黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁，AFB₁)主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次级代谢产物，其产毒菌株适宜在温暖、潮湿的条件下生长，广泛存在于花生、玉米、小麦和稻米等农产品中，对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，由于其高致癌性，被国际癌症研究机构认定是一类人类致癌物^[1]。黄曲霉毒素B₁危害主要是造成动物的采食量、体增重和饲料转化率降低，繁殖性能紊乱，免疫功能降低等。

黄曲霉毒素B₁的主要检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法、质谱联用法、酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法及胶体金免疫层析法。薄层色谱法在处理样品时工作量大，检测过程中需接触标准品，危害到操作人员的健康。HPLC法和质谱联用法所需检测仪器价格昂贵，需要专业技术人员操作，且样品前处理复杂，不便于推广应用，也不适合大批量样品检测。ELISA法和胶体金免疫层析法操作简便、快速、灵敏度高，可进行定量和半定量检测，且无需贵重仪器设备，因此近年来发展迅速^[2]。近年来，发展了多种针对黄曲霉毒素的免疫检测方法^[3-6]。其中胶体金免疫层析法检测谷物中的黄曲霉毒素B₁已有了广泛的应用，但其只能做定性检测^[7-10]。本试验旨在胶体金免疫层析法的基础上，配合定量读数仪，研发出黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒，对谷物和饲料中的黄曲霉毒素B₁含量进行快速定量检测，以期为饲料中黄曲霉毒素B₁含量的检测提供准确、快速、简便的方法。

1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器设备

试验材料包括：黄曲霉毒素B₁、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素标准品(Sigma公司，美国), 氯金酸(HAuCl₄·4H₂O，国药集团化学试剂有限公司), 黄曲霉毒素B₁偶联卵清蛋白(AFB₁-OVA，北京龙科方舟生物工程技术有限公司), 黄曲霉毒素B₁单克隆抗体(AFB₁-Ab，北京龙科方舟生物工程技术有限公司), 羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG，上海金标生物科技有限公司), 硝酸纤维素膜(Millipore公司，美国), 胶体金结合垫、样品垫、吸水纸(上海金标生物科技有限公司), 黄曲霉毒素B₁免疫亲和层析柱(北京龙科方舟生物工程技术有限公司)。

仪器设备包括：三维平面点膜喷金仪HM3030(上海金标生物科技有限公司)、微电脑自动斩切机ZQ2000(上海金标生物科技有限公司)、高速冷冻离心机H-2050R(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、紫外连续扫描分光光度计(Thermo公司，美国)、数显磁力搅拌电热套(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、胶体金定量读数仪(上海捷浩科学仪器有限公司)、恒温孵育器(杭州奥盛科技有限公司)。

1.2 试验方法 1.2.1 胶体金溶液的制备

在圆底烧瓶中加入1 L超纯水加热至煮沸，加入10 mL 1%氯金酸溶液，2 min后加入12 mL 1%柠檬酸三钠溶液，此时溶液颜色由黑色逐渐变为酒红色。继续煮沸15 min后停止加热，冷却至室温，4 ℃贮存。紫外扫描检测胶体金溶液质量。

1.2.2 抗体最佳标记pH的确定

取1 mL胶体金溶液，分别加入1、3、5、8、10、15、20 μL浓度为2 moL/L的碳酸钾(K₂CO₃)溶液调节pH，黄曲霉毒素B₁单抗按照5 μg/mL标记，终浓度1% BSA封闭，4 000 r/min离心5 min, 去上清液后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤1次，再次4 000 r/min离心5 min后沉淀用300 μL悬浮液悬浮，按10 μL/cm喷金量将标记好的抗体包被在胶体金结合垫上，37 ℃干燥2 h。

黄曲霉毒素B₁偶联抗原和羊抗鼠IgG均分别稀释到0.5 mg/mL，按1 μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上，37 ℃干燥1 h。组装大板、切条，用PBS检测，观察检测线(T线)显色情况，选择没有死金的显色最强的缓冲液用量作为最佳标记pH。

1.2.3 抗体最佳标记浓度与抗原最佳包被浓度的确定

用确定的最佳标记pH，单抗分别按照2、3、4、5 μg/mL标记，偶联抗原分别按照0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL包被在T线位置，进行正交试验，检测黄曲霉毒素B₁标准品(浓度为0、2、5、10、20、50 μg/kg)浓度，选择0 μg/kg显色明显且灵敏度最高的组合为最佳条件。在此条件下，羊抗鼠IgG分别按照0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL包被在对照线(C线)位置，检测黄曲霉毒素B₁标准品(浓度为10 μg/kg)浓度，选择C线显色强度与T线相当的包被浓度为最佳条件。

1.2.4 黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒检测卡的组装

将包被有黄曲霉毒素B₁偶联抗原和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、喷有黄曲霉毒素B₁单抗偶联胶体金的聚酯垫、玻璃纤维滤纸与吸水纸组装在聚氯乙烯(PVC)底板上，用切条机切成3.88 mm宽的试纸条，装入检测卡壳中，即为最终的检测卡。

1.2.5 样品前处理方法的确定

将不含黄曲霉毒素B₁的玉米样品粉碎后，称取4份，每份各1 g，向其中添加黄曲霉毒素B₁标准品溶液，使其终浓度为10 μg/kg。每份样本分别加入5、6、7、8 mL样品提取液，然后用稀释液稀释6倍，用制备的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒检测卡检测，确定提取液与稀释液用量。

1.2.6 标准曲线的建立

配制一系列不同浓度(0、10、20、30、40、50和60 μg/kg)的黄曲霉毒素B₁标准品，按确定的提取与稀释比例提取稀释后，分别取100 μL加到检测卡的加样孔中，恒温孵育器37 ℃反应10 min，放入胶体金定量读数仪中，读取T线与C线的峰面积比值(T/C值)，每个浓度重复检测5次，计算平均值。以T/C值的平均值为横坐标、黄曲霉毒素B₁标准品浓度为纵坐标，制作标准曲线。

1.2.7 添加回收试验

分别取玉米和玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)样本，检测其中黄曲霉毒素B₁含量，然后向其中添加不同浓度(0、10、20和50 μg/kg)的黄曲霉毒素B₁标准品，再次进行检测，计算添加回收率。

1.2.8 试剂盒特异性检测

分别配制玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素标准品，浓度分别为100、500、1 000、2 000 μg/kg，用黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒检测，考察试剂盒特异性。

1.2.9 试剂盒批内和批间重复性检测

用同批次和3个不同批次的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒分别检测黄曲霉毒素B₁标准品(浓度分别为5、10、20、40 μg/kg)，批内每个浓度重复5次，批间每个浓度重复2次，考察其重复性。

1.2.10 试剂盒稳定性检测

将黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒放置于45 ℃温箱中，分别于第0、2、4、6、8周检测黄曲霉毒素B₁标准品(浓度分别为5、10、20、40 μg/kg)，考察产品的稳定性。

1.2.11 样品检测

随机选取10份黄曲霉毒素B₁的含量在2~50 μg/kg之间的市售的谷物及饲料样品，分别用HPLC法和本试验制备的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒进行检测，比较检测结果。

1.3 数据统计

试验数据利用Excel 2007进行统计分析和标准曲线制作，数据以平均值表示。

2 结果与分析 2.1 胶体金溶液扫描结果

以双蒸水为对照，用紫外分光光度计在400~700 nm连续扫描，测定吸收曲线和吸收峰，结果显示，最大吸收峰(λmax)为527 nm，最大吸光度值(ODmax)为0.109。所制备的胶体金溶液颗粒大小在40 nm左右，颜色为透明的酒红色，液面无油质类漂浮物，可用于试纸条制备。

2.2 抗体最佳标记pH

胶体金中加入5 μL浓度为2 moL/L的K₂CO₃溶液调节pH时，标记抗体没有死金现象，且显色最强，调节后的胶体金溶液的pH在8.0左右。

2.3 抗体最佳标记浓度与抗原最佳包被浓度

通过正交试验，确定抗体按3 μg/mL标记，T线偶联抗原按照0.2 mg/mL包被，C线羊抗鼠IgG按照0.1 mg/mL包被为最佳条件，在此条件下，试纸条检测黄曲霉毒素B₁标准品的检测限为2 μg/kg。

2.4 样品前处理方法的确定

取1 g粉碎后的样品，加入8 mL样品提取液提取，然后用稀释液稀释6倍，加样100 μL，37 ℃反应10 min，为最终检测条件。

2.5 标准曲线

通过对一系列不同浓度的黄曲霉毒素B₁标准品的检测，确定线性范围及对应的T/C值如表 1。以T/C值为横坐标、标准品浓度为纵坐标，建立标准曲线如图 1。

2.6 添加回收试验结果

分别取玉米和玉米DDGS样本，检测其中黄曲霉毒素B₁含量，然后分别向其中添加0、10、20、50 μg/kg的黄曲霉毒素B₁标准品进行检测，计算添加回收率，结果见表 2。玉米样本的添加回收率在98%~125%之间，玉米DDGS样本的添加回收率在96%~136%之间。

2.7 试剂盒的特异性结果

由表 3可知，利用黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒检测不同浓度霉菌毒素标准品，结果均小于2 μg/kg，说明该试剂盒与玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素均无交叉反应。

2.8 试剂盒批内和批间重复性结果

用同批次的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒分别检测黄曲霉毒素B₁标准品，每个浓度重复检测5次，批内重复性结果见表 4。结果表明，黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒的批内变异系数均不大于10%。

用3个不同批次的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒分别检测黄曲霉毒素B₁标准品，每批次每个浓度重复检测2次，批间重复性结果见表 5。结果表明，黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒的批间变异系数均小于10%。

2.9 试剂盒稳定性结果

将黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒放置于45 ℃温箱中，于第0、2、4、6、8周检测黄曲霉毒素B₁标准品浓度，其稳定性结果见表 6。结果表明，黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒在45 ℃下保存8周其检测结果仍符合要求，变异系数均小于15%。

2.10 样品检测结果

利用黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒检测10份样品，结果见表 7。结果显示，黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒的检测结果与HPLC法检测结果相符，相对误差在20%以内。

3 讨论

黄曲霉毒素B₁是农产品中最普遍存在的一种霉菌毒素，且其毒性强，可造成养殖动物采食量减少、生产性能下降、免疫力降低等症状，严重的可导致家畜死亡，给养殖业造成巨大损失。同时，如果奶牛摄入含黄曲霉毒素B₁的饲粮，经体内代谢后，还会在牛奶中分离出黄曲霉毒素M₁，影响牛奶质量。因此，世界各国对黄曲霉毒素B₁都有严格的限量标准，而在饲料原料及成品中，黄曲霉毒素B₁也是必检项目。

目前市场上常用的检测黄曲霉毒素B₁的方法有HPLC法、ELISA法及胶体金免疫层析法。本试验研发的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒与现有产品相比，具有以下几点优势。

首先是操作简便快速。HPLC法在样本提取后要过免疫亲和层析柱，上机检测样本时平均每个需要25 min左右^[11]。谢体波等^[12]在粮油食品中黄曲霉毒素B₁测定试验中使用的市售ELISA试剂盒，4 ℃储存，使用前需要复温，样本提取后要在25 ℃条件下加样反应45 min。且这2种方法都需要专业技术人员操作。本试验研发的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒常温储存，稳定性试验结果表明，45 ℃条件下储存8周其变异系数仍小于15%，相当于常温放置6个月。检测时，样本经过简单提取，稀释后直接加样，在37 ℃孵育器中进行反应，对外界温度没有要求，反应时间只需10 min，批量检测时所需平均时间更短。

其次是结果准确、重复性好。陈笑笑等^[7]研制的黄曲霉毒素B₁胶体金试剂板结果判定是根据T线与C线颜色对比，T线比C线深或一样为阴性，T线比C线浅或无色为阳性，且只能进行定性检测，即通过结果的阴阳性判断样本中霉菌毒素含量是否超出检测线。这种肉眼判读方法在T线与C线颜色相近时容易产生误差。本试验研发的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒用定量读数仪给出霉菌毒素具体含量，代替肉眼判断的工作，避免人为因素主观判断造成的差异。检测玉米样本的添加回收率在98%~125%，玉米DDGS样本的添加回收率在96%~136%。黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒批内和批间重复性变异系数均不大于10%，检测10份样品与HPLC法检测结果比较相对误差在20%以内，结果符合度高。

最后是检测成本低。HPLC法每个样本要消耗1个免疫亲和层析柱^[11]，每支价格在70~150元，液相色谱仪也比较昂贵，因此只有一些大型饲料企业的中心化验室进行此项检测。ELISA法在每次检测时都要做标准曲线^[12]，即6个标准品，因此更适合批量检测，而单个样本检测的成本就比较高。本试验研发的黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒所配定量读数仪内置相应的标准曲线，检测时，不需要再做标准品，因此即使只检测1个样本，也不会增加检测成本，适合大部分饲料企业实际使用需求及成本控制。

4 结论

本试验利用胶体金免疫层析技术，以特异性强的单克隆抗体为基础，研发了黄曲霉毒素B₁胶体金快速定量检测试剂盒。该试剂盒稳定性好，与常见的霉菌毒素无交叉反应。同时通过与胶体金定量检读数结合使用，实现了定量检测，满足快速准确的需求。检测不同种类的谷物和饲料样品，其结果与HPLC法检测结果有较高的符合率。