh muscle intramuscular fat content of broilers |
由图 2可知，与对照组相比，饲粮中添加丁酸梭菌显著降低了21日龄肉鸡腿肌HSL活性(P < 0.05)，显著提高了21日龄肉鸡腿肌LPL活性(P < 0.05)，且具有增加42日龄肉鸡腿肌LPL活性的趋势(0.05 < P < 0.10)，但对42日龄肉鸡腿肌HSL活性无显著影响(P > 0.05)。
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图 2 丁酸梭菌对肉鸡腿肌脂肪代谢酶活性的影响 Figure 2 Effects of Clostridium butyricum on thigh muscle lipid metabolism enzyme activities of broilers |
由图 3可知，与对照组相比，饲粮中添加丁酸梭菌显著降低了21日龄肉鸡血清FT3含量(P < 0.05)，但对21日龄肉鸡血清FT4含量以及42日龄肉鸡血清FT3和FT4含量均无显著影响(P > 0.05)。
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图 3 丁酸梭菌对肉鸡血清激素含量的影响 Figure 3 Effects of Clostridium butyricum on serum hormone contents of broilers |
由图 4可知，与对照组相比，饲粮中添加丁酸梭菌显著降低了21日龄肉鸡腿肌ATGL mRNA表达量(P < 0.05)，但对21和42日龄肉鸡腿肌H-FABP、A-FABP、CPT1、CPT2、LCAD和LPL mRNA表达量均无显著影响(P > 0.05)。
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H-FABP：心脏型脂肪酸结合蛋白heart type-fatty acid binding protein；A-FABP：脂肪型脂肪酸结合蛋白adipocyte fatty-acid binding protein；ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶adiposetfiglycefidelipase；CPT1：肉碱脂酰转移酶1 carnitine palmityl transferase 1；CPT2：肉碱脂酰转移酶2 carnitine palmityl transferase 2；LCAD：长链乙酰辅酶A脱氢酶long-chain acyl-CoA dehydrogenase；LPL：脂蛋白脂酶lipoprteinlipase。 图 4 丁酸梭菌对肉鸡腿肌脂肪代谢相关基因表达量的影响 Figure 4 Effects of Clostridium butyricum on thigh muscle lipid metabolism related gene expression of broilers |
鸡腿肉是市场上深受消费者喜爱的主要肉产品之一，但随着人类生活质量的不断提高，消费者逐渐对鸡腿肉的肉品质提出了越来越高的要求，而肌内脂肪含量的增加正是提高其肌肉风味和肌肉嫩度的关键。目前，已有研究证明肠道菌群结构可以影响动物的脂肪沉积，且肠道厚壁菌门数量与动物脂肪沉积量呈正比，拟杆菌门数量与动物脂肪沉积量呈反比[6]。作者前期研究发现，饲粮中添加1×109 CFU/kg丁酸梭菌显著降低了21日龄肉鸡盲肠拟杆菌门数量，但对21和42日龄肉鸡盲肠厚壁菌门数量无显著影响[4]，这恰好与本研究中丁酸梭菌显著提高了21日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量，但对42日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量无显著影响的现象对应。本试验21日龄时丁酸梭菌组高的腿肌肌内脂肪含量表明饲粮中添加1×109 CFU/kg丁酸梭菌可以提高21日龄肉鸡的腿肌肌肉品质。其机制可能是1~21日龄阶段肉鸡肠道菌群尚不完善，此时丁酸梭菌的添加更易促进肉鸡健康肠道微生态环境的生成[3, 11]，而健康肠道微生态环境可以通过一系列复杂的信息传递过程最终促进动物营养物质的消化吸收以及骨骼肌的脂肪沉积[1]。目前，关于丁酸梭菌对肉鸡腿肌肌内脂肪含量影响的研究相对较少。Zhao等[4]研究表明，饲粮中添加1×109 CFU/kg丁酸梭菌B1(CGMCC 4845) 显著提高了42日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量，但对21日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量无显著影响。廖秀冬[11]研究指出，饲粮中添加1×109 CFU/kg丁酸梭菌(CGMCC 8187) 对42日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量无影响。这些试验结果的差异可能与各个试验所采用的肉鸡品种、丁酸梭菌菌种、饲粮组成和饲养管理水平不同有关。
3.2 丁酸梭菌对肉鸡腿肌脂肪代谢酶活性和基因表达量的影响脂肪沉积是脂肪合成和脂肪分解的净产物。对于肉鸡而言，其脂质代谢和调控与哺乳动物大不相同，体内脂肪主要来源于肝脏内的合成和肠道内的消化吸收，而骨骼肌中脂肪的生成十分有限，因此，对于“定向”提高肉鸡骨骼肌肌内脂肪而言，研究骨骼肌脂肪酸摄取和脂肪分解过程显得更为重要。
H-FABP和A-FABP均属于脂肪酸结合蛋白(FABPs)家族，是一些小分子的细胞内蛋白，其主要功能是参与细胞内脂肪酸的摄取，并协助其运输，近年来研究表明，H-FABP和A-FABP的表达与肉鸡肌内脂肪的沉积密切相关[12-13]。本试验中，丁酸梭菌组21和42日龄肉鸡显现出来的腿肌中未改变的H-FABP和A-FABP mRNA表达的结果表明，饲粮添加丁酸梭菌未影响到肉鸡腿肌的脂肪酸摄取。
肉鸡骨骼肌脂肪分解成脂肪酸时需要HSL和ATGL 2种关键限速酶的作用。其中HSL可以将甘油三酯(TG)逐级水解为单酰脂肪酸，且其对甘油二酯(DG)的水解活性比对TG高10倍[14]；而ATGL则主要水解TG，在TG水解为DG这一步骤中发挥主导作用[15-16]。在正常骨骼肌细胞中，脂肪分解后产生的脂肪酸的氧化分解主要在线粒体基质中进行。脂肪酸在进入线粒体基质中进行β氧化之前，必须先在胞液中脂酰辅酶A合成酶的催化下被活化成脂酰辅酶A。短链或中长链的脂酰辅酶A分子(10个碳原子以下)可容易地渗透通过线粒体内膜，但长链脂酰辅酶A难以通过线粒体内膜，必须有载体肉碱的参与，并通过线粒体肉碱脂酰转移酶系统的转运才能进入到线粒体基质中，然后在LCAD的催化下进行β氧化[17]。线粒体肉碱脂酰转移酶系统主要由位于线粒体膜外侧的CPT1和位于膜中间的肉碱/脂酰肉碱移位酶以及位于膜内侧的CPT2组成。其中，CPT1催化长链脂酰辅酶A与肉碱结合生成脂酰肉碱，是脂肪酸β氧化过程中的一种限速酶[18]。因此，本试验选择HSL、ATGL、CPT1、CPT2和LCAD等涉及肉鸡骨骼肌脂肪分解的关键酶活性和基因表达进行了测定。本试验中，丁酸梭菌组21日龄肉鸡腿肌低的HSL活性和ATGL mRNA表达量表明，饲粮添加丁酸梭菌可以降低21日龄肉鸡腿肌的脂肪分解且主要作用于骨骼肌脂肪分解成脂肪酸这一步。
LPL主要由脂肪细胞、骨骼肌细胞和乳腺细胞等多种实质细胞合成，在肝外组织毛细血管内皮的腔面发挥作用。LPL能够催化血液中乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)所携带的TG水解成甘油和脂肪酸，从而向脂肪组织提供合成TG的原料，促进脂肪的沉积[19]。Voshol等[20]研究表明，高LPL活性与提高的肌肉内的脂肪沉积相关。因此，丁酸梭菌组21日龄肉鸡具有高的腿肌肌内脂肪含量可能与丁酸梭菌可以提高21日龄肉鸡腿肌中LPL活性有关。而丁酸梭菌组21日龄肉鸡显现出来的腿肌中未改变的LPL mRNA表达量表明腿肌中高的LPL活性未必与其对应的mRNA表达量相一致，其原因在于丁酸梭菌可能更多的是通过一系列复杂的过程改变LPL结构而非其含量来使LPL活性得以提高。
本试验中，饲粮添加丁酸梭菌降低21日龄肉鸡腿肌HSL活性和ATGL mRNA表达量、提高21日龄肉鸡腿肌LPL活性的现象可以解释为丁酸梭菌可以改变21日龄肉鸡的肠道微生物组成[3-4]，从而抑制了肠上皮细胞血管生成素样蛋白4(ANGPTL4) 的生成，使得通过血液进入动物骨骼肌的ANGPTL4含量减少[1]，进而缓解了ANGPTL4对LPL活性的抑制[1, 21]以及降低了动物骨骼肌的脂肪分解(如降低ATGL mRNA表达量等)[22]，但这有待于进一步研究证实。
关于丁酸梭菌对肉鸡腿肌脂肪代谢酶活性和基因表达量影响的研究很少。Zhao等[4]研究表明，饲粮中添加1×109 CFU/kg丁酸梭菌B1(CGMCC 4845) 对21和42日龄肉鸡腿肌中的HSL和LPL活性均无影响，但具有提高42日龄肉鸡腿肌LPL mRNA表达量的趋势。其试验结果与本试验有差异的原因可能在于2个试验所采用的肉鸡品种、丁酸梭菌菌种和饲养管理水平不同。
3.3 丁酸梭菌对肉鸡血清激素含量的影响甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素2种，具有刺激脂肪合成和促进脂肪分解的双重功能，且分解高于合成[23]。甲状腺激素能够增加脂肪组织对儿茶酚胺和胰高血糖素的敏感性，增加脂肪组织中腺苷酸环化酶的活性，使ATP转化为环磷酸腺苷(cAMP)，cAMP作为第2信使激活cAMP-依赖性蛋白激酶，使无活性的HSL转变为有活性的HSL，促进脂肪组织脂解过程加快[24]。本试验中，丁酸梭菌组21日龄肉鸡血清中低的FT3含量表明添加丁酸梭菌降低了21日龄肉鸡脂肪分解能力，这正与本试验发现的丁酸梭菌显著增加了21日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量，降低了其腿肌HSL活性和ATGL mRNA表达量相对应。
4 结论① 饲粮中添加丁酸梭菌可以显著提高21日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量，但对42日龄肉鸡腿肌肌内脂肪含量无显著影响。
② 饲粮中添加丁酸梭菌可以显著降低21日龄肉鸡腿肌HSL活性和ATGL mRNA表达量，显著降低21日龄肉鸡血清FT3含量，显著提高21日龄肉鸡腿肌LPL活性，但对42日龄肉鸡腿肌脂肪代谢酶活性和基因表达量以及血清激素含量均无显著影响。
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