乳酸菌是一种广泛分布于自然界而且普遍应用于食品、医药、饲料等领域的益生菌^[1-2]，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌的一种，属于乳杆菌科中的乳杆菌属，是同型发酵乳酸菌^[3]。大量研究表明植物乳杆菌具有降低血清中胆固醇浓度^[4-7]、抑制肠道病原菌增殖^[8-11]、降低食品中亚硝酸盐浓度等益生作用^[12-14]。利用植物乳杆菌及其代谢产物作为抑制人或动物常见病原菌的微生物态调节剂，在食品安全、动物养殖等领域受到广泛重视^[15-17]。自然发酵的蔬菜制品是植物乳杆菌分离筛选的良好来源，已有大量优良的菌株从自然发酵的蔬菜中分离筛选到^{[6, 12, 18]}。

本研究以自然发酵的泡菜汁为原料，对其中具有抑菌活性的植物乳杆菌进行分离，并对其分类地位进行鉴定。此外，益生菌要在动物机体内发挥其益生作用，必须能够耐受胃肠道中胃酸和胆汁等一系列不良环境^{[17, 19-20]}。本研究对分离到的植物乳杆菌的体外益生特性亦进行了测定，以期为利用其开发益生菌制剂奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料、培养基与试剂 1.1.1 分离材料

以甘蓝为主要原料自然发酵的泡菜汁。

1.1.2 供试病原菌

大肠埃希氏菌(GIM 1.299)、痢疾志贺氏菌(GIM 1.236)、金黄色葡萄球菌(CGMCC:29213)、鸡肠炎沙门氏菌(CGMCC:21510)、铜绿假单胞菌(GIM 1.443) 病原菌菌株为本实验室保存菌种。

1.1.3 培养基与试剂

MRS培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的配制参见文献[21]。

Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂等PCR试剂为日本TaKaRa公司产品，猪胆盐为上海蓝季科技发展有限公司产品，胃蛋白酶(1：3 000)、胰蛋白酶(1：250) 为美国Amresco公司产品，抗生素滤纸片为杭州微生物试剂有限公司产品，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2000紫外可见分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司]、HQY-C恒温振荡摇床(金坛市鸿科仪器厂)、PHS-3C型pH计(上海雷磁仪器厂)、T Professional Trio PCR仪(德国Biometra公司)、Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、DX50显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 方法 1.3.1 乳酸菌的分离

以无菌操作吸取自然发酵泡菜汁10 mL加入到装有90 mL无菌水的三角瓶中，即为10^-1稀释液，振荡混匀后吸取1 mL转移至装有9 mL无菌水的试管中，制成10^-2稀释液，此后依次制得10^-3、10^-4、10^-5和10^-6稀释液，最后分别吸取0.2 mL 10^-4、10^-5和10^-6稀释液涂布于MRS固体培养基上，将平板倒置于37 ℃培养48 h后，挑取平板上生长数量占优势的乳酸菌株作为进一步研究的对象，将其命名为菌株R1。

1.3.2 菌株R1的鉴定 1.3.2.1 16S rRNA基因序列分析

采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株R1的总DNA，然后对菌株R1的16S rRNA基因序列进行扩增^[22]。PCR扩增的引物为细菌16S rRNA基因通用引物：27f(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和1492r(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)。PCR反应体系(50 μL)：菌株R1总DNA 1 μL，10×Taq聚合酶反应缓冲液5 μL，Mg²⁺(25 mmol/ L)4 μL，dNTP Mixture(20 mmol/L) 4 μL，上、下游引物(25 pmol/ L)各2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/ L)0.5 μL，灭菌双蒸水31.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保温10 min。得到的PCR产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测后送南京金斯瑞生物工程有限公司测序。

菌株R1系统发育地位的确定：根据测定的菌株16S rRNA序列，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行在线比对分析，并在Ribosomal Database Project (RDP)数据库(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)中下载与菌株R1 16S rRNA序列同源的序列，用BioEdit软件以ClustalW功能进行校准排齐，最后利用MEGA 6.0软件，采用邻接(NJ)法，1 000次Bootstrap构建系统发育树。

1.3.2.2 生理生化指标测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》^[23]对分离的菌株进行过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、V-P试验、甲基红试验(MR试验)、糖发酵试验等生理生化指标测定。

1.3.3 菌株R1的生长曲线及产酸曲线绘制

将菌株R1经MRS液体培养基活化培养12 h后，按1%(体积分数)的接种量接种于装有200 mL MRS液体培养基的三角瓶中，37 ℃、150 r/min培养，接种后定时取出3 mL(3个平行)培养液，分别采用pH计和分光光度计测定培养液的pH和600 nm处的吸光度值(OD600 nm)。以时间为横坐标，以培养液的pH和OD600 nm为纵坐标，绘制其生长曲线和产酸曲线。

1.3.4 菌株R1发酵上清液对常见病原菌的抑菌试验

菌株R1的抑菌试验采用牛津杯法，具体如下：将5种病原菌(痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、鸡肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌)接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养至对数生长期，取200 μL菌液分别涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上。待菌液完全吸收后，在每个平板上放置3个灭过菌的牛津杯。将菌株R1用MRS液体培养基培养24 h，经6 000 r/min离心10 min后，取200 μL上清液加到牛津杯里。将平板在37 ℃下培养10 h后观察是否有抑菌圈形成，并精确量取抑菌圈直径。通过调节发酵液pH、在发酵液中添加过氧化氢酶和蛋白酶等试验初步分析菌株R1抑菌的机制^[24]。

1.3.5 菌株R1的体外益生特性 1.3.5.1 菌株R1对胆盐的耐受性

将菌株R1接种到MRS液体培养基中活化培养12 h后，按1%(体积分数)的接种量接种于胆盐浓度分别为0、0.1%、0.3%、0.5%的MRS液体培养基中，37 ℃、150 r/min下培养26 h，定时取样测定不同胆盐浓度下培养液的OD600 nm。以时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标，绘制菌株R1在含胆盐培养基中的生长曲线，确定其对胆盐的耐受性。

1.3.5.2 菌株R1对酸度的耐受性

为了检测菌株R1在低pH下的生长状态，用1 mol/L盐酸调节MRS液体培养基的pH分别为1.0、2.0、3.0、5.0。将菌株R1经MRS液体培养基活化培养12 h后，按1%(体积分数)的接种量分别接种于不同pH的MRS液体培养基中，37 ℃培养，定时取样测定培养液的OD600 nm。以时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标，绘制菌株R1在不同pH条件下的生长曲线，确定其对酸度的耐受性。

1.3.5.3 菌株R1对热的耐受性

将菌株R1经MRS液体培养基活化培养12 h后，取其培养液分成3份，分别在40、60、80 ℃水浴条件下处理30 min后，利用稀释平板菌落计数法测定各个处理的活菌数，并以处理前的活菌数为对照，计数处理后菌株R1的存活率，确定其对热的耐受性。

1.3.5.4 菌株R1对人工胃液和人工肠液的耐受性

人工胃液和人工肠液的配制参见文献[19]。

将菌株R1经MRS液体培养基活化培养12 h后，按1%(体积分数)的接种量接种于100 mL人工胃液或人工肠液中，37 ℃、150 r/min摇床培养，分别在0、30、180 min进行活菌平板计数。

1.3.5.5 菌株R1对常用抗生素的敏感性

抗生素敏感性试验采用滤纸片法^[25]，具体如下：将菌株R1用MRS液体培养基培养至对数期后，取200 μL培养液均匀涂布于MRS固体培养基上，用无菌镊子将含有各种常用抗生素的滤纸片放在平板上，将接种好的平板在37 ℃下培养24 h后，观察是否有抑菌圈形成，并精确量取抑菌圈直径，每种抗生素3个重复。滤纸片中抗生素含量分别为头孢克洛30 μg、头孢克肟5 μg、头孢拉定20 μg、氨苄青霉素10 μg、青霉素10 U、阿莫西林20 μg、阿奇霉素15 μg、卡那霉素30 μg、链霉素10 μg、四环素30 μg、痢特灵300 μg、诺氟沙星10 μg、杆菌肽0.04 U。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2007和DPS v6.50软件进行处理与分析，采用Duncan氏新复极差法检验组间差异显著性。

2 结果 2.1 乳酸菌的分离与鉴定

利用MRS固体培养基从自然发酵泡菜汁中分离到1株在生长数量上占优势的乳酸菌，将其命名为菌株R1。菌株R1在MRS固态培养基上形成的菌落为圆形，乳白色，凸起，不透明，边缘整齐；经显微镜观察其菌体成杆状，单个或链状排列(图 1)。菌株R1呈革兰氏染色反应阳性，过氧化氢酶试验、甲基红试验、V-P试验、明胶液化试验均为阴性，能发酵麦芽糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖产酸，其中对葡萄糖和半乳糖的利用率较高。菌株R1在NaCl浓度低于5%时生长良好，其生长最适温度和pH分别为37 ℃和5.0。利用细菌16S rRNA基因通用引物1492r和27f对菌株R1的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序后，将其基因序列提交GenBank，获得其登录号为KY874048。通过BLAST比对，表明菌株R1的16S rRNA基因与植物乳杆菌MXG-68的16S rRNA基因(登录号：KY750314) 相似度最高，达到100%。利用RDP数据库的Sequence Match分析和MEGA 6.0构建其系统进化树，如图 2所示。结果表明：菌株R1与植物乳杆菌属模式菌株DK0 22T(登录号：AJ640078) 的亲缘关系最近。综合菌株R1的生理生化特性，将菌株R1确定为植物乳杆菌。

2.2 菌株R1的生长曲线和产酸曲线

将菌株R1接种到MRS液体培养基中，定时取样测得菌株R1在接种后0~28 h的生长曲线和产酸曲线，结果如图 3所示。菌株R1在接种后0~2 h生长缓慢，而在2 h后则迅速进入对数生长期，生长旺盛；12 h后生长减慢，到14 h达到最大浓度(OD600 nm=2.144)；并且直到24 h以后菌体浓度才略有降低。在菌株R1接种后2 h内培养液的pH变化不大，而在2~12 h内培养液的pH从6.14迅速下降到3.95，12 h后培养液的pH缓慢降低，到28 h时培养液的pH仅为3.59。由上述结果可以看出，菌株R1生长的延滞期较短，并且可以在14 h内达到最大生长量和较低的pH，这一特点可以满足在利用该菌株进行发酵生产中，需要在较短时间内获得大量菌体和降低发酵产品pH的要求。

2.3 菌株R1对常见病原菌的抑制

乳酸菌由于生长过程中能产生乳酸或者分泌抑菌物质，往往对病原菌具有一定的抑制作用，而筛选具有抑菌作用的乳酸菌也一直是乳酸菌研究的热点。本试验对菌株R1的发酵上清液对常见大肠埃希氏菌、痢疾志贺氏菌等病原菌的抑制性进行了测定，结果表明：菌株R1的发酵上清液对试验致病菌均有很好的抑制效果，其中菌株R1对痢疾志贺氏菌的抑制作用最强，其抑菌圈直径达到20.50 mm，其对鸡肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑制作用依次减弱，抑菌圈直径分别为15.67、14.17、13.33和12.67 mm；而对照组MRS液体培养基对致病菌无抑制作用。通过调整发酵上清液pH及在发酵上清液中添加过氧化氢酶、蛋白酶等试验初步分析菌株R1的抑菌机理，结果表明：发酵上清液的pH调至5.0时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈显著减小(P＜0.05)；当发酵上清液的pH调至7.0时，没有抑菌圈；在发酵上清液中添加胃蛋白酶、胰蛋白酶和过氧化氢酶后，发酵上清液抑制金黄色葡萄球菌的能力略有降低(表 2)。

2.4 菌株R1的体外益生特性 2.4.1 菌株R1对胆盐的耐受性

将菌株R1接种到含不同浓度胆盐的MRS液体培养基中，测定其对胆盐的耐受性，以不添加胆盐的处理为对照，结果如图 4所示。当胆盐浓度为0.1%时，菌株R1的延滞期明显比未添加胆盐时增长，达到了8 h；8 h后菌体数量开始呈指数增长，但与未添加胆盐时相比，其增长速率明显降低，24 h后菌体数量的增长趋于平缓达到稳定期。当胆盐浓度为0.3%时，菌株R1的延滞期变得更长，到12 h后才开始呈现指数生长状态，26 h后达到稳定期。而当胆盐浓度为0.5%时，菌株R1的生长完全被抑制，到30 h时也未出现生长。这些结果表明菌株R1能耐受0.3%的胆盐浓度。

2.4.2 菌株R1对酸度的耐受性

将菌株R1接种到不同pH的MRS液体培养基中，测定其对酸度的耐受性，结果如图 5所示。当MRS液体培养基pH=5.0时，菌株R1的延滞期很短，为2 h，2 h后进入指数生长期，到8 h后达到稳定期。当MRS液体培养基pH=3.0时，菌株R1的延滞期增长，4 h后菌体才表现出生长，22 h后菌体生长渐缓，但菌体数量明显低于pH=5.0时。当MRS液体培养基pH=1.0、2.0时，菌株R1的生长完全被抑制，到24 h后也未出现生长。通过比较可以得出，菌株在pH=5.0的环境中生长状态为最佳，对pH=3.0的酸性环境也有一定的耐受性。

2.4.3 菌株R1对热的耐受性

本试验将活化培养后的菌株R1经过不同温度加热处理30 min后，利用稀释平板菌落计数法测定处理前后菌悬液中的活菌数，以确定其对热的耐受性，结果如表 3所示。当对菌株R1进行不同温度的加热处理后，其生长均受到了不同程度的影响。经40和60 ℃处理后，菌悬液中R1菌株的存活率分别为94.70%和80.60%，说明菌株R1对40和60 ℃有一定的耐受性。而经80 ℃处理后的菌悬液中，菌株R1的存活率仅为1.95%，这说明菌株R1对80 ℃非常敏感，经过30 min的加热，菌种绝大部分被杀死。因此，对于菌株R1，在生产、运输和应用过程中要避免60 ℃以上的高温。

2.4.4 菌株R1对人工胃液和人工肠液的耐受性

根据表 4可以看出，随着菌株R1在人工胃液中处理时间的延长，菌株R1不但没有死亡，并且在人工胃液中表现出明显的生长，即其对人工胃液有很好的耐受性，这与2.5中菌株对酸的耐受性结果相一致。

由表 4可以看出，菌株R1在人工肠液中处理不同时间后，其活菌数在0~3 h内从2.58×10⁶ CFU/mL增长到了3.66×10⁶ CFU/mL，即菌株R1在人工肠液中能够保持增长的状态，这说明菌株R1对人工肠液具有较好的耐受性。

2.4.5 菌株R1对常用抗生素的敏感性

由表 5可以看出，菌株R1对各种常用抗生素的敏感性不同。菌株R1对于治疗呼吸道感染常用的抗生素，如阿莫西林、氨苄西林和头孢类抗生素敏感性强；对治疗胃肠道感染用的抗生素痢特灵的敏感性较弱，而对诺氟沙星和杆菌肽则不敏感。此外，菌株R1对卡那霉素、链霉素和四环霉素等抗生素也不敏感。

3 讨论 3.1 菌株R1的鉴定结果

对分离到的微生物菌株进行分类学地位鉴定，是认识某种微生物的首要的且必须的工作，而16S rRNA基因序列分析是目前对细菌进行分类学地位鉴定最准确且最快速的方法。本研究利用NCBI数据库的BLAST功能，对菌株R1的16S rRNA基因序列进行分析，发现其与数据库中很多植物乳杆菌的16S rRNA基因序列同源性都达到了100%，遂将其初步鉴定为植物乳杆菌。以往的研究中，已有大量植物乳杆菌菌株从自然发酵的蔬菜制品中被分离到^{[6, 12, 18]}，本试验得出的菌株R1亦是从自然发酵的泡菜汁中分离得到的，并且菌株R1还是其中的优势菌株。此外，菌株R1的菌落菌体形态特征、革兰氏染色反应、部分生理生化特征以及糖发酵试验结果均与植物乳杆菌的特征^[23]相符，所以可以确定本试验分离出的菌株R1为植物乳杆菌。

3.2 菌株R1的抑菌性

植物乳杆菌在生长繁殖过程中不仅能够产生大量的有机酸^{[3, 26]}，甚至有些菌株可以产生特有的乳酸杆菌素^{[2, 9]}，这些物质都是很好的生物防腐剂，可以通过降低动物体内的pH或生物拮抗作用等方式阻止和抑制病原微生物的侵入和定植。通过研究发现，菌株R1对常见病原菌痢疾志贺氏菌、鸡肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长均有抑制性，且其抑菌性明显强于某些已报到的其他类型乳酸菌菌株^{[7, 15]}。通过调节发酵液pH、添加过氧化氢酶、蛋白酶等试验对菌株R1的抑菌机理进行初步分析，认为菌株R1对病原菌的抑制作用主要是依赖其分泌的乳酸等酸性代谢产物，这与菌株R1具有较好产酸能力的特点相吻合。张艳萍等^[26]亦报道，11株对大肠杆菌有较好抑制作用的乳酸菌均具有较好的产酸能力。马妙莲等^[27]经气相色谱-质谱联用仪和高效液相色谱初步分析，发现1株具有广谱抑菌活性的戊糖乳杆菌的发酵上清液中含有乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸和亚油酸等多种抑菌成分。菌株R1发酵上清液中具有抑制作用的酸性物质成分还需进一步鉴定。

3.3 菌株R1的体外益生特性

动物胃液的pH通常在3.0左右，而动物肠道内环境却是碱性的，pH大约为7.6；并且动物消化道和肠道中都含有一定浓度的胆盐和胆汁酸，益生菌要想在动物消化道存活并增殖，必须既能够耐受酸性环境，又能耐受碱性和高渗透压的环境^[19]。本试验对菌株R1对酸性环境、含胆盐环境以及人工胃液和人工肠液的耐受性均进行了测定，结果表明：菌株R1可以耐受pH=3.0的酸性环境以及含0.3%的胆盐环境；并且，与已报到的植物乳杆菌GF103^[19]和DJ-04^[28]等菌株相比，菌株R1在人工胃液和人工肠液环境中的生长不但没有受到影响，甚至可以保持良好的增长状态，此特点说明菌株R1较其他菌株更具有在动物体内存活的潜力。

此外，益生菌在应用过程中亦经常会接触加热的过程或者宿主由于生病或预防目的使用抗生素的情况，致使其生长被抑制，很难发挥好的益生效果，因此，了解菌株对高温和常用抗生素的敏感性，对于指导其正确使用和更好地发挥其益生作用具有重要意义。本研究对菌株R1对高温和常用抗生素的敏感性亦进行了测定，结果表明：菌株R1可以耐受60 ℃的高温，并且仅对青霉素类和头孢类抗生素敏感，而对诺氟沙星、杆菌肽、卡那霉素、链霉素和四环霉素等抗生素有抗性。

4 结论

本研究从自然发酵的泡菜汁中分离到1株乳酸菌R1，其16S rRNA基因与植物乳杆菌MXG-68的16S rRNA基因(登录号：KY750314) 相似度达到100%；该菌株发酵上清液对常见病原菌痢疾志贺氏菌、鸡肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈直径可以分别达到20.50、15.67、14.17、13.33和12.67 mm；该菌株具有很好的产酸性能，且可以耐受pH 3.0的低酸性环境以及60 ℃的热处理，其对人工胃液和人工肠液亦有很好的耐受性；该菌株对头孢类和青霉素类抗生素敏感。