近年来，随着水产养殖规模的不断扩大，对鱼粉的需求量不断增加，中国的鱼粉产量远远不能满足养殖业的需求，严重依赖进口，导致饲料成本节节上升，因此寻找合适的蛋白质源替代鱼粉成为当务之急[1-2]。玉米蛋白粉具有蛋白质含量高、不含有毒有害物质、不含抗营养因子等优点[3]，作为鱼粉的替代蛋白质源在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[4]、五条(Seriola quinqueradiata)[5]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[6]、齿舌鲈(Dicentrarchus labrax)[7]和金头鲷(Sparus aurata)[8]等水产动物中已做了较多研究。在大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)[9]的研究中发现玉米蛋白粉可替代25%的鱼粉蛋白，过高比例的替代将会影响大菱鲆的生长。究其原因，玉米蛋白粉富含不溶于水的醇溶性蛋白[10]，尽管其营养成分丰富，但大菱鲆对其消化利用效果不尽人意，因此探究提高玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的可行性方法成为进一步提高玉米蛋白粉在水产饲料中替代比例的关键，同时也是本研究的主要目的。目前，常用的用于提高玉米蛋白粉利用率的方法有2种，即外源添加剂法和外部水解法。本研究采用添加胆汁酸和酶制剂2种外源添加剂来研究其对玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的影响。
目前胆汁酸作为饲料添加剂应用广泛。胆汁酸是胆汁的重要组成成分，是胆固醇代谢过程中产生的一系列固醇类物质，具有较强的表面活性，能降低油水两相间的表面张力，促进脂类乳化，扩大脂肪和脂肪酶的接触面积，加速脂类的消化吸收[11]。研究发现，在牛蛙饲料中添加胆汁酸提高了饲料干物质、粗脂肪及粗蛋白质的表观消化率[12]；在断奶仔猪饲粮中加入胆汁酸显著提高脂肪摄入量的同时，氮摄入量和氮贮存量也显著增加[13]。从上述研究结果可推知胆汁酸对蛋白质的消化率有提高作用。
酶制剂是高效生物催化剂，具有提高饲料利用率、消除抗营养因子、提高动物生长速度等作用，且无不良残留，是一种天然、安全的饲料添加剂，在畜禽饲料上的应用已取得了巨大的成功[14]。然而，水产动物营养生理和饲料加工条件有别于畜禽动物，影响了饲用酶制剂在水产动物饲料中广泛应用的步伐。但也有许多研究显示，使用酶制剂能提高水产动物的消化能力、促进其对营养物质的利用和提高其生长。陈建明等[15]发现在青鱼(Mylopharyngodon piceus Richardson)饲料中添加中性蛋白酶可以显著提高饲料粗蛋白质的表观消化率；刘文斌等[16]报道酶制剂可改善异育银鲫(Carassius auratus gibelio)对饲料中蛋白质的消化吸收；刘善庭等[17]发现在玉米蛋白粉中添加中性蛋白酶很大程度上提高了羔羊对玉米蛋白粉中干物质和粗蛋白质的表观消化率。
目前水产动物上关于胆汁酸和酶制剂影响玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的研究较少，故本试验在研究大菱鲆幼鱼对玉米蛋白粉中营养物质的表观消化率的基础上，探讨添加胆汁酸及酶制剂对大菱鲆幼鱼利用玉米蛋白粉的影响，以期为玉米蛋白粉的高效利用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副产物，购自七好生物科技有限公司，含有60%以上的粗蛋白质及少量的淀粉、纤维素及维生素等营养成分。
胆汁酸购自青岛赫普达商贸有限公司，纯度≥30%。
根据饲料加工工艺以及玉米蛋白粉和蛋白酶自身特点，本试验采用由中性蛋白酶(1×105 U/g)和木瓜蛋白酶(4×105 U/g)组成的复合酶作为酶制剂，酶制剂中中性蛋白酶和木瓜蛋白酶活性比为2:1[18]。
1.2 试验饲料首先配制可满足大菱鲆幼鱼基本营养需求的基础饲料，然后将玉米蛋白粉与基础饲料按照3:7的比例混合制成3种试验饲料，混合过程中1种试验饲料不做任何处理(其中的待测蛋白质源命名为CGM)，1种添加1.0%胆汁酸(其中的待测蛋白质源命名为CGMB)，1种添加0.1%酶制剂(其中的待测蛋白质源命名为CGME)。所有饲料中均添加了0.1%的三氧化二钇(Y2O3)作为外源指示剂来测定大菱鲆幼鱼对CGM、CGMB及CGME中干物质、粗蛋白质、氨基酸以及总能的表观消化率。基础饲料组成及营养水平见表 1。各种饲料原料均需粉碎后过60目筛，粉碎好的原料按饲料配方由小到大逐级混匀，然后加入油脂与适量的水揉匀后制粒。饲料经45 ℃烘箱烘约12 h后置于-20 ℃冰箱密封保存。
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表 1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
养殖试验在青岛胶南亿海丰水产品有限公司进行，试验用大菱鲆幼鱼购自烟台市莱州养殖场。正式试验开始以前，先将大菱鲆幼鱼放置在循环水养殖系统中暂养，喂食商业饲料，以使其逐渐适应试验环境。
适应环境后，先将大菱鲆幼鱼饥饿24 h，然后称重记录，挑选出规格一致、活力较好的试验鱼[平均体重为(13.00±0.01) g]随机分到12个桶中，每桶40尾鱼，在室内流水系统中进行养殖。每3桶为1组，每种饲料随机投喂1组试验鱼。试验开始前，先用基础饲料投喂各组试验鱼1周，随后各组分别投喂相对应的饲料。养殖期间每天分2次(07:00和19:00) 投喂大菱鲆幼鱼至表观饱食，摄食后换水70%左右，以保证优良的水质。养殖周期为10周，每天控制水温在18~20 ℃，盐度在30‰~33‰，pH在7.5~8.0，亚硝酸盐浓度不超过0.1 mg/L，氨氮浓度不超过0.1 mg/L，溶氧浓度大于7 mg/L。
1.4 样品收集采用后肠挤压法收集粪便样品，暂养期间观察大菱鲆幼鱼饱食后各个时间段排便量情况，确定饱食5 h后为收集粪便最佳时间。在正式投喂2周后开始收集粪便。先用丁香酚(1:10 000) 麻醉大菱鲆幼鱼，接着用纱布擦干大菱鲆幼鱼表面水分，排出尿液之后在肛门前3 cm处轻轻挤压两侧，收集粪便于10 mL离心管中，放于-20 ℃冷冻保存。每天收集2桶试验鱼的粪便，每桶试验鱼2次收集粪便时间间隔1周，以保证大菱鲆幼鱼能够恢复到正常的生理条件。
1.5 指标测定与计算方法本试验中，干物质含量采用105 ℃常压干燥法测定，粗灰分含量采用550 ℃灼烧法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，总能采用氧弹热量计测定，Y2O3含量采用高频电感耦合等离子体发射光谱法测定，氨基酸含量采用日式L-8900自动氨基酸分析仪测定。
饲料(基础饲料或试验饲料)和待测蛋白质源(CGM、CGMB或CGME)中各营养物质物质表观消化率的计算公式[19-20]如下：
ADC=100×(1-Md/Mf)；
ADCd=100×[1-(Nf/Nd)×(Md/Mf)]；
ADCi=[ADCt×(0.7×Nr+0.3×Ni)-0.7×
Nr×ADCr)]/(0.3×Ni)。
式中：ADC为饲料(基础饲料或试验饲料)中干物质的表观消化率(%)；Md为饲料(基础饲料或试验饲料)中Y2O3含量(%)；Mf为粪便中Y2O3含量(%)；ADCd为饲料(基础饲料或试验饲料)中某营养物质的表观消化率(%)；Nd为饲料(基础饲料或试验饲料)中对应营养物质的含量(%)或总能值(J/mg)；Nf为粪便中对应营养物质的含量(%)或总能值(J/mg)；ADCi为待测蛋白质源(CGM、CGMB或CGME)中某营养物质的表观消化率(%)；ADCt为试验饲料中对应营养物质的表观消化率(%)；ADCr为基础饲料中对应营养物质的表观消化率(%)；Nr为基础饲料中对应营养物质的含量(%)或总能值(J/mg)；Ni为待测蛋白质源(CGM、CGMB或CGME)中对应营养物质的含量(%)或总能值(J/mg)。
1.6 数据分析与处理试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，如果差异显著(P < 0.05)，则进行Turky’s多重比较，试验所得数据以平均值±标准误来表示。
2 结果与分析大菱鲆幼鱼对3种不同处理形式的玉米蛋白粉中各营养物质的表观消化率如表 2所示。
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表 2 待测蛋白质源中各营养物质的表观消化率 Table 2 Apparent digestibility coefficients of nutrients in tested protein sources (n=3) |
大菱鲆幼鱼对3种不同处理形式的玉米蛋白粉中干物质的表观消化率为25.99%~43.34%。其中，CGMB中干物质表观消化率最高，与CGME及CGM差异显著(P < 0.05)，较CGM提高了17.35%；此外，CGME中干物质表观消化率也显著高于CGM(P < 0.05)，较CGM提高了9.53%。
大菱鲆幼鱼对3种不同处理形式的玉米蛋白粉中粗蛋白质的表观消化率为48.62%~60.72%。其中，CGMB中粗蛋白质的表观消化率最高，与CGME及CGM差异显著(P < 0.05)，较CGM提高了12.10%；此外，CGME中粗蛋白质的表观消化率也显著高于CGM(P < 0.05)，较CGM提高了4.37%。
大菱鲆幼鱼对3种不同处理形式的玉米蛋白粉中总氨基酸的表观消化率为48.41%~67.67%，且3种不同处理形式的玉米蛋白粉中总氨基酸的表观消化率与其粗蛋白质的表观消化率变化趋势一致。3种不同处理形式的玉米蛋白粉中，CGMB中各氨基酸和总氨基酸的表观消化率均为最高，必需氨基酸以赖氨酸的表观消化率最高，为78.98%，显著高于CGME及CGM(P < 0.05)；CGME中总氨基酸的表观消化率次之，显著高于CGM(P < 0.05)。CGMB和CGME中总氨基酸的表观消化率较CGM分别提高了19.26%、4.29%。
大菱鲆幼鱼对3种不同处理形式的玉米蛋白粉中总能的表观消化率为35.07%~52.34%。其中，CGMB中总能的表观消化率最高，与CGME及CGM差异显著(P < 0.05)，较CGM提高了17.27%；此外，CGME中总能的表观消化率也显著高于CGM(P < 0.05)，较CGM提高了12.25%。
3 讨论 3.1 试验饲料的配制及试验方法的选择本试验在保证满足大菱鲆幼鱼基本营养需求的前提下，采用Cho等[21]的方法，即待测蛋白质源取代30%基础饲料配制成试验饲料，使得基础饲料和待测蛋白质源的比例为7:3。因为Cho等[21]的计算方法并没有考虑到摄取的待测饲料原料中营养成分对试验饲料中营养成分消化率的影响，故本试验待测蛋白质源中各营养物质的表观消化率的计算采用游文章等[20]在Cho等[21]方法的基础上改进后的计算方法(具体公式见1.5部分)，提高了测定结果的准确度，使测定结果更可靠。
本试验的研究对象是大菱鲆幼鱼，所得结果可能会因鱼的品种、生长周期和试验方法的选择等因素不同而与其他研究有所差异。由于本试验的主要目的是测定待测蛋白质源中各营养物质的表观消化率，在考虑粪便收集方式对结果影响的基础上，同时参照我国水产行业标准对鱼类营养物质消化率测定的要求，选取后肠挤压法[22-24]收集粪便样品。
为了探究添加胆汁酸和酶制剂对玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的影响，本试验制作了3种试验饲料并测定了3种不同处理形式的玉米蛋白粉中营养物质的表观消化率。
3.2 大菱鲆幼鱼对玉米蛋白粉中营养物质的表观消化率饲料蛋白质源中蛋白质的质量是决定其营养价值的首要因素，而消化率是评定饲料蛋白质源中营养成分可利用性的重要指标。本试验从蛋白质和能量的角度，对不同处理形式的玉米蛋白粉中干物质、粗蛋白质、氨基酸和总能的表观消化率进行了测定，以探讨其在大菱鲆饲料中的利用价值。其中，干物质的表观消化率反映了鱼类对饲料原料总体的消化率水平，其高低与饲料中纤维素含量及蛋白质、脂肪等营养物质的吸收程度有关[25]。本试验中，大菱鲆幼鱼对CGM的干物质表观消化率为25.99%，这与Wei等[26]和杨传哲等[27]在大菱鲆上的研究结果相似。干物质表观消化率较低可能与玉米蛋白粉中的粗纤维会加快食糜在消化道内的移动和鱼类缺乏相应的纤维素以及醇溶蛋白含量较高不容易被鱼体消化利用有关。
蛋白质是鱼类营养的重要成分，而鱼类对饲料蛋白质的消化率是判断原料可利用性的重要指标[28]。本试验测得CGM中粗蛋白质表观消化率为48.62%，与Wei等[26]和杨传哲等[27]等在大菱鲆上的研究结果相似，与在虹鳟[29]、军曹鱼(Rachycentron canadum)[30]、建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)[31]和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[32]上的研究结果相差较大，可能与试验鱼的种类有关。
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，对蛋白质的需要其本质上就是对氨基酸的需要，氨基酸的表观消化率直接反映了蛋白质源中蛋白质的质量。本试验测得CGM中总氨基酸表观消化率为48.41%，与粗蛋白质的表观消化率相近，这与在银鲈(Bidyanus bidyanus)[33]、青鱼[34]和建鲤[31]上得出的研究结果一致。
总能的表观消化率反映了鱼类对待测原料中蛋白质、脂肪和糖类的综合利用能力。本试验测得CGM中总能的表观消化率为35.07%，与Wei等[26]在大菱鲆上的研究结果(36.08%)相近，与杨传哲等[27]在大菱鲆上的研究结果(46.28%)存在差异，可能与玉米蛋白粉的品质有关。大西洋鳕(Gadus morhua)[35]和黑鲈(Micropterus salmoides)[36]对玉米蛋白粉中总能的表观消化率分别为82.70%和76.50%，本试验结果与此有较大差异，这可能跟试验鱼的种类、玉米蛋白粉的加工方式以及品质有关。
3.3 添加胆汁酸对玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的影响为了探究胆汁酸对玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的影响，本试验在玉米蛋白粉中加入1.0%的胆汁酸制成CGMB，将其取代30%基础饲料配制成添加胆汁酸的试验饲料，并测定CGMB中各营养物质的表观消化率。结果发现，与CGM相比，CGMB中各营养物质的表观消化率均有显著提高，干物质、粗蛋白质、总氨基酸、总能的表观消化率分别提高了17.35%、12.10%、19.26%、17.27%。关于胆汁酸提高动物生长及饲料利用率等已有文献报道，Maita等[37]研究证实，饲料中添加脱氧胆酸可提高日本鳗鲡(Anguilla japonica)的增重率；Deshimaru等[38]研究发现，饲料中添加胆汁酸能显著提高黄尾(Seriola quinqueradiata)的生长速度和饲料效率；国内学者研究了饲料中添加胆汁酸对虹鳟[39]和异育银鲫[40-41]生长的影响，也获得了类似的结果。此外，王优军[42]在大菱鲆饲料中添加胆汁酸后发现其饲料粗蛋白质的表观消化率提高了1.5%，粗脂肪的表观消化率提高了3.0%；胡田恩等[12]在牛蛙上的试验表明添加胆汁酸可以提高牛蛙对饲料中干物质、粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率，这与本试验的研究结果相似。对猪的研究表明，在饲粮中添加胆汁酸能显著地提高氮摄入量和氮贮留量[13]。现有对胆汁酸促进动物生长机制的解释有以下2个方面：一方面，胆汁有利于脂类物质的乳化，提高了动物对脂肪的消化利用率，从而提高了干物质的表观消化率；另一方面，胆汁酸在肠道中具有杀菌抑菌的作用[43]，可改善肠道健康、提高蛋白酶活性、提高各营养物质的表观消化率，进而促进各种营养物质的消化吸收。作者发现，以上研究测定的多是饲料中各营养物质的表观消化率，且饲料成分不包括玉米蛋白粉，而本试验是以玉米蛋白粉中各营养物质的表观消化率为研究目的，玉米蛋白粉由于富含不溶于水的醇溶蛋白使得大菱鲆幼鱼对其利用效果不尽人意，当添加胆汁酸后各营养物质的表观消化率均显著提高。由于胆汁酸具有较强的表面活性，所以胆汁酸在大菱鲆幼鱼消化利用玉米蛋白粉时可能作为玉米蛋白粉中不溶性蛋白的载体，促进了大菱鲆幼鱼对玉米蛋白粉中不溶性蛋白的利用，从而提高了各营养物质的表观消化率，其具体机制有待进一步研究。综上，添加胆汁酸对提升玉米蛋白粉在大菱鲆饲料中的应用价值效果明显，具有一定的研究前景，可作为添加剂在含玉米蛋白粉的大菱鲆饲料中进一步研究。
3.4 添加酶制剂对玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的影响为了探究酶制剂对玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的影响，依据陈列芹等[18]的研究，本试验以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶活性比2:1的复合酶制剂为外源酶制剂研究其对玉米蛋白粉中营养物质表观消化率的影响。结果发现，添加酶制剂使玉米蛋白粉的干物质、粗蛋白质及总能的表观消化率得到显著改善，个别氨基酸的表观消化率有下降趋势，但总氨基酸的表观消化率显著提高。关于添加蛋白酶显著提高饲料原料中营养物质的表观消化率的研究报道很多。刘善庭等[17]研究发现，在饲粮中添加中性蛋白酶可在很大程度上提高羔羊对玉米蛋白粉中干物质及粗蛋白质的表观消化率。钟国防等[44]研究发现，在饲料中添加饲用复合酶可使尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)的饲料总消化率和粗蛋白质的表观消化率提高。Lin等[45]在奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)植物原料型饲料中添加饲用复合酶后发现饲料中粗蛋白质、总能、粗脂肪和干物质的表观消化率均显著提高，这与本试验所得结果相似。饲料中添加酶制剂可加大蛋白酶对饲料营养成分的消化分解，尤其是幼小动物，饲料中添加外源酶可以补充内源酶的不足，使饲料中常规营养成分分解成小分子物质，有利于肠胃的消化吸收，效果更为明显[46]。本试验中的饲料配方中的蛋白质源除鱼粉外以玉米蛋白粉为主，玉米蛋白粉富含不溶性醇溶蛋白，而蛋白酶制剂可不同程度地分解这些蛋白，综合提高玉米蛋白粉中各营养物质表观消化率。
4 结论① 添加胆汁酸可以显著提高大菱鲆幼鱼对玉米蛋白粉中干物质、粗蛋白质、总氨基酸、总能的表观消化率。
② 添加酶制剂可以显著提高大菱鲆幼鱼对玉米蛋白粉中干物质、粗蛋白质、总氨基酸、总能的表观消化率。
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