2. 国家饲料工程技术研究中心, 北京 100193;
3. 重庆市畜牧科学院, 重庆 402460
2. National Feed Engineering Technology Research Center, Beijing 100193, China;
3. Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460, China
黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次级代谢产物,其产毒菌株适宜在温暖、潮湿的条件下生长,广泛存在于花生、玉米、小麦和稻米等农产品中,对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时可导致肝癌甚至死亡,由于其高致癌性,被国际癌症研究机构认定是一类人类致癌物[1]。黄曲霉毒素B1危害主要是造成动物的采食量、体增重和饲料转化率降低,繁殖性能紊乱,免疫功能降低等。
黄曲霉毒素B1的主要检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法、质谱联用法、酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法及胶体金免疫层析法。薄层色谱法在处理样品时工作量大,检测过程中需接触标准品,危害到操作人员的健康。HPLC法和质谱联用法所需检测仪器价格昂贵,需要专业技术人员操作,且样品前处理复杂,不便于推广应用,也不适合大批量样品检测。ELISA法和胶体金免疫层析法操作简便、快速、灵敏度高,可进行定量和半定量检测,且无需贵重仪器设备,因此近年来发展迅速[2]。近年来,发展了多种针对黄曲霉毒素的免疫检测方法[3-6]。其中胶体金免疫层析法检测谷物中的黄曲霉毒素B1已有了广泛的应用,但其只能做定性检测[7-10]。本试验旨在胶体金免疫层析法的基础上,配合定量读数仪,研发出黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒,对谷物和饲料中的黄曲霉毒素B1含量进行快速定量检测,以期为饲料中黄曲霉毒素B1含量的检测提供准确、快速、简便的方法。
1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器设备试验材料包括:黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素标准品(Sigma公司,美国), 氯金酸(HAuCl4·4H2O,国药集团化学试剂有限公司), 黄曲霉毒素B1偶联卵清蛋白(AFB1-OVA,北京龙科方舟生物工程技术有限公司), 黄曲霉毒素B1单克隆抗体(AFB1-Ab,北京龙科方舟生物工程技术有限公司), 羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG,上海金标生物科技有限公司), 硝酸纤维素膜(Millipore公司,美国), 胶体金结合垫、样品垫、吸水纸(上海金标生物科技有限公司), 黄曲霉毒素B1免疫亲和层析柱(北京龙科方舟生物工程技术有限公司)。
仪器设备包括:三维平面点膜喷金仪HM3030(上海金标生物科技有限公司)、微电脑自动斩切机ZQ2000(上海金标生物科技有限公司)、高速冷冻离心机H-2050R(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、紫外连续扫描分光光度计(Thermo公司,美国)、数显磁力搅拌电热套(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、胶体金定量读数仪(上海捷浩科学仪器有限公司)、恒温孵育器(杭州奥盛科技有限公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 胶体金溶液的制备在圆底烧瓶中加入1 L超纯水加热至煮沸,加入10 mL 1%氯金酸溶液,2 min后加入12 mL 1%柠檬酸三钠溶液,此时溶液颜色由黑色逐渐变为酒红色。继续煮沸15 min后停止加热,冷却至室温,4 ℃贮存。紫外扫描检测胶体金溶液质量。
1.2.2 抗体最佳标记pH的确定取1 mL胶体金溶液,分别加入1、3、5、8、10、15、20 μL浓度为2 moL/L的碳酸钾(K2CO3)溶液调节pH,黄曲霉毒素B1单抗按照5 μg/mL标记,终浓度1% BSA封闭,4 000 r/min离心5 min, 去上清液后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤1次,再次4 000 r/min离心5 min后沉淀用300 μL悬浮液悬浮,按10 μL/cm喷金量将标记好的抗体包被在胶体金结合垫上,37 ℃干燥2 h。
黄曲霉毒素B1偶联抗原和羊抗鼠IgG均分别稀释到0.5 mg/mL,按1 μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上,37 ℃干燥1 h。组装大板、切条,用PBS检测,观察检测线(T线)显色情况,选择没有死金的显色最强的缓冲液用量作为最佳标记pH。
1.2.3 抗体最佳标记浓度与抗原最佳包被浓度的确定用确定的最佳标记pH,单抗分别按照2、3、4、5 μg/mL标记,偶联抗原分别按照0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL包被在T线位置,进行正交试验,检测黄曲霉毒素B1标准品(浓度为0、2、5、10、20、50 μg/kg)浓度,选择0 μg/kg显色明显且灵敏度最高的组合为最佳条件。在此条件下,羊抗鼠IgG分别按照0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL包被在对照线(C线)位置,检测黄曲霉毒素B1标准品(浓度为10 μg/kg)浓度,选择C线显色强度与T线相当的包被浓度为最佳条件。
1.2.4 黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒检测卡的组装将包被有黄曲霉毒素B1偶联抗原和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、喷有黄曲霉毒素B1单抗偶联胶体金的聚酯垫、玻璃纤维滤纸与吸水纸组装在聚氯乙烯(PVC)底板上,用切条机切成3.88 mm宽的试纸条,装入检测卡壳中,即为最终的检测卡。
1.2.5 样品前处理方法的确定将不含黄曲霉毒素B1的玉米样品粉碎后,称取4份,每份各1 g,向其中添加黄曲霉毒素B1标准品溶液,使其终浓度为10 μg/kg。每份样本分别加入5、6、7、8 mL样品提取液,然后用稀释液稀释6倍,用制备的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒检测卡检测,确定提取液与稀释液用量。
1.2.6 标准曲线的建立配制一系列不同浓度(0、10、20、30、40、50和60 μg/kg)的黄曲霉毒素B1标准品,按确定的提取与稀释比例提取稀释后,分别取100 μL加到检测卡的加样孔中,恒温孵育器37 ℃反应10 min,放入胶体金定量读数仪中,读取T线与C线的峰面积比值(T/C值),每个浓度重复检测5次,计算平均值。以T/C值的平均值为横坐标、黄曲霉毒素B1标准品浓度为纵坐标,制作标准曲线。
1.2.7 添加回收试验分别取玉米和玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)样本,检测其中黄曲霉毒素B1含量,然后向其中添加不同浓度(0、10、20和50 μg/kg)的黄曲霉毒素B1标准品,再次进行检测,计算添加回收率。
1.2.8 试剂盒特异性检测分别配制玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素标准品,浓度分别为100、500、1 000、2 000 μg/kg,用黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒检测,考察试剂盒特异性。
1.2.9 试剂盒批内和批间重复性检测用同批次和3个不同批次的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒分别检测黄曲霉毒素B1标准品(浓度分别为5、10、20、40 μg/kg),批内每个浓度重复5次,批间每个浓度重复2次,考察其重复性。
1.2.10 试剂盒稳定性检测将黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒放置于45 ℃温箱中,分别于第0、2、4、6、8周检测黄曲霉毒素B1标准品(浓度分别为5、10、20、40 μg/kg),考察产品的稳定性。
1.2.11 样品检测随机选取10份黄曲霉毒素B1的含量在2~50 μg/kg之间的市售的谷物及饲料样品,分别用HPLC法和本试验制备的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒进行检测,比较检测结果。
1.3 数据统计试验数据利用Excel 2007进行统计分析和标准曲线制作,数据以平均值表示。
2 结果与分析 2.1 胶体金溶液扫描结果以双蒸水为对照,用紫外分光光度计在400~700 nm连续扫描,测定吸收曲线和吸收峰,结果显示,最大吸收峰(λmax)为527 nm,最大吸光度值(ODmax)为0.109。所制备的胶体金溶液颗粒大小在40 nm左右,颜色为透明的酒红色,液面无油质类漂浮物,可用于试纸条制备。
2.2 抗体最佳标记pH胶体金中加入5 μL浓度为2 moL/L的K2CO3溶液调节pH时,标记抗体没有死金现象,且显色最强,调节后的胶体金溶液的pH在8.0左右。
2.3 抗体最佳标记浓度与抗原最佳包被浓度通过正交试验,确定抗体按3 μg/mL标记,T线偶联抗原按照0.2 mg/mL包被,C线羊抗鼠IgG按照0.1 mg/mL包被为最佳条件,在此条件下,试纸条检测黄曲霉毒素B1标准品的检测限为2 μg/kg。
2.4 样品前处理方法的确定取1 g粉碎后的样品,加入8 mL样品提取液提取,然后用稀释液稀释6倍,加样100 μL,37 ℃反应10 min,为最终检测条件。
2.5 标准曲线通过对一系列不同浓度的黄曲霉毒素B1标准品的检测,确定线性范围及对应的T/C值如表 1。以T/C值为横坐标、标准品浓度为纵坐标,建立标准曲线如图 1。
分别取玉米和玉米DDGS样本,检测其中黄曲霉毒素B1含量,然后分别向其中添加0、10、20、50 μg/kg的黄曲霉毒素B1标准品进行检测,计算添加回收率,结果见表 2。玉米样本的添加回收率在98%~125%之间,玉米DDGS样本的添加回收率在96%~136%之间。
由表 3可知,利用黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒检测不同浓度霉菌毒素标准品,结果均小于2 μg/kg,说明该试剂盒与玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素均无交叉反应。
用同批次的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒分别检测黄曲霉毒素B1标准品,每个浓度重复检测5次,批内重复性结果见表 4。结果表明,黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒的批内变异系数均不大于10%。
用3个不同批次的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒分别检测黄曲霉毒素B1标准品,每批次每个浓度重复检测2次,批间重复性结果见表 5。结果表明,黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒的批间变异系数均小于10%。
将黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒放置于45 ℃温箱中,于第0、2、4、6、8周检测黄曲霉毒素B1标准品浓度,其稳定性结果见表 6。结果表明,黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒在45 ℃下保存8周其检测结果仍符合要求,变异系数均小于15%。
利用黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒检测10份样品,结果见表 7。结果显示,黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒的检测结果与HPLC法检测结果相符,相对误差在20%以内。
黄曲霉毒素B1是农产品中最普遍存在的一种霉菌毒素,且其毒性强,可造成养殖动物采食量减少、生产性能下降、免疫力降低等症状,严重的可导致家畜死亡,给养殖业造成巨大损失。同时,如果奶牛摄入含黄曲霉毒素B1的饲粮,经体内代谢后,还会在牛奶中分离出黄曲霉毒素M1,影响牛奶质量。因此,世界各国对黄曲霉毒素B1都有严格的限量标准,而在饲料原料及成品中,黄曲霉毒素B1也是必检项目。
目前市场上常用的检测黄曲霉毒素B1的方法有HPLC法、ELISA法及胶体金免疫层析法。本试验研发的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒与现有产品相比,具有以下几点优势。
首先是操作简便快速。HPLC法在样本提取后要过免疫亲和层析柱,上机检测样本时平均每个需要25 min左右[11]。谢体波等[12]在粮油食品中黄曲霉毒素B1测定试验中使用的市售ELISA试剂盒,4 ℃储存,使用前需要复温,样本提取后要在25 ℃条件下加样反应45 min。且这2种方法都需要专业技术人员操作。本试验研发的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒常温储存,稳定性试验结果表明,45 ℃条件下储存8周其变异系数仍小于15%,相当于常温放置6个月。检测时,样本经过简单提取,稀释后直接加样,在37 ℃孵育器中进行反应,对外界温度没有要求,反应时间只需10 min,批量检测时所需平均时间更短。
其次是结果准确、重复性好。陈笑笑等[7]研制的黄曲霉毒素B1胶体金试剂板结果判定是根据T线与C线颜色对比,T线比C线深或一样为阴性,T线比C线浅或无色为阳性,且只能进行定性检测,即通过结果的阴阳性判断样本中霉菌毒素含量是否超出检测线。这种肉眼判读方法在T线与C线颜色相近时容易产生误差。本试验研发的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒用定量读数仪给出霉菌毒素具体含量,代替肉眼判断的工作,避免人为因素主观判断造成的差异。检测玉米样本的添加回收率在98%~125%,玉米DDGS样本的添加回收率在96%~136%。黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒批内和批间重复性变异系数均不大于10%,检测10份样品与HPLC法检测结果比较相对误差在20%以内,结果符合度高。
最后是检测成本低。HPLC法每个样本要消耗1个免疫亲和层析柱[11],每支价格在70~150元,液相色谱仪也比较昂贵,因此只有一些大型饲料企业的中心化验室进行此项检测。ELISA法在每次检测时都要做标准曲线[12],即6个标准品,因此更适合批量检测,而单个样本检测的成本就比较高。本试验研发的黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒所配定量读数仪内置相应的标准曲线,检测时,不需要再做标准品,因此即使只检测1个样本,也不会增加检测成本,适合大部分饲料企业实际使用需求及成本控制。
4 结论本试验利用胶体金免疫层析技术,以特异性强的单克隆抗体为基础,研发了黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒。该试剂盒稳定性好,与常见的霉菌毒素无交叉反应。同时通过与胶体金定量检读数结合使用,实现了定量检测,满足快速准确的需求。检测不同种类的谷物和饲料样品,其结果与HPLC法检测结果有较高的符合率。
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