动物营养学报    2017, Vol. 29 Issue (8): 2893-2905    PDF    
维生素E对日本沼虾生长性能、抗氧化性能及抗氨氮胁迫能力的影响
孔有琴1, 丁志丽1, 张易祥1, 罗娜1,2, 叶金云1     
1. 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室, 中国水产科学研究院水生动物繁育与营养重点实验室, 湖州师范学院生命科学学院, 湖州 313000;
2. 大连海洋大学水产与生命科学学院, 大连 116000
摘要: 本试验旨在研究饲料中维生素E水平对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)幼虾生长性能、抗氧化性能和抗氨氮胁迫能力的影响。选择健壮、平均初始体重为(0.119±0.004)g的900只日本沼虾幼虾,随机分为6个组,每组3个重复,每个重复50只。以维生素E乙酯为添加形式,配制6组维生素E实际含量分别为18.31、37.94、66.07、120.25、212.68和388.96 mg/kg的半纯化饲料(分别记为VE1、VE2、VE3、VE4、VE5和VE6组),饲喂8周,随后进行24 h氨氮胁迫试验。结果显示:1)各组日本沼虾成活率(SR)无显著差异(P > 0.05);随饲料维生素E水平的增加,日本沼虾增重率(WGR)呈先增加后下降的变化趋势,VE4组最高,且显著高于VE1组(P < 0.05);饲料系数(FCR)变化趋势则与WGR相反,VE4组最低,且显著低于VE1组(P < 0.05)。2)氨氮胁迫前,各组日本沼虾肝胰腺中丙二醛(MDA)含量随饲料维生素E水平的增加呈先下降后上升的变化趋势,在VE3组达到最低,且显著低于VE1、VE5和VE6组(P < 0.05);各组日本沼虾肝胰腺总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和总抗氧化力(T-AOC)随饲料维生素E水平的增加呈先上升后下降的变化趋势。VE1和VE6组日本沼虾硫氧还蛋白(Trx)mRNA表达量较高,硫氧还蛋白还原酶(TrxR)mRNA表达量则较低。VE3组热休克蛋白60(HSP60)mRNA表达量显著低于其他各组(P < 0.05),VE1组热休克同源蛋白70(HSC70)mRNA表达量显著低于其他各组(P < 0.05),VE1和VE2组热休克蛋白90(HSP90)mRNA表达显著高于其他各组(P < 0.05)。3)氨氮胁迫后,各组日本沼虾肝胰腺SOD、CAT、GSH-Px活力,MDA含量,TrxTrxRHSC70 mRNA表达量的变化趋势与胁迫前相似,HSP60和HSP90 mRNA表达量变化与胁迫前相反。氨氮胁迫可降低日本沼虾肝胰腺GSH-Px活力、T-AOC及TrxTrxR mRNA表达量,提高MDA含量及VE4、VE5和VE6组SOD活力。由此可见,饲料中添加120.25 mg/kg维生素E对日本沼虾的生长具有积极的促进作用,饲料中添加66.07、120.25和212.68 mg/kg的维生素E可提高日本沼虾抗氧化性能和抗氨氮胁迫能力。
关键词: 日本沼虾     维生素E     生长     抗氧化力     氨氮    
Effects of Dietary Vitamin E on Growth Performance, Antioxidant Ability and Resistance to Ammonia Nitrogen Stress of Macrobrachium nipponense
KONG Youqin1, DING Zhili1, ZHANG Yixiang1, LUO Na1,2, YE Jinyun1     
1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development, Key Laboratory of Aquatic Animal Genetic Breeding and Nutrition, Chinese Academy of Fishery Sciences, College of Life Sciences, Huzhou University, Huzhou 313000, China;
2. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116000, China
Abstract: The present experiment was conducted to evaluate the effects of dietary vitamin E level on growth performance, antioxidant ability and resistance to ammonia nitrogen stress of juvenile Macrobrachium nipponense. A total of 900 healthy juvenile Macrobrachium nipponense with the body weight of (0.119±0.004) g were selected and randomly divided into 6 groups with 3 replicates per group and 50 shrimps per replicate. Vitamin E acetate was added to basal semi-purified diet at six levels to make diets with the actual content of 18.31, 37.94, 66.07, 120.25, 212.68 and 388.96 mg /kg vitamin E (denoted by VE1, VE2, VE3, VE4, VE5 and VE6 groups, respectively), and feeding for 8 weeks. After the feeding experiment, the prawns were subjected to ammonia nitrogen stress for 24 h. The results showed as follows: 1) the survival rate of Macrobrachium nipponense in each group had no significant difference (P > 0.05). The weight gain rate showed a trend of firstly increased and then decreased with the dietary vitamin E increasing, and prawns in VE4 group gained the highest value and significantly higher than that in VE1 group (P < 0.05). The feed conversion rate had the opposite pattern from the weight gain rate, the lowest value were found in VE4 group and significantly lower than that in VE1 group (P < 0.05). 2) Before ammonia nitrogen stress, the maleic dialdehyde (MDA) content in hepatopancreas exhibited a trend of firstly decreased and then increased with dietary vitamin E increasing, the lowest value was found in VE3 group and significantly lower than that in VE1, VE5 and VE6 groups (P < 0.05), whereas the activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and total antioxidant competence (T-AOC) in hepatopancreas exhibited a trend of firstly increased and then decreased with dietary vitamin E increasing. VE1 and VE6 groups gained the higher thioredoxin (Trx) mRNA expression and the lower thioredoxin reductase (TrxR) mRNA expression. The heat shock protein 60 (HSP60) mRNA expression in VE3 group was significantly lower than that in other groups (P < 0.05), the heat shock cognate 70 (HSC70) mRNA expression in VE1 group was significantly lower than that in other groups (P < 0.05), the heat shock protein 90 (HSP90) mRNA expression in VE1 and VE2 group was significantly higher than that in other groups (P < 0.05). 3) After ammonia nitrogen stress, the SOD, CAT and GSH-Px activities, MDA content and the mRNA expressions of Trx, TrxR and HSC70 of Macrobrachium nipponense in each group had the similar pattern with the before stress, but the mRNA expressions of HSP90 and HSP60 exhibited an opposite trend with the before stress. Ammonia nitrogen stress decreased the GSH-Px activities and T-AOC and the mRNA expressions of Trx and TrxR, increased MDA content and SOD activity of VE4, VE5 and VE6 groups. In conclusion, the results demonstrate that 120.25 mg/kg of dietary vitamin E increase the growth of Macrobrachium nipponense, 66.06, 120.25 and 212.68 mg/kg of dietary vitamin E enhance antioxidant activity and alleviated the toxicity of ammonia nitrogen stress of Macrobrachium nipponense.
Key words: Macrobrachium nipponense     vitamin E     growth     antioxidant ability     ammonia nitrogen    

维生素E(vitamin E)是维持动物体正常生长和生理功能所必需的一种微量营养素[1]。生理上,维生素E参与机体的抗氧化、细胞信号传导、生殖发育、免疫调节、抗应激等过程[2-3]。在水产动物的营养生理研究中,维生素E的抗氧化和抗应激作用一直备受研究者的关注。如饲料中添加适量的维生素E可显著提高斑节对虾(Penaeus monodon)肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低丙二醛(MDA)含量[4];显著提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)SOD、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力[5]。与此同时,维生素E对农药[6-7]、重金属污染[8]、拥挤应激[9]及高脂饲料[10]等产生的胁迫具有有效的保护作用。

随着水质污染加剧和集约化养殖的快速发展,氨氮成为水产动物养殖环境中最常见的胁迫因子之一。氨氮胁迫可严重影响机体的生长、呼吸、抗氧化和免疫等生理功能[11-13],过量的氨氮被认为是环境因素导致虾蟹疾病的重要原因之一[14]。研究发现,营养调控是缓解胁迫的一种简单、有效的技术手段之一[15]。如维生素E可有效缓解氨氮胁迫对青鱼(Mylopharyngodon piceus)[16]、云纹石斑鱼(Epinehelus moara)[17]的不利作用。

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称河虾、青虾,属节肢动物门、甲壳纲、十足目、长臂虾科、沼虾属[18]。日本沼虾因为其口味鲜美、营养价值高,成为中国、日本和其他东南亚国家主要淡水养殖品种之一,在我国的养殖区主要集中于长江中下游一带,比如浙江、江苏、安徽等省份[19]。据最新统计,2015年全国日本沼虾的年产量达到26.5万t,比2014年增长了2.88%[20]。日本沼虾养殖业的快速发展推动了对其生物学特性、营养生理学研究的需求,但目前对日本沼虾的营养生理的研究还较滞后,现有的研究多集中于蛋白质[19-21]、脂类[22]、部分微量元素[23-24]等,关于维生素E的营养生理学研究还鲜有报道。本文拟用含不同维生素E含量的饲料投喂日本沼虾幼虾,探讨维生素E对日本沼虾生长性能、抗氧化性能和抗氨氮胁迫能力的影响,以期为该虾配合饲料的开发和绿色健康养殖提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 试验设计

试验用日本沼虾购自于浙江湖州南浔一养殖场,正式试验前先暂养1周,使日本沼虾适应养殖环境。而后选择健壮活泼、平均初始体重为(0.119±0.004) g的900只日本沼虾幼虾,随机分为6个组,每组3个重复,每个重复50只。日本沼虾幼虾随机放入到18只体积为300 L的水槽中进行养殖试验,每个水槽放50只日本沼虾。正式养殖试验共持续8周。

1.2 试验饲料

以酪蛋白和鱼粉作为蛋白质源,鱼油和大豆油作为脂肪源,玉米淀粉作为糖源,配制基础饲料,基础饲料组成及营养水平见表 1。按照试验设计,添加相应含量维生素E乙酯(Sigma,美国)到基础饲料中,配制6组维生素E水平分别为0、25、50、100、200和400 mg/kg的试验饲料(分别记为VE1、VE2、VE3、VE4、VE5和VE6组)。试验饲料按以下方法进行制备:首先用粉碎机将原料粉碎并过80目筛,然后按需要准确称取各种原料,逐级均匀混合,加入鱼油和豆油再次混匀,同时添加一定的水搅拌混匀,最后用小型饲料造粒机制成粒径为1.5 mm的颗粒饲料,置于40 ℃烘箱烘干至水分含量为10%左右,用自封袋封装后于-20 ℃保存备用。

表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

采用中华人民共和国国家标准GB/T 17812—2008的高效液相色谱法测得各组试验饲料中维生素E实际含量分别为18.31、37.94、66.07、120.25、212.68和388.96 mg/kg。按照AOAC(1995)[25]标准,测定饲料常规成分,每个样品设置3个平行。粗蛋白质含量测定采用凯氏定氮法测定;粗脂肪含量采用索氏抽提法测定;粗灰分含量测定是先于200 ℃碳化样品至不冒烟,再于550 ℃马弗炉中灼烧至恒重;水分含量是采用在105 ℃烘干到恒重的方法进行测定。

1.3 养殖管理

养殖试验于2015年7—9月于浙江湖州壮大水产养殖场进行。试验期间连续充氧保持溶氧浓度>6.5 mg/L。养殖的水质条件为:水温25~30 ℃,总氨氮浓度 < 0.1 mg/L。养殖期间,每天投喂饲料2次,分别在08:00和16:00投喂。光照为自然光照,养殖水为自然河水。为了保持养殖水质,每天吸出日本沼虾排泄物并换1/3的养殖水量。每只水槽内放置一定量的网片作为日本沼虾的躲避物,以减少沼虾为争抢饲料而进行互相残杀。

1.4 样品采集

养殖试验结束后,养殖虾饥饿24 h,计数、称重用于生长指标的分析。采集各组日本沼虾肝胰腺,-80 ℃保存,用于后续抗氧化相关酶指标测定及基因表达分析。

1.5 氨氮胁迫试验

养殖试验结束后,每组留取60只日本沼虾(每个水槽留20只)用于氨氮胁迫试验,胁迫试验每组设3个平行,每个平行20只虾。根据Wang等[26]试验结果,设定氨氮胁迫试验的总氨氮浓度为37 mg/L。胁迫用试剂为氯化铵,先配制10 g/L的氯化铵母液,而后根据水槽体积将适量母液加入,以调成所设定的胁迫浓度(37 mg/L)。水体中氨氮浓度采用纳氏试剂法[27]测定,每隔6 h测定养殖水体氨氮浓度并用氯化铵母液进行调节。胁迫24 h后,采集日本沼虾肝胰腺并于-80 ℃用于后续的抗氧化相关指标测定和基因表达分析。

1.6 指标测定 1.6.1 生长性能指标的测定

生长性能相关指标按照以下公式进行计算:

1.6.2 肝胰腺抗氧化酶活力及MDA含量测定

准确称取肝胰腺0.50~0.70 g于2 mL无菌离心管中,加入9倍体积的预冷生理盐水,电动匀浆10~20 s,制成10%匀浆液。4 ℃、4000 r/min离心10 min,收集上清液(即为待测液)用于后续的抗氧化酶活力和MDA含量测定。测定时,每组设3个重复。待测液中蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法进行测定。抗氧化酶活力和MDA含量测定采用相应的各商用试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

SOD活力测定:采用Elstner等[28]的黄嘌呤氧化酶法。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统生成超氧根离子(O2-·),而后O2-·会氧化羟胺生成在显色剂的作用下呈现紫红色的亚硝酸盐。当被测样品中含SOD时,SOD会专一性的抑制O2-的生成,从而减少亚硝酸盐的产生量。1 mg组织蛋白质在1 mL反应液中SOD抑制效率达到1/2时所对应的SOD量定义为1个SOD活力单位(U)。

CAT活力测定:采用Aebi[29]的方法, 以过氧化氢(H2O2)含量的减少来进行测定。每分钟还原1 μmol H2O2所需CAT的量定义为1个CAT活力单位。

GSH-Px活力测定:通过分析GSH-Px催化的谷胱甘肽(GSH)与H2O2的反应中GSH的减少量来测定酶活力[30]。1 mg组织蛋白质,去除非酶反应的作用,每分钟使反应体系中GSH浓度下降1 μmol/L时定义为1个GSH-Px活力单位。

T-AOC测定:机体内铁离子在抗氧化物质催化下还原生成的亚铁离子与啡啉类物质形成稳定络合物,通过520 nm光吸收值变化测定抗氧化能力的高低[31]。37 ℃下,每分钟时间内,1 mg组织蛋白质使反应体系的吸光度值每增加0.01时定义为1个T-AOC单位。

采用硫代巴比妥酸(TBA)法[32]测定日本沼虾肝胰腺组织中MDA含量变化,以此来评估机体脂质过氧化的程度。硫代巴比妥酸与脂质过氧化中的产物MDA缩合形成红色产物,根据颜色变化于532 nm进行比色。

1.6.3 抗氧化相关基因mRNA表达量分析

采用组织/细胞RNA快速提取试剂盒(Aidlab,北京)提取各组总RNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性,与此同时,RNA纯度和浓度用Thermo NanoDrop 2000核酸蛋白测定仪检测。用TaKaRa(大连)反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit将总RNA反转录合成cDNA,并于-20 ℃保存备用。

用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)对胁迫前后各组日本沼虾肝胰腺中热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)60和90、热休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70,HSC70)、硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)的mRNA表达量进行定量分析,β肌动蛋白(β-actin)作为qRT-PCR反应中的内参基因。测定时,每组设3个重复。qRT-PCR所用引物见表 2。采用康为CWBIO(北京)的实时荧光定量试剂盒UltraSYBR Mixture进行PCR反应。PCR反应体积为20 μL,包括10 μL 2 × UltraSYBRMixture、正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL、1 μL cDNA、8 μL ddH2O。qRT-PCR反应条件为:95 ℃预变性10 min,94 ℃变性15 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40个循环;PCR反应后绘制熔解曲线以判断扩增产物的正确性,温度以0.5 ℃/5 s的速度从60 ℃上升到95 ℃。使用2-ΔΔCt方法对目的基因mRNA表达量进行分析[33]

表 2 qRT-PCR引物序列 Table 2 Primer sequence for qRT-PCR
1.7 统计分析

试验数据用平均值±标准误表示。对胁迫前或胁迫后,不同维生素E水平组间数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),当不同组间有显著差异时,用Turkey法检验进行多重比较;同一组胁迫前后采用t检验方法进行分析,显著水平为0.05,所有数据均使用SPSS 19.0软件进行处理分析。成活率数据在分析前先进行反正弦转换。

2 结果 2.1 维生素E对日本沼虾生长性能的影响

表 3可见,日本沼虾的成活率不受饲料中维生素E水平的影响,虽然VE4组的成活率达到最高(86%),但各组间没有显著性差异(P > 0.05)。随着饲料中维生素E水平的增加,日本沼虾的增重率呈现先升高后下降的变化趋势,VE4组达到最高,且显著高于VE1组(P < 0.05),但与其余4组的差异不显著(P > 0.05)。各组日本沼虾的饲料系数呈与增重率相反的变化趋势,VE4组最低,且显著低于VE1组(P < 0.05)。饲料维生素E水平对日本沼虾摄食率的影响不显著(P > 0.05)。

表 3 维生素E对日本沼虾生长性能的影响 Table 3 Effects of viatmin E on growth performance of Macrobrachium nipponense
2.2 维生素E对日本沼虾肝胰腺抗氧化酶活力及MDA含量的影响

图 1所示,饲料维生素E水平对日本沼虾肝胰腺的抗氧化酶活力和MDA含量均产生影响。胁迫前,随着饲料维生素E水平的增加,日本沼虾肝胰腺的SOD活力也随之增加,并于VE4组(120.25 mg/kg)达到最高,而后呈下降趋势,且VE4组肝胰腺的SOD活力显著高于VE1和VE2组(P < 0.05),但与VE3、VE5和VE6组相比差异不显著(P>0.05)。胁迫后,肝胰腺的SOD活力变化趋势与胁迫前类似,在VE5组(212.68 mg/kg)达到最高,显著高于其他各组(P < 0.05),VE1和VE2组肝胰腺的SOD活力显著低于其他各组(P < 0.05)。VE3、VE4、VE5和VE6组胁迫后日本沼虾肝胰腺的SOD活力均显著高于胁迫前(P < 0.05),VE1和VE2组胁迫前后日本沼虾肝胰腺的SOD活力差异不显著(P > 0.05)。

数据柱上标不同字母表示组间差异显著(P < 0.05),*表示胁迫前后差异显著(P < 0.05)。下图同。 Value columns with different letters mean significant difference among different groups (P < 0.05), and * mean significant difference between before and after stress (P < 0.05). The same as below. 图 1 维生素E对胁迫前后日本沼虾肝胰腺SOD(A)、CAT(B)、GSH-Px活力(C)和T-AOC(D)及MDA含量(E)的影响 Figure 1 Effects of vitamin E on SOD (A), CAT (B), GSH-Px activities (C) and T-AOC (D) and MDA content (E) in hepatopancreas of Macrobrachium nipponense before and after stress

随饲料维生素E水平的变化,胁迫前后日本沼虾肝胰腺的GSH-Px、CAT活力和T-AOC均呈与胁迫前肝胰腺的SOD活力类似的变化趋势。胁迫前后,VE4和VE5组日本沼虾肝胰腺的GSH-Px活力均较高,且显著高于VE1、VE2和VE6组(P < 0.05)。除VE2组胁迫前后日本沼虾肝胰腺的GSH-Px活力无显著差异(P > 0.05) 外,其余组胁迫后肝胰腺的GSH-Px活力均显著低于胁迫前(P < 0.05)。

无论胁迫前还是胁迫后,VE3、VE4和VE5组日本沼虾肝胰腺的CAT活力均较高,VE1组则最低;与胁迫前相比,VE3组胁迫后日本沼虾肝胰腺的CAT活力显著降低(P < 0.05),其余各组胁迫前后肝胰腺的CAT活力差异不显著(P > 0.05)。无论胁迫前后,VE5组肝胰腺的T-AOC均为最高,其次是VE3和VE4组;VE1、VE2和VE6组肝胰腺的T-AOC较低,显著低于VE5组(P < 0.05)。与胁迫前相比,胁迫后各组肝胰腺的T-AOC均显著下降(P < 0.05)。

随着饲料维生素E水平的升高,胁迫前或胁迫后日本沼虾肝胰腺的MDA含量均呈先下降后上升的变化趋势,在VE2、VE3和VE4组(37.94~120.25 mg/kg)含量较低,且显著低于VE6组(P < 0.05)。与胁迫前相比,胁迫后各组肝胰腺的MDA含量均升高,且VE1、VE3、VE4和VE6组胁迫后的肝胰腺的MDA含量显著高于胁迫前(P < 0.05)。

2.3 维生素E对日本沼虾肝胰腺抗氧化相关基因mRNA表达量表达的影响

图 2所示,胁迫前,随饲料维生素E水平的增加,日本沼虾肝胰腺HSP60 mRNA表达量呈先下降后上升的变化趋势,VE3组肝胰腺HSP60 mRNA表达量最低,显著低于其他各组(P < 0.05);VE6组肝胰腺HSP60 mRNA表达量最高,显著高于其他各组(P < 0.05)。胁迫后,各组肝胰腺HSP60 mRNA表达量变化趋势与胁迫前相反,VE3组最高,且显著高于VE1和VE2组(P < 0.05)。胁迫后VE3组肝胰腺HSP60 mRNA表达量显著高于胁迫前(P < 0.05);其余各组肝胰腺HSP60 mRNA表达量均低于胁迫前,且VE1、VE4和VE6组显著低于胁迫前(P < 0.05)。

图 2 维生素E对胁迫前后日本沼虾肝胰腺HSP60(A)、HSC70(B)和HSP90 mRNA(C)表达量的影响 Figure 2 Effects of viatamin E on mRNA expressions of HSP60 (A), HSC70 (B) and HSP90 (C) in hepatopancreas of Macrobrachium nipponense before and after stress

无论胁迫前后,VE3、VE4、VE5和VE6组日本沼虾肝胰腺HSC70 mRNA表达量均较高,显著高于VE1组(P < 0.05)。胁迫后各组肝胰腺HSC70 mRNA表达量均低于胁迫前,且在VE1组差异显著(P < 0.05)。

胁迫前,日本沼虾肝胰腺HSP90 mRNA表达量随饲料维生素E水平增加呈下降趋势,VE1和VE2组的肝胰腺HSP90 mRNA表达量显著高于其他各组(P < 0.05);胁迫后,随饲料维生素E水平增加,肝胰腺HSP90 mRNA表达量呈先升高后下降变化趋势,且VE3组显著高于其他各组(P < 0.05),VE1组显著低于其他各组(P < 0.05)。氨氮胁迫显著降低各组肝胰腺HSP90 mRNA表达量(P < 0.05)。

图 3所示,随饲料维生素E水平的增加,胁迫前后各组日本沼虾肝胰腺Trx mRNA表达量呈先下降后上升的变化趋势,VE2、VE3、VE4和VE5组肝胰腺Trx mRNA表达量较低,且胁迫前显著低于VE6组(P < 0.05)。胁迫后肝胰腺Trx mRNA表达量低于胁迫前,除VE3、VE4和VE5组胁迫前后差异不显著(P > 0.05) 外,其余3组胁迫后显著低于胁迫前(P < 0.05)。

图 3 维生素E对胁迫前后日本沼虾肝胰腺Trx(A)和TrxR mRNA(B)表达量的影响 Figure 3 Effects of viatamin E on mRNA expressions of Trx (A) and TrxR (B) in hepatopancreas of Macrobrachium nipponense before and after stress

胁迫前后日本沼虾肝胰腺TrxR mRNA表达量先是随着饲料维生素E水平的增加而增加,VE2和VE3组显著高于其余各组(P < 0.05),而后呈下降趋势。胁迫后VE2、VE3、VE4、VE5和VE6组肝胰腺TrxR mRNA表达量显著低于胁迫前(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 维生素E对日本沼虾生长性能的影响

已有研究显示:饲料中添加维生素E可显著提高斑节对虾[4]、南美白对虾(Penaeus vannamei)[34]和大比目鱼(Scophthalmus maximus)[35]等的增重率或特定生长率,降低饲料系数[35]。本研究也发现饲料中添加维生素E可提高日本沼虾幼虾的生长性能,且维生素E含量为120.25 mg/kg(VE4组)时日本沼虾的生长性能达到最佳,饲料系数最低;低水平维生素E(18.31 mg/kg)对日本沼虾的生长性能产生抑制效应;高水平维生素E(388.87 mg/kg)虽与VE4组差异不显著,但呈下降的变化趋势,我们推测更高的饲料维生素E水平可能会对日本沼虾生长产生显著抑制效应。据报道,高水平的维生素E具有降低大比目鱼[35]、斑节对虾[4]生长性能的趋势,但对南美白对虾[34]、青鱼[16]的增重率或特定生长率无影响。可见,过量维生素E对不同物种的影响存在差异性,这可能是因为物种特异性、动物发育不同阶段和维生素E的不同添加形式等因素造成的。本研究中日本沼虾的增重率(278%~426%)低于商用饲料的试验结果[36],饲料系数偏高。这可能是因为日本沼虾属于杂食性偏食动物性饵料[37],对饲料中鱼粉含量变化比较敏感,半纯化饲料中鱼粉含量较低,降低饲料适口性,导致生长性能不佳[38-39]

3.2 维生素E对日本沼虾肝胰腺抗氧化性能的影响

MDA是脂质过氧化的产物,常被用来衡量机体内源性氧化损伤的状态。本研究发现维生素E缺乏和过量可提高日本沼虾肝胰腺MDA含量,添加适量维生素E(66.07~120.25 mg/kg)显著降低日本沼虾肝胰腺MDA含量。类似地,饲料中添加适量维生素E可显著降低草鱼(Ctenopharyngodon idella)[40]和军曹鱼(Rachycentron canadum)[41]组织中MDA的积累。可见饲料维生素E缺乏或过量可在日本沼虾体内诱导氧化胁迫。为了减少氧化胁迫,维持体内自由基的动态平衡,生物体进化出了多种抗氧化防御反应,比如专化的抗氧化酶如SOD、CAT和GSH-Px等[42]。本研究中,饲料维生素E水平对日本沼虾幼虾肝胰腺的抗氧化酶活力产生显著影响,维生素E含量为66.07~212.68 mg/kg(VE3、VE4和VE5组)时可显著提高日本沼虾肝胰腺SOD、CAT和GSH-Px活力。此外,随着饲料维生素E水平的变化,T-AOC变化趋势与抗氧化酶活力类似。已有研究者在南美白对虾[5]、草鱼[40]、大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)[43]和罗非鱼[44]等物种中发现了相似的研究结果。

与此同时,动物体内的一些氧化还原系统如Trx系统在抗氧化方面也发挥着至关重要的作用。Trx系统由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、TrxR和Trx组成,可为体内多种酶提供电子,从而参与体内自由基清除、氧化还原状态的维持、细胞凋亡、DNA和蛋白质修复等生理过程[45]。目前研究多集中于各种胁迫下TrxTrxR mRNA表达量变化[46-47]。此外,机体营养水平与TrxTrxR mRNA表达量间的关系也有零星报道[48-50],这为通过营养学方法缓解胁迫提供依据。本研究结果显示,饲料维生素E水平显著影响日本沼虾肝胰腺TrxTrxR mRNA表达量。过低或过高维生素E水平可诱导日本沼虾Trx mRNA的表达,但安清聪等[50]发现维生素E缺乏抑制猪胎儿皮肤成纤维细胞中Trx的表达。这可能是因为维生素E对Trx基因表达的影响具有物种特异性,但具体机制有待进一步研究。外界因素如高温、感染、H2O2等易诱导Trx的表达[51]。维生素E作为一种抗氧化剂,其缺乏可在体内产生氧化胁迫,添加过量可能在体内产生促氧化作用[52]。本研究结果表明,维生素E缺乏或过量可使日本沼虾体内氧自由基增多,引起氧化胁迫,诱导了Trx的表达。然而,随着饲料中维生素E水平的变化,日本沼虾肝胰腺TrxR mRNA表达量变化与Trx mRNA表达量的变化趋势相反,添加适量的维生素E对TrxR mRNA表达量具有积极的促进作用。据报道,适量的硒可诱导机体TrxR的表达[49, 53]。可见,维生素E水平影响日本沼虾TrxR表达,过低或过高维生素E引起氧化胁迫,抑制基因的表达。

鉴于以上结果,我们可知维生素E缺乏,日本沼虾肝胰腺抗氧化能力降低,肝胰腺MDA含量升高,脂质过氧化,降低抗氧化相关酶活性或基因的表达;维生素E过高则带来促氧化作用,破坏日本沼虾体内的氧化-抗氧化动态平衡,自由基增多,产生氧化损伤,抑制了抗氧化酶的表达;但氧化应激诱导了Trx的表达以应对胁迫。

3.3 维生素E对日本沼虾肝胰腺HSP60、HSC70和HSP90 mRNA表达量的影响

HSP是生物细胞在受到应激原(生物应激、理化因素等)刺激后诱导产生的一类高度保守的蛋白质,在维持蛋白质构象、抗凋亡、细胞保护等方面具有积极作用[54]。研究发现,饲料中维生素E的缺乏或过量可显著诱导HSP60转录水平的表达。同时,维生素E缺乏组的HSP90 mRNA表达量也显著高于维生素E添加组,以上结果与适量维生素E可降低山羊HSP表达的规律相似[55]。这进一步说明维生素E不足或过量引起氧化胁迫,诱导日本沼虾高表达HSP60和HSP90以提供保护作用。HSC70为HSP70中的一种,属于热休克同源蛋白,在正常细胞中有较高的表达量,参与机体细胞的分裂、增殖及免疫等生理过程[56]。据报道,HSC70表达可受机体营养水平的影响,如团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih)HSC70 mRNA表达可受饲料维生素C的诱导[57]。在本研究中,维生素E缺乏显著降低了日本沼虾肝胰腺虾HSC70 mRNA表达量,表明补充维生素E能提高HSC70表达mRNA表达量,增强对机体的保护作用。

3.4 维生素E对氨氮胁迫日本沼虾的缓释作用

本研究发现,氨氮胁迫后,饲料的维生素E水平≥66.07 mg/kg组(VE3、VE4、VE5和VE6组)日本沼虾肝胰腺的SOD活力显著高于胁迫前,说明对于维生素E补充组,短期氨氮胁迫诱导了SOD的表达。类似地,有研究者发现短期氨氮胁迫也可显著提高克氏原螯虾(Procambarus clarkii)[58]、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)[59]的SOD活力。这可能因为是短期的胁迫会对SOD表达具有一种暂时的刺激兴奋效应[60],提高SOD表达,以提高机体应对胁迫的能力,但维生素E缺乏,则不能产生这种刺激效应。同时,氨氮胁迫显著降低了日本沼虾肝胰腺的T-AOC和GSH-Px活力,提高MDA含量,相似的研究结果发现于中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)[61]

据报道,胁迫可影响机体TrxRTrx的表达,如甲基汞暴露可降低鱼肝脏中Trx和TrxR活性[47];高浓度石英粉尘使人胚肺成纤维细胞的TrxTrxR基因和蛋白质水平表达显著下调[46]。与此类似,我们发现氨氮胁迫可降低日本沼虾肝胰腺TrxRTrx mRNA表达量,但VE3、VE4和VE5组Trx mRNA表达量在胁迫前后差异不显著。以上结果表明:氨氮胁迫可通过下调抗氧化酶活性和Trx系统中TrxTrxR mRNA表达量,导致体内氧化产物MDA积累,从而加重日本沼虾体内的氧化损伤。但胁迫后,适量维生素E组的T-AOC和GSH-Px、CAT活力及TrxTrxR mRNA表达量高于维生素E缺乏或过量组,说明添加适量水平的维生素E对氨氮胁迫具有一定的保护作用。

氨氮胁迫对日本沼虾肝胰腺HSP60、HSC70和HSP90 mRNA表达量产生不同影响。HSP90在正常细胞中具有较高表达量,参与信号传导、细胞降解、免疫等多个生理过程[62]。本研究发现氨氮胁迫显著抑制HSP90的表达,但胁迫后,添加适量维生素E组的HSP90 mRNA表达量显著高于维生素E缺乏和过量组。与此类似,氨氮胁迫48 h后可降低中国对虾HSP90的表达[61]。胁迫后VE1组HSC70 mRNA表达量显著低于胁迫前;胁迫后维生素E缺乏和过量组HSP60 mRNA表达量显著低于胁迫前,但VE3组HSP60 mRNA表达量显著高于胁迫前。可见,氨氮胁迫后HSP表达水平下降可能是氨氮胁迫诱导组织损伤有关,但添加适量的维生素E可以提高HSP表达,提高日本沼虾应对胁迫的能力。

4 结论

① 饲料维生素E水平对日本沼虾幼虾生长性能和抗氧化性能产生显著影响,适宜水平的维生素E(66.07~212.68 mg/kg)对其生长性能和抗氧化性能具有积极的促进作用。

② 维生素E缺乏或过量可诱导日本沼虾HSP60和HSP90 mRNA的表达,但对HSC70 mRNA表达产生抑制效应。

③ 氨氮胁迫降低了日本沼虾抗氧化性能,但添加适量的维生素E(66.07~212.68 mg/kg)可提高日本沼虾应对胁迫的能力。

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