2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室, 湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心, 长沙 410125
2. Hunan Provincial Engineering Research Center of Healthy Livestock, Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
蛋氨酸是必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，在机体内参与蛋白质合成，是半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和牛磺酸合成的前体物，并为肌酸、磷脂酰胆碱和多胺合成等转甲基化反应及DNA、RNA和组蛋白的甲基化提供甲基[1-2]。机体可通过对蛋氨酸限制的代谢适应提高线粒体的生物合成和功能及能量消耗，改变脂质和碳水化合物稳态，降低氧化损伤和炎症，延长寿命[3]。但是，蛋氨酸是蛋鸡的第一限制性氨基酸，限制其在饲粮中添加量会引起蛋鸡的产蛋率、蛋重、饲料利用率、体重下降以及肝脏脂质聚积[4-5]。这不仅是由于蛋氨酸缺乏影响了氨基酸平衡和蛋白质利用率，还与蛋氨酸代谢过程的改变有关，如甘氨酸、丝氨酸、胆碱、半胱氨酸和谷胱甘肽等代谢中间产物的水平变化[6]。不过，关于蛋氨酸缺乏对蛋氨酸代谢过程的具体影响还未有报道。本研究旨在以海兰灰蛋鸡为试验动物，通过研究饲粮中蛋氨酸缺乏对海兰灰蛋鸡生产性能、血清游离氨基酸含量和蛋氨酸代谢相关酶基因表达的影响，以期为蛋氨酸的科学利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验采用单因子完全随机试验设计。选取180只62周龄的海兰灰蛋鸡，根据产蛋率均匀分成3个组，每个组6个重复，每个重复10只鸡。对照组饲喂蛋氨酸水平为0.33%的饲粮(基础饲粮)，蛋氨酸缺乏组分别饲喂蛋氨酸水平为0.21%和0.27%的饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。蛋鸡饲养于三阶梯蛋鸡笼中，每笼2只鸡，每个重复随机分布在鸡舍，采用乳头式饮水器。夜间开灯补光，每天总光照时间为16 h。自由釆食和饮水，每天07:30和15:30各补料1次。试验期90 d。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
DL-蛋氨酸(纯度99%)购自法国安迪苏公司。
1.3 检测指标 1.3.1 生产性能试验期间以重复为单位记录每周采食量、每日产蛋数、破畸数、产蛋重和破畸重等。计算产蛋率、平均日产蛋重、平均日采食量、料蛋比、平均蛋重和不合格蛋率。
1.3.2 血清游离氨基酸含量于试验第90天，每组随机选取6只蛋鸡，颈脉采血，3 000 r/min离心10 min制备血清，-20 ℃保存。取600 μL血清加入600 mL 8%的磺基水杨酸漩涡混匀，4 ℃静置过夜，8 000 r/min离心10 min，取上清液，用过滤器(孔径0.22 μm)过滤，取500 μL过滤液于氨基酸分析仪进行游离氨基酸含量分析。
1.3.3 蛋氨酸代谢相关酶基因表达量在蛋鸡放血处死后，迅速剖腹取出肝脏，用液氮速冻并转至-80 ℃的冰箱内保存，用于实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR为10 μL体系，包括1 μL的cDNA模版、5 μL的SYBR Green荧光染料、0.3 μL的上游引物、0.3 μL的下游引物和3.4 μL的双蒸水。测定的基因包括甲硫氨酸腺苷转移酶1a(MAT1a)、DNA甲基转移酶1(Dnmt1)、DNA甲基转移酶3a(Dnmt3a)、N6-甲基腺苷(m6A)甲基转移酶3(METTL3)、m6A甲基转移酶14(METTL14)、甲硫氨酸腺苷高半胱氨酸酶(Ahcy)、5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶(MTR)、甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)，引物根据鸡的基因序列用NCBI设计(表 2)。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
数据以平均值和标准误表示，P＜0.05为差异显著。利用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。试验数据用统计SPSS 17.0进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，差异显著时，以Duncan氏法进行多重比较检验。
2 结果 2.1 蛋氨酸缺乏对蛋鸡生产性能的影响由表 3可知，饲粮蛋氨酸水平显著影响蛋鸡生产性能的各项指标(P＜0.05)。蛋鸡的产蛋率、平均日产蛋重和平均蛋重随饲粮蛋氨酸水平的提高而显著增加(P＜0.05)。0.33%蛋氨酸组(对照组)蛋鸡的平均日采食量和不合格蛋率均显著高于0.21%和0.27%蛋氨酸组(P＜0.05)。0.21%蛋氨酸组蛋鸡的料蛋比显著高于0.27%和0.33%蛋氨酸组(P＜0.05)。
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表 3 蛋氨酸缺乏对蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of methionine deficiency on performance of laying hens |
由表 4可知，蛋氨酸缺乏对蛋鸡血清中蛋氨酸的含量有显著的影响，随饲粮蛋氨酸水平的降低而显著降低(P＜0.05)。0.21%蛋氨酸组蛋鸡血清中丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量显著高于其他2组(P＜0.05)。0.27%蛋氨酸组蛋鸡血清中缬氨酸、异亮氨酸和精氨酸的含量显著低于0.21%和0.33%蛋氨酸组(P＜0.05)。0.27%蛋氨酸组蛋鸡血清中脯氨酸的含量显著低于0.21%蛋氨酸组(P＜0.05)。
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表 4 蛋氨酸缺乏对蛋鸡血清游离氨基酸含量的影响 Table 4 Effects of methionine deficiency on serum free amino acid contents of laying hens |
由表 5可知，饲粮蛋氨酸水平对MAT1a、Dnmt1、METTL3、METTL14、CBS和MTR在蛋鸡肝脏内的表达量有显著影响(P＜0.05)，但对Dnmt1、Ahcy和BHMT表达量无显著影响(P＞0.05)。0.21%蛋氨酸组蛋鸡肝脏中Dnmt1、METTL3和METTL14的表达量显著高于其他2组(P＜0.05)。0.27%蛋氨酸组蛋鸡肝脏中METTL3的表达量显著高于对照组(P＜0.05)。0.21%蛋氨酸组蛋鸡肝脏中MAT1a和MTR的表达量显著高于其他2组(P＜0.05)，CBS的表达量显著高于对照组(P＜0.05)。0.27%蛋氨酸组蛋鸡肝脏中MTR的表达量显著高于对照组(P＜0.05)。
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表 5 蛋氨酸缺乏对蛋鸡肝脏蛋氨酸代谢相关基因表达的影响 Table 5 Effects of methionine deficiency on expression of methionine metabolism related genes in laying hens' liver |
蛋氨酸是蛋鸡的第一限制性氨基酸，对蛋鸡的生产性能有重要的作用。研究表明，蛋氨酸含量较低时，提高蛋氨酸水平能够提高蛋鸡生产性能，当饲粮中蛋氨酸含量到一定水平时，继续添加蛋氨酸反而会降低生产性能[7-8]。本试验中，饲粮蛋氨酸均处于较低水平，0.33%蛋氨酸组蛋鸡的生产性能指标达到最高，但是料蛋比与0.27%蛋氨酸组无显著差异。Saki等[8]的研究结果表明，蛋氨酸水平从0.24%提高到0.34%能显著提高蛋鸡的产蛋率、平均蛋重、平均日产蛋重和平均日采食量并降低料蛋比。Harms等[9]的试验结果表明，饲粮蛋氨酸水平(0.20%~0.34%)对产蛋率、平均蛋重和平均日采食量有显著影响，当蛋氨酸水平高于0.28%后对上述指标无显著影响。但Keshavarz[10]的试验结果表明，54~72周龄的白色单冠来航蛋鸡饲粮蛋氨酸水平从0.36%降低到0.23%会显著降低产蛋率、平均蛋重和饲料利用率，但是对平均日产蛋重和平均日采食量无显著影响。
3.2 蛋氨酸缺乏对蛋鸡血清游离氨基酸含量的影响血清游离氨基酸的浓度在一定程度上可以反映动物体内氨基酸的代谢状况。由于氨基酸之间存在协同、替代、转换和拮抗的关系，饲粮中某种氨基酸的缺乏或过量均能造成氨基酸比例的失衡，影响自身或其他氨基酸的利用。本试验结果显示，饲粮蛋氨酸的水平会显著影响血清中一些氨基酸的含量和比例，如降低蛋氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸和精氨酸含量，提高丝氨酸和甘氨酸的含量。与本研究相似，吕明斌等[11]的试验结果也表明，饲粮蛋氨酸水平会影响丝氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的含量。Yodseranee等[12]在肉鸡上的试验结果也表明饲粮蛋氨酸水平会影响血浆蛋氨酸、半胱氨酸和牛磺酸的含量。
3.3 蛋氨酸缺乏对蛋鸡肝脏蛋氨酸代谢过程的影响动物摄入的蛋氨酸大约20%在胃肠道进行消化代谢，80%经过血液运送至细胞和组织，而一半以上的蛋氨酸在肝脏转化为S-腺苷甲硫氨酸，进入蛋氨酸代谢途径[13]。蛋氨酸通过消耗ATP在甲硫氨酸腺苷转移酶的作用下转化为S-腺苷甲硫氨酸，该酶主要由MAT1a编码[14]。90%以上的S-腺苷甲硫氨酸随后可在甲基转移酶的作下转化为S-腺苷同型半胱氨酸，该过程脱去的甲基可在甲基转移酶的作用，参与DNA和RNA的甲基化过程，从而调控基因的表达量及RNA介导的细胞通路[15-17]。本试验中蛋氨酸缺乏显著影响了Dnmt1、METTL3和METTL14的表达量，说明蛋氨酸缺乏可能影响DNA和RNA的甲基化过程。Mattocks等[6]发现，短期蛋氨酸缺乏能够改善成年C57BL/6J小鼠DNA甲基化维持系统的效率，提高肝脏整体DNA甲基化水平。但是Liu等[18]的试验结果为，低蛋氨酸组和高蛋氨酸组GC富集的肌肉生长抑制素基因外显子1区域的甲基化水平分别为46%和83%，而且如果GC富集的区域已经高度甲基化时，饲粮蛋氨酸摄入过量或不足会导致去甲基化。RNA的甲基化是RNA最常见和高丰度的修饰方式，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基在碳或氮原子上形成m6A[19]。METTL3是哺乳动物细胞中m6A甲基转移酶复合体的活性成分，敲除METTL3基因可能通过p53介导的途径，引起HeLa细胞总m6A水平会下降30%以及HepG2细胞的凋亡[20]。METTL14是另一种m6A甲基转移酶复合体的活性成分，可以与METTL3蛋白以1：1的化学计量比结合形成稳定二聚体复合物，调控细胞内m6A在mRNA上的沉积[21]。目前关于蛋氨酸缺乏对RNA甲基化的影响还未见报道，本试验中蛋氨酸缺乏显著提高了METTL3和METTL14的表达量，说明蛋氨酸缺乏可能会影响RNA的甲基化水平，但是与蛋氨酸缺乏的剂量有关。
S-腺苷同型半胱氨酸在Ahcy的作用下分解为腺苷和高半胱氨酸，该过程是可逆的非限速步骤，其代谢通量由S-腺苷同型半胱氨酸的合成及腺苷和高半胱氨酸消耗的速率而决定[22]。本试验中，3个组的Ahcy表达量没有显著差异，说明蛋氨酸缺乏可能对上述代谢物的比例无影响。高半胱氨酸随后的代谢途径有2条：一个是在MTR的作用下利用5-甲基-四氢叶酸和BHMT的作用下利用甜菜碱作为甲基供体甲基化再生成蛋氨酸，由此构成蛋氨酸的循环过程；另一个是在丝氨酸的参与下可被CBS催化发生转硫基作用形成胱硫醚，继而参与半胱氨酸、谷胱甘肽或牛磺酸合成和氧化降解等[23-24]。脱去甲基的四氢叶酸随后可经过循环过程重新生成5-甲基-四氢叶酸，该过程同时将丝氨酸转化为甘氨酸。本试验中，蛋氨酸缺乏对MAT1a、CBS和MTR表达量有显著影响，说明蛋氨酸缺乏可能影响高半胱氨酸在代谢途径。同时，高剂量蛋氨酸缺乏组蛋鸡血清中半胱氨酸的含量的降低及丝氨酸和甘氨酸含量显著积累，说明蛋氨酸缺乏可能降低了蛋氨酸的转硫基作用，增强了再甲基化途径，且转硫基作用的降低程度可能大于再甲基化途径的增加。研究表明，当蛋氨酸缺乏时，高半胱氨酸通过再甲基化生成蛋氨酸可保证甲基化反应的正常进行，尽管会降低α-丁酮酸和谷胱甘肽的合成[25]。相反，当蛋氨酸水平仅提高10%，就会导致高半胱氨酸合成效率提高2倍[22]。蛋氨酸负载试验表明，蛋氨酸负载可活化大鼠肝细胞中同型半胱氨酸的转硫化途径，同时抑制其再甲基化途径，会显著减弱BHMT和蛋氨酸合成酶活性，但不影响CBS的活性[26]。但是，本试验中蛋氨酸缺乏也显著提高了CBS的表达量。Tang等[27]研究表明，蛋氨酸剥夺会诱导组织通过S-腺苷甲硫氨酸的独立机制下调CBS蛋白关闭转硫基途径，从而高效保留蛋氨酸；但是在mRNA水平上CBS表达量并没有降低，甚至有所提高，这与本研究的结果相一致。
4 结论① 蛋氨酸缺乏显著降低了海兰灰蛋鸡产蛋后期的产蛋率、平均日产蛋重和平均蛋重，提高了料蛋比。
② 蛋氨酸缺乏显著提高了肝脏中Dnmt1、METTL3和METTL14的表达量，影响DNA和RNA的甲基化过程。
③ 蛋氨酸缺乏显著降低了血清中蛋氨酸的含量，提高了血清中甘氨酸和丝氨酸的含量及肝脏中MTR的表达量，影响蛋氨酸的再合成和转硫基途径。
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