乳脂肪是牛奶的主要成分，是评价牛奶质量的重要指标之一。氨基酸(AA)是乳蛋白合成的重要前体物，但AA在影响乳蛋白合成的同时，也影响着乳脂肪合成与组成[1]。因此，深入研究AA对乳脂肪合成的影响及机理，对调控乳腺内乳成分的合成和改善乳品质具有重要意义。赖氨酸(Lys)是动物的必需氨基酸，Giallongo等[2]向奶牛灌注过瘤胃赖氨酸(RPLys)后发现，Lys在促进乳蛋白合成的同时，对乳脂肪的合成具有促进效果。Xu等[3]研究发现，向泌乳母猪饲喂Lys和缬氨酸(Val)后，适宜的Lys和Val比例能够使母猪背部脂肪损失降到最低，说明Lys和Val能够影响乳脂肪的合成。韩慧娜[4]研究发现，秸秆饲粮条件下奶牛阴外动脉灌注AA能促进乳腺内短链脂肪酸的摄取。可见，Lys在一定程度上影响了乳脂肪的合成，然而国内外的研究报道多集中在向奶牛瘤胃内及阴外动脉灌注Lys影响乳蛋白和乳脂肪合成的方面，但以奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为模型，研究不同浓度Lys对乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响的国内外报道较少，此方面机理有必要继续进行研究和探索。鉴于此，本研究以BMECs为模型，研究不同浓度Lys对乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响，为进一步探讨Lys对BMECs内乳脂肪合成的影响机理提供理论基础，为调控奶牛Lys营养水平、提高生产性能提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器Ⅱ型胶原酶、DMEM/F12培养基、胰岛素转铁蛋白硒钠、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)购自Gibco公司；Lys(L8662)、氢化可的松、表皮生长因子、催乳素、油红O、琼脂糖和兔抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)抗体购自Sigma公司(AV32880)；两性霉素购自Amresco公司；细胞培养用双抗购自Corning公司；磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris缓冲液(TBS)购自HyClone公司；RNAiso PLUS、PrimeScript RT Master Mix和SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ购自TaKaRa公司；放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解液、2, 2-联喹啉-4, 4-二甲酸二钠(BCA)蛋白质浓度试剂盒、Western一抗稀释液、Western二抗稀释液、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳液、Western转膜液、ECL化学超敏显色液购自北京碧云天公司；鼠抗固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1) 抗体购自Abcam公司(ab3259)；兔抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购自Proteintech公司(10494-1-AP)；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗购自KPL公司(04-15-06)；HRP标记山羊抗鼠二抗购自天津三箭生物技术有限公司(LK2003)。
主要仪器包括：二氧化碳恒温培养(Forma-311，Thermo公司)；生物安全柜(MSC-ADVANTAGE，Thermo公司)；倒置显微镜(Olympuse公司)；全自动酶标仪(Synergy H4 BioTek，BioTek公司)；细胞计数仪(Cytorecon，GE公司)；荧光定量PCR仪(ABI-7500，ABI公司)；蛋白质电泳仪、蛋白质转膜仪、蛋白质成像系统(Bio-Rad公司)。
1.2 原代BMECs体外培养BMECs用胶原酶消化法获得。在内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场选取3~5岁经产的健康泌乳中期的高产荷斯坦奶牛乳腺组织。去除组织表层，于深层取约1 cm3的组织块放入4 ℃预冷的3×双抗PBS中。随后在超净台内分别用3×PBS、75%酒精和1×PBS清洗。再去除组织块的表层，选腺泡丰富的组织剪成糊状。加入等体积0.5%的Ⅱ型胶原酶溶液，37 ℃和5% CO2条件下消化1 h。之后用80目滤网过滤，收集细胞滤液，179×g离心5 min，弃上清；PBS冲洗细胞，179×g离心3 min，重复冲洗2次。加入完全培养基，吹打均匀后接种于25 cm2细胞培养瓶中，在37 ℃和5% CO2条件下培养。当原代细胞贴壁率达到80%~90%后用0.25%胰蛋白酶/EDTA对细胞进行纯化和传代[5]。
1.3 试验设计试验用第3代的BMECs，按照试验要求的细胞密度接种于不同的细胞培养板上，在37 ℃和5% CO2条件下培养24 h。采用单因子随机试验设计，试验中使用的DMEM/F12培养基中Lys的浓度为0.5 mmol/L，参考李喜艳[6]和高海娜[7]的研究结果并通过噻唑蓝(MTT)法测定细胞的增殖率确定Lys的浓度，各组Lys的浓度分别为0.5(基础培养基，对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，每组6个重复, 每个重复1个培养孔。细胞贴壁率达到80%~90%时，换为饥饿培养基，培养12 h后按照试验设计要求换成不同浓度Lys的培养基，37 ℃和5% CO2培养48 h。
1.4 测试指标与方法 1.4.1 细胞活力与TAG的含量细胞活力采用MTT法检测，以490 nm吸光度值(OD490 nm)计算细胞相对增殖率(RGR)，公式如下：
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TAG含量参考Ramírez-Zacarías等[8]的方法测定，将细胞以5×104个/mL的密度接种于24孔培养板上，按试验设计培养结束后，弃掉培养基，PBS清洗2遍，每孔加入4%多聚甲醛溶液0.2 mL固定细胞1 h，PBS清洗2遍，用0.5 mL油红O工作液避光浸染2 h。用PBS清洗3遍，晾干培养板后，加入0.3 mL异丙醇萃取30 min，用全自动酶标仪测定波长为510 nm吸光度值(OD510 nm)，用以表示TAG含量。
1.4.2 BMECs内乳脂肪合成相关基因的表达将细胞以2×105个/mL的密度接种于6孔培养板，按试验设计培养结束后，细胞总RNA按照Trizol法提取，用酶标仪检测总RNA的纯度与浓度，260和280 nm吸光度值比值(OD260 nm/OD280 nm)在1.8~2.2表示总RNA纯度较好。完整性用2%琼脂糖凝胶电泳来检测。将总RNA反转录成cDNA，采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒的方法，反转录体系为10 μL。基因表达量采用SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒的方法进行测定，反应体系为20 μL。以GAPDH为管家基因，对乳脂肪合成相关基因[脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、PPARγ、SREBP1、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)、磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)、黄嘌呤脱氢酶(XDH)]进行相对定量，引物序列见表 1。实时荧光定量PCR的反应程序为：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火34 s，72 ℃延伸20 s，进行40个循环反应；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，51个循环，绘制熔解曲线。基因的相对表达量采用2-△△Ct表示。
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表 1 乳脂肪合成相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of genes related with milk fat synthesis |
采用蛋白免疫印迹的方法测定，以GAPDH作为内参蛋白。将细胞以1×106个/mL的密度接种于25 cm2细胞培养瓶中，按试验设计培养结束后，弃掉上清，用PBS清洗细胞2遍，每瓶加入250 μL含0.1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA细胞裂解液，4 ℃裂解5 min后刮下细胞并收集细胞悬液，4 ℃ 15 455×g离心10 min，取上清用于检测蛋白的表达量。取适量样品用BCA法测定样品的蛋白质浓度，随后分别向60 μg的每种样品中添加5×蛋白质上样缓冲液，按照4：1的比例混合，100 ℃加热5 min使蛋白质热变性，然后进行电泳，浓缩胶80 V电泳30 min，分离胶120 V电泳120 min。电泳结束后，将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(100 V，4 ℃，50 min)。转膜后，吐温-TBS(TBST)漂洗3次，每次5 min，室温摇床上封闭1 h，TBST漂洗3次，每次5 min。然后将其分别与250倍稀释的兔抗PPARγ一抗稀释液和50倍的鼠抗SREBP1一抗稀释液结合，于4 ℃孵育过夜，取出PVDF膜后TBST漂洗3次，每次5 min。随后分别与稀释1 000倍的山羊抗兔二抗稀释液和稀释500倍的山羊抗鼠二抗稀释液结合，室温摇床孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。用ECL显色法试剂盒进行显色，在蛋白质成像仪上照相分析。图片用Quantity one软件进行灰度值分析，PPARγ和SREBP1蛋白表达量采用各组灰度值与0.5 mmol/L组灰度值的比值表示。
1.5 数据处理所有数据通过Excel进行整理，采用SAS 9.0软件的方差分析程序(ANOVA)进行显著性检验，同时用回归统计程序进行一次线性与二次曲线回归分析，P＜0.05表示组间的差异或回归关系显著，0.05≤P＜0.10表示组间的差异或回归关系趋于显著，P＞0.10表示组间的差异或回归关系不显著。
2 结果 2.1 Lys对BMECs细胞活力、TAG含量及乳脂肪合成相关基因表达的影响由表 2可知，随着Lys浓度的增加，BMECs RGR呈显著的一次线性下降(P＜0.001)，TAG含量呈显著的二次曲线升高(P=0.013)，FABP3和LPL基因表达量分别呈显著和趋于显著的一次线性增加(P=0.001和P=0.096)，其中，4.0、8.0、16.0 mmol/L组的RGR显著低于0.5、1.0、2.0 mmol/L组(P＜0.05)，FABP3基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著高于0.5、1.0 mmol/L组(P＜0.05)，LPL基因表达量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著高于0.5 mmol/L组(P＜0.05)。随着Lys浓度的增加，FASN基因表达量呈显著的二次曲线上升(P=0.003)，最高值出现在2.0 mmol/L组，显著高于16.0 mmol/L组(P＜0.05)。2.0、4.0 mmol/L组的SCD1基因表达量显著高于其他组(P＜0.05)。2.0、4.0 mmol/L组PPARγ基因表达量显著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L组(P＜0.05)。1.0、2.0、4.0 mmol/L组的SREBP1基因表达量显著高于其他各组(P＜0.05)。AGPAT6和GPAM基因表达量随Lys的增加均呈显著的一次线性降低(P=0.038和P=0.022)，AGPAT6基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著低于0.5、1.0 mmol/L组(P＜0.05)，GPAM基因表达量以16.0 mmol/L组显著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L组(P＜0.05)。LPIN1基因表达量以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L组较高，显著高于0.5 mmol/L组(P＜0.05)。BTN1A1和XDH基因表达量也以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L组较高，显著高于其他各组(P＜0.05)。
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表 2 Lys对BMECs细胞活力、TAG含量和乳脂肪合成相关基因表达量的影响 Table 2 Effects of Lys on cell activity, TAG content and expressions of genes involved in milk fat synthesis in BMECs |
由表 3和图 1可知，PPARγ蛋白表达量以1.0、2.0、4.0 mmol/L组显著高于其他组(P＜0.05)，SREBP1蛋白表达量以1.0 mmol/L组显著高于其他各组(P＜0.05)。
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表 3 Lys对BMECs PPARγ和SREBP1蛋白表达的影响 Table 3 Effects of Lys on protein expressions of PPARγ and SREBP1 in BMECs |
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图 1 Lys对BMECs PPARγ和SREBP1蛋白表达的影响 Figure 1 Effects of Lys on protein expressions of PPARγ and SREBP1 in BMECs |
乳脂肪是衡量乳品质的重要指标之一[13]，大约98%为TAG，其中，中短链脂肪酸(SMCFA)的含量占乳脂肪的2/3以上[14]，奶牛乳汁中有50%的C16：0脂肪酸以及几乎全部的C4：0~C14：0是由乳脂肪合成前体物(乙酸、β-羟丁酸)在乳腺从头合成的[15]。TAG在粗面内质网膜的表面合成，合成后以脂滴的形式积累，积累的脂滴通过质膜的包裹再由细胞分泌出去[16]。因此，BMECs内TAG含量和脂滴的累积能直接反映BMECs内乳脂肪的合成。研究表明，AA不仅能影响乳蛋白的合成，也能影响乳脂肪的合成[1]。李珊珊[17]研究表明，在BMECs中添加必需氨基酸显著促进乳蛋白的合成的同时，可能通过SREBP1和PPARγ调节乳脂肪的合成。然而，Lys对BMECs内的TAG合成的影响及其机理研究尚未见报道。本试验结果得出，随着Lys浓度增加，BMECs内TAG含量呈显著的二次曲线升高，说明Lys对TAG含量的影响呈浓度依赖关系，关于其影响机理尚不清楚，需要进一步研究。
与细胞内的从头合成、长链脂肪酸(LCFA)的摄取与转运、脂滴的形成等过程有关的基因均会影响TAG的合成。哺乳动物组织中摄取和LCFA的主要基因是LPL和FABP3[18]。LPL能催化TAG分解为脂肪酸和甘油，为组织供能及贮存能量[19]。FABP3与细胞内LCFA的转运有关，可将LCFA从细胞膜上运送到TAG和磷脂的合成位点[20]。赵艳丽等[21]研究表明，添加适宜浓度的蛋氨酸对BMECs内FABP3和LPL基因表达具有显著的促进作用，说明蛋氨酸可以促进BMECs内LCFA的摄取与转运。本研究结果得出，2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组FABP3基因表达量、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组LPL基因表达均显著高于0.5 mmol/L组，且二者均随着Lys浓度的增加呈显著和趋于显著的一次线性增加，说明Lys对BMECs内LCFA的摄取与转运可能具有一定的促进效果，提示Lys对乳脂肪合成的促进效果呈浓度依赖关系。
FASN是一种多功能的酶系统，参与脂肪酸合成的整个过程，FASN是奶牛乳脂肪酸从头合成过程中的关键基因[11]，泌乳期奶牛乳腺内SMCFA(C4~C16) 的合成受FASN编码的蛋白调控[22]。并且，FASN催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成LCFA。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是Δ9去饱和酶中一种主要的酶，是细胞中单不饱和脂肪酸合成的限速酶[20]。Li等[23]研究发现，添加不同比例的含Lys的必需氨基酸可上调BMECs内LPIN1、FASN和SCD的基因表达量。本试验结果表明，Lys对FASN基因表达的促进效果呈显著的浓度依赖效应，尤以2.0 mmol/L组最高，显著高于16.0 mmol/L组；Lys也促进SCD1基因表达，以2.0、4.0 mmol/L组显著高于其他组。这些研究结果部分地解释了Lys对乳脂肪合成具有促进效果的原因。
此外，GPAM、AGPAT6和LPIN1参与催化TAG的合成[24]，是参与乳脂肪合成的关键酶。GPAM催化脂酰辅酶A与甘油-3-磷酸的sn-1位点结合形成溶血磷脂酸；AGPAT6催化第2个脂酰辅酶A与甘油-3-磷酸的sn-2位点结合形成磷脂酸(PA)；LPIN能转移磷酸基团，将PA转变成二酰甘油。研究发现敲除了泌乳小鼠的AGPAT6基因后不能合成乳脂肪[25]。本研究结果发现，Lys对GPAM和AGPAT6基因表达量的作用效果呈显著的浓度依赖效应，随着Lys浓度的增加抑制了它们的表达，AGPAT6以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著低于0.5、1.0 mmol/L组，GPAM以16.0 mmol/L组显著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L组；同时，Lys显著地促进了LPIN1基因表达，以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L组较高。这些研究结果说明，高浓度的Lys抑制了乳脂肪合成相关基因的表达，进一步解释了Lys对乳脂肪合成的促进效果呈浓度依赖效应的原因。
BTN1A1和XDH是调控脂滴形成的主要蛋白[26]。固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是核转录因子家族成员之一，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)属于核激素受体家族中的配体激活受体，PPARγ可调控SREBP1基因的表达，同时LPL和ACACA等是PPARγ的标靶基因[27]。Kadegowda等[28]用PPARγ激活剂处理BMECs后发现，上调了ACACA、FASN、SREBF1、SCD和LPIN1基因的表达。本研究结果显示，BTN1A1和XDH基因表达量均以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L组较高；PPARγ基因及蛋白表达量均以2.0、4.0 mmol/L组显著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L组；SREBP1基因表达量以1.0、2.0、4.0 mmol/L组较高，蛋白表达量以1.0、2.0 mmol/L组较高，进一步从转录因子和脂滴形成的角度解释了Lys对乳脂肪合成具有促进效果的原因。FABP3、LPL、FASN、GPAM、AGPAT6等是PPARγ和SREBP1的靶基因，在本研究只对PPARγ和SREBP1的蛋白表达量进行了探讨研究，而对FABP3、LPL、FASN、GPAM、AGPAT6等蛋白表达量尚未开展研究，有必要今后继续研究探讨，以更好地阐明Lys对乳脂肪合成的影响机理。
生冉[29]研究指出，雷帕霉素抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路后，SREBP1、PPARγ、ACACA和SCD1的基因表达量显著下降；Soliman等[30]的试验研究也得出了相似的结果，雷帕霉素抑制了人乳腺外植体中SREBP1及其靶基因ACACA、FASN和SCD1的基因表达，说明mTOR信号通路通过转录因子SREBP1和PPARγ调控乳脂肪的合成。Lys是否通过mTOR信号通路间接地调控乳脂肪的合成尚未见资料报道，本试验并未对mTOR信号通路相关基因进行检测，需要进一步深入研究。
综合脂肪酸摄取与转运、从头合成、TAG的合成及脂滴形成的相关基因表达结果可以看出，Lys对BMECs内的乳脂肪合成具有一定的促进效果，呈浓度依赖效应，以2.0~4.0 mmol/L的Lys添加浓度为宜，且Lys对BMECs细胞活力的影响也呈显著浓度依赖效应。然而目前关于添加Lys对奶牛乳脂肪合成及其调控机理的研究甚少，并且本试验得出的结果还没有在体内进一步验证，因此，需要进一步深入研究。
4 结论① Lys对BMECs的乳脂肪合成具有显著的促进效果，但高浓度的Lys抑制了乳脂肪合成相关基因的表达。
② 本试验条件下，培养基中Lys适宜浓度为2.0~4.0 mmol/L。
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SOLIMAN M, KIMURA K, AHMED M, et al. Inverse regulation of leptin mRNA expression by short-and long-chain fatty acids in cultured bovine adipocytes[J]. Domestic Animal Endocrinology, 2007, 33(4): 400-409. DOI:10.1016/j.domaniend.2006.08.005 |