过度或持续性炎症反应会引发许多疾病，如何有效地控制以及治疗炎症性疾病仍然是人们关注的研究热点。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)等细胞因子的过表达可导致过度炎症反应[1]，抑制这些促炎性介质释放可能有利于减弱炎症反应而改善疾病预后。研究发现，食物中的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)等长链n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3 PUFAs)影响脂蛋白代谢、内皮细胞功能、血管反应性以及炎性标记物和细胞因子的生成，有助于治疗人类心血管疾病等炎症性疾病[2]。硒(selenium, Se)是动物机体的一种必需微量元素，其以硒代半胱氨酸的形式掺入硒蛋白中，几乎参与调控所有组织和细胞的氧化应激、还原作用以及其他重要细胞过程，发挥抗炎效应[3-4]。饮食摄入足量硒能够改善乳房炎、心血管病及骨质疏松症等各种炎症性疾病[5-7]。目前，DHA和硒各自抗炎作用及其机制的研究已取得显著进展，却仍缺乏n-3 PUFAs和硒相互作用的研究。
巨噬细胞在炎症启动、发展和消退中均发挥重要作用[8]，经脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导活化的巨噬细胞会产生大量IL-1β、TNF-α和白细胞介素6(IL-6) 等促炎细胞因子[8-9]。研究表明，在降低LPS诱导巨噬细胞表达促炎细胞因子IL-1β和IL-6上，DHA具有比EPA更强的作用[10-12]。因此，本研究基于常用巨噬细胞系——RAW264.7小鼠巨噬细胞，通过监测促炎和抗炎细胞因子mRNA表达情况及其蛋白质含量，探究硒是否影响DHA在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中发挥的抗炎作用，以期为通过“饮食干预”调节不受控炎症反应的替代策略提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 细胞系小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞购于中国科学院上海生命科学研究院。
1.2 主要试剂DMEM高糖培养液购自Gibico公司；二甲基亚枫(DMSO)、LPS(L2880) 和亚硒酸钠(Na2SeO3，S5261) 均购自Sigma公司；DHA(S49140，纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；L-谷氨酰胺购自Biosharp公司；EASYspin plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒(RN2802) 购自艾德莱生物科技有限公司；Fast Quant cDNA第1链合成试剂盒(KR106) 和DNA Marker Ⅰ购自天根生化科技(北京)有限公司；Premix TaqTM (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye)购自宝生物工程(大连)有限公司；小鼠TNF-α、IL1-β、IL-6和白细胞介素10(IL-10) 生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自北京雅安达生物技术有限公司。
1.3 主要仪器设备二氧化碳培养箱和酶标仪(Thermo公司)、PCR仪和凝胶成像仪(Bio-Rad公司)、DYY-Ⅲ电泳仪(北京六一仪器厂)等。
1.4 试验方法 1.4.1 细胞培养与分组将小鼠巨噬细胞系RAW264.7接种至培养皿(直径10 cm)中，采用DMEM高糖培养液(含10% FBS)，5% CO2 37 ℃条件下培养至80%融合。试验分组见表 1，每组设3个重复，将细胞按4.5×105个/孔的密度接种至6孔板，每孔加2 mL DMEM高糖培养液(含10% FBS)，在5% CO2 37 ℃条件下培养24 h。更换新鲜培养液，并按分组添加LPS(100 μg/mL)、DHA(10 mg/mL)和亚硒酸钠(100 μmol/mL)使得LPS、DHA和亚硒酸钠终浓度分别为1 μg/mL、10 μg/mL和0.05 μmol/L，继续培养24 h，分别收集细胞和培养上清液，细胞用于提取总RNA，上清液-20 ℃保存。
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表 1 试验分组 Table 1 Experimental grouping |
按EASYspin plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒操作说明提取各组细胞总RNA。按FastQuant cDNA第1链合成试剂盒操作说明反转录合成cDNA第1链，-20 ℃保存。以cDNA第1链为模板，用各引物(由华大基因合成，信息如表 2所示)，分别进行PCR扩增，反应体系为：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Premix Taq (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 9.5 μL，ddH2O 7.5 μL，共20 μL。反应条件为：94 ℃变性30 s，相应退火温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
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表 2 引物信息 Table 2 Primer information |
PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(100 V，30 min)并用Bio-Rad凝胶成像仪采集图像，利用Image J软件对电泳图进行分析，计算出各区带灰度值，以β肌动蛋白(β-actin)为内参基因。
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按小鼠TNF-α、IL1-β、IL-6和IL-10生物素双抗体夹心ELISA试剂盒操作说明测定细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量。各浓度标准品和样品均设3个重复，以空白孔调零，应用酶标仪以450 nm波长依序测量各孔吸光度(OD)值，分别绘制标准曲线，计算样品中细胞因子含量。
1.5 统计学分析所有数据均统计为“平均值±标准差”，并应用SPSS 20.0软件进行统计，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)程序分析数据，采用LSD法进行组间两两比较，以P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 DHA和Se对LPS诱导细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA表达量的影响半定量反转录PCR结果(图 1)显示，添加DHA(10 μg/mL)或DHA(10 μg/mL)和亚硒酸钠(0.05 μmol/L)对未经LPS诱导的细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA表达量无显著影响(P＞0.05)。添加DHA(10 μg/mL)极显著地降低了LPS(1 μg/mL)诱导的细胞TNF-α和IL-6 mRNA表达量(P＜0.01)，显著地增加了IL-10 mRNA的表达量(P＜0.05)，IL-1β mRNA表达量有所降低，但差异不显著(P＞0.05)。添加亚硒酸钠(0.05 μmol/L)显著地增强了DHA(10 μg/mL)对LPS(1 μg/mL)诱导的细胞TNF-α mRNA表达的抑制作用(P＜0.05)，且极显著地增强了DHA上调LPS(1 μg/mL)诱导的细胞IL-10 mRNA表达的作用(P＜0.01)，IL-6和IL-1β mRNA表达量有所降低，但差异不显著(P＞0.05)。添加DHA(10 μg/mL)和亚硒酸钠(0.05 μmol/L)显著下调经LPS诱导的细胞IL-1β mRNA表达(P＜0.05)。
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n=3，*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。下图同。 A: TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和β肌动蛋白PCR产物的2%琼脂糖凝胶电泳图(100 V，30 min)；B: TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA表达量。 n=3, *indicated significant difference (P < 0.05), ** indicated extremely significant difference (P < 0.01). The same as below. A: agarose gel (2%) electrophoresis images of PCR products of TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 and β-actin (100 V, 30 min); B: expression levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 mRNAs. 图 1 半定量反转录PCR检测结果 Figure 1 The results of semi-quantitative reverse transcription PCR |
ELISA测定结果(图 2)显示，添加DHA(10 μg/mL)或DHA(10 μg/mL)和亚硒酸钠(0.05 μmol/L)对未经LPS诱导的细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量无显著影响(P＞0.05)。添加DHA(10 μg/mL)显著或极显著地降低了LPS(1 μg/mL)诱导的细胞促炎性细胞因子IL-1β(P＜0.05)、TNF-α(P＜0.01) 和IL-6含量(P＜0.01)，同时显著地增加了抗炎细胞因子IL-10含量(P＜0.05)。添加亚硒酸钠(0.05 μmol/L)极显著地增强了DHA(10 μg/mL)下调LPS(1 μg/mL)诱导细胞生成IL-1β的作用(P＜0.01)，而TNF-α和IL-6含量有所降低，但差异不显著(P＞0.05)，抗炎细胞因子IL-10含量有所升高，但差异不显著(P＞0.05)。添加亚硒酸钠(0.05 μmol/L)和DHA(10 μg/mL)极显著地增加了LPS(1 μg/mL)诱导细胞的IL-10含量(P＜0.01)。
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图 2 DHA和Se对LPS诱导细胞培养液上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量的影响 Figure 2 Effects of DHA and Se on contents of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in supernatant of culture medium of cells induced by LPS |
细胞因子的生成对于控制入侵病原体的生长传播具有重要意义，过量的细胞因子则对机体不利，例如持续性过量产生TNF-α和IL-1β引起肌肉萎缩和骨量丢失[9]，调控炎性介质释放有利于改善疾病预后。研究已表明，添加EPA和DHA孵育细胞，能抑制RAW264.7细胞生成IL-6和TNF-α[13]，能抑制LPS诱导THP-1细胞TNF-α和IL-1β mRNA表达[14]。硒通过硒蛋白发挥免疫调节作用，添加硒能抑制丝裂原活化蛋白激酶途径而显著降低LPS诱导巨噬细胞环氧化酶2(COX-2) 和TNF-α基因表达量[15]，硒蛋白缺失巨噬细胞中TNF-α基因表达量显著增加[16]。本研究结果显示，添加DHA(10 μg/mL)能极显著抑制LPS(1 μg/mL)诱导24 h时RAW264.7细胞TNF-α和IL-6 mRNA表达，显著地促进IL-10 mRNA表达，但对IL-1β mRNA表达的下调作用不显著；添加亚硒酸钠(0.05 μmol/L)能显著增强DHA(10 μg/mL)对LPS(1 μg/mL)诱导24 h时巨噬细胞TNF-α mRNA表达的抑制作用，以及对IL-10 mRNA表达的促进作用。此外，DHA(10 μg/mL)与亚硒酸钠(0.05 μmol/L)联合显著下调了LPS(1 μg/mL)诱导的巨噬细胞IL-1β mRNA表达，但亚硒酸钠(0.05 μmol/L)在DHA(10 μg/mL)下调IL-6 mRNA表达的作用中影响不显著。此外，蛋白质水平检测结果显示，DHA(10 μg/mL)显著或极显著降低了LPS(1 μg/mL)诱导24 h时巨噬细胞IL-1β、TNF-α和IL-6的含量，同时显著地增加了巨噬细胞IL-10的含量；添加亚硒酸钠(0.05 μmol/L)增强了DHA(10 μg/mL)对LPS (1 μg/mL)诱导24 h时巨噬细胞IL-1β含量的下调作用和IL-10含量的上调作用。
可见，添加亚硒酸钠(0.05 μmol/L)不仅显著增强了DHA(10 μg/mL)对LPS(1 μg/mL)诱导24 h时RAW264.7细胞中促炎细胞因子TNF-α mRNA表达以及IL-1β生成的抑制作用，还增强了DHA促进抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达和蛋白生成。由此提示，硒能增强DHA在LPS诱导的炎症反应中的抗炎作用。
4 结论通过影响促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及抗炎细胞因子IL-10 mRNA的表达，硒可增强DHA在LPS诱导巨噬细胞炎症反应中的抗炎作用。
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