亚急性瘤胃酸中毒(SARA)是一种常见的奶牛营养代谢性疾病，奶牛饲粮精料比例过高、优质粗饲料缺乏以及应激反应等都可能引发SARA，通常以奶牛瘤胃液pH持续处于5.2~5.8的时间超过180 min作为SARA判定的标准^[1]。SARA会严重影响奶牛健康及生产性能，如诱发其他营养代谢性疾病、降低采食量和产奶量、影响乳成分合成量及比例等。Plaizier等^[2]调查发现，约有20%的高产泌乳奶牛患有SARA，而北美地区奶牛业每年因SARA损失达5亿~10亿美元。因此，为保障奶牛健康及奶牛产业收益，有必要更加深入地探究SARA的发病机制。目前关于SARA的发病机制主要有3种学说：乳酸中毒学说、有机酸中毒学说以及脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)和组胺中毒学说^[3]。

LPS又称内毒素，广泛存在于革兰氏阴性细菌外膜，在细菌快速生在或死亡裂解时都会大量释放。在当前集约化生产模式下，由于饲粮中物理有效中性洗涤纤维缺乏或进料比例过高，奶牛SARA发生的几率越来越高。当奶牛发生SARA时，瘤胃液pH显著降低，瘤胃内LPS大量增加^{[1, 4]}，而高浓度的LPS会进一步加重SARA。Steele等^[5-6]研究发现，当饲喂高精料诱发SARA时，瘤胃上皮结构被破坏，这可能是高浓度LPS与低pH共同作用的结果。瘤胃上皮结构被破坏，会影响挥发性脂肪酸(VFA)等有机酸的吸收，导致其在瘤胃内大量积累。同时，瘤胃上皮结构被破坏，增加了LPS易位进入外周循环系统的可能性，一旦LPS发生易位，将会引发机体炎症反应，若发生瘤胃炎症，VFA的吸收会进一步受到抑制，再次导致瘤胃内VFA的积累。而瘤胃内VFA的大量积累会使瘤胃液pH快速下降，加重SARA。

然而，国内外对于LPS对SARA影响的研究都是基于LPS与动物机体的互作，而LPS是否会通过直接影响瘤胃微生物发酵来影响SARA病程，国内外却鲜有报道，为进一步了解SARA发病机制，有必要对此进行深入研究。Emmanuel等^[7]和Chin等^[8]研究发现，较低pH与高浓度LPS相互作用会增加黏膜的通透性，作者猜想较低pH与高浓度LPS相互作用也可以影响微生物细胞外膜的结构，使其活性发生改变，进而影响发酵产物。由于体内试验干扰因素众多，本试验选用体外法，探究LPS对瘤胃发酵的影响。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验所用的LPS选购自美国Sigma公司，规格为10 mg/支，其中LPS有效成分含量为3 000 000 EU/mg。

1.2 瘤胃液供体动物及饲养管理

在北京市诚远盛隆牛场选取4头体况良好，体重相近，安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体动物。试验用牛饲喂该牛场常规全混合和日粮(TMR)，其组成及营养水平见表 1。每天07:00和19:30分2次饲喂，自由饮水，自由采食。

1.3 体外瘤胃发酵试验 1.3.1 人工唾液盐配制

人工唾液盐储备液参照Menke等^[9]方法于试验前1天配制，并持续通CO₂待用，组成见表 2。

人工唾液盐各储备液配制好后，在400 mL蒸馏水中依次加入100 μL微量元素溶液A、200 mL碳酸盐缓冲液B、200 mL磷酸盐缓冲液C、1 mL刃天青指示剂和40 mL还原液。充分混匀后持续通入CO₂，直至溶液颜色由粉红变为无色透明，pH调整至6.80为止。使用前39 ℃预热。

1.3.2 体外发酵液

于晨饲前2 h进行瘤胃液采集，4头瘘管奶牛分别采集500 mL，瘤胃液采集后，用4层纱布过滤，并迅速移入预热达39 ℃并通CO₂的保温瓶内，每头牛收集适量食糜置于保温瓶内，收集完毕后迅速带回实验室。在实验室内取4头牛瘤胃液各250 mL，将食糜用2 L人工唾液盐冲洗3次，并用4层纱布过滤后与瘤胃液混匀，即完成体外发酵液的制备，将体外发酵液置于39 ℃水浴锅中，持续通入CO₂待用。

1.3.3 体外发酵底物

发酵底物由蒸汽压片玉米、豆粕、羊草、苜蓿组成，将饲料原料65 ℃烘干48 h，充分研磨过1 mm筛，按照底物配比，称取各原料，混匀待用。发酵底物组成及营养水平见表 3。

1.3.4 试验设计

国内外大量研究显示，当奶牛发生SARA时，其瘤胃内LPS浓度基本处于80 000~150 000 EU/mL^[10-13]，因此本试验LPS添加量选择100 000 EU/mL。采用双因子完全随机试验设计，分为对照组(不添加LPS)和试验组(添加LPS 100 000 EU/mL)，分别发酵2、4、8、12、24 h。每组25个发酵瓶，每组每个时间点5个发酵瓶。参照Menke等^[9]体外发酵方法, 在100 mL发酵瓶中添加0.5 g发酵底物，75 mL体外发酵液，使用恒温培养箱在39 ℃进行培养。

1.4 样品采集及测定

分别于发酵后2、4、8、12、24 h取样，将样品从培养箱中取出后置于冰水中，停止发酵，然后用pH计立即测定pH。将发酵液过4层纱布，分装于2支离心管中，一支按与发酵液比例添加25%的偏磷酸溶液，混匀后于-20 ℃冷冻保存，用于VFA和氨态氮(NH₃-N)浓度的测定，另一支150×g离心15 min，采集2管8 mL上清液用于微生物蛋白(MCP)的测定。瘤胃液中NH₃-N浓度利用靛酚比色法^[14]测定，VFA浓度利用气相色谱以外标法测定^[15]，MCP利用嘌呤法测定^[16]。饲粮和底物样品干物质、粗蛋白质、粗脂肪、钙、磷含量测定使用实验室常规分析方法进行分析^[17]，应用Van Soest等^[18]的方法测定中性洗涤纤维含量。泌乳净能依据NY/T 34—2004^[19]计算。

1.5 数据统计分析

试验数据经Excel 2016进行初步整理后，采用SAS 9.2软件的GLM模型进行线性分析，以P < 0.05为差异显著性的判断标准，0.05≤P < 0.10判定为有差异趋于显著。

2 结果与分析 2.1 发酵液pH

由表 4可知，试验组与对照组发酵液pH均随着发酵时间的延长而降低。各时间点对照组与试验组无显著差异(P＞0.05)，但8、24 h 2个时间点试验组与对照组相比有降低的趋势(0.05≤P < 0.10)。

2.2 发酵液VFA浓度

由表 5可知，随着发酵时间的延长，试验组与对照组发酵液乙酸、丙酸、丁酸含量和总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度均呈上升趋势，2、4、8、12、24 h试验组与对照组无显著差异(P＞0.05)。随着发酵时间的延长，对照组与试验组发酵液乙酸/丙酸呈先升高后降低的趋势，且均在12 h达到峰值，但是试验组与对照组相比，各个时间点均无显著差异(P＞0.05)。

2.3 发酵液NH₃-N浓度

由表 6可知，试验组与对照组发酵液NH₃-N浓度随着发酵时间延长而逐渐升高。2、4、8、12、24 h对照组与试验组发酵液NH₃-N浓度无显著差异(P＞0.05)，但4、8、24 h 3个时间点试验组与对照组相比有降低的趋势(0.05≤P < 0.10)。

2.4 发酵液MCP浓度

由表 7可知，随着发酵时间的延长，试验组与对照组发酵液MCP浓度呈上升趋势。各时间点对照组与试验组发酵液MCP浓度无显著差异(P＞0.05)。

3 讨论 3.1 添加LPS对体外瘤胃发酵液pH变化动态的影响

在动物体内，瘤胃液pH受唾液分泌量、有机酸产量、吸收速率、排出速率以及缓冲物质影响^[20]，而在体外发酵过程中，发酵液pH主要与有机酸等酸性物质以及NH₃-N等碱性物质的产量有关。张建勋等^[21]进行体外发酵试验时发现，随着发酵时间的延长，发酵液pH逐渐下降。本试验中试验组与对照组发酵液pH随发酵时间的延长同样呈下降趋势，这可能是由于VFA等有机酸持续积累造成的。

3.2 添加LPS对体外瘤胃发酵液VFA浓度变化动态的影响

乙酸、丙酸、丁酸等VFA是瘤胃碳水化合物发酵的主要产物，约占TVFA的95%^[22]，主要作用是为动物生产提供能量以及维持瘤胃环境。本试验中TVFA、乙酸、丙酸以及丁酸浓度均呈逐渐升高的趋势，这是由于随着发酵时间的延长，VFA浓度逐渐增加，且在密闭的发酵瓶内，没有VFA的吸收和排出过程。这与张建勋等^[21]进行的体外发酵试验结果相同。本试验中，随着发酵时间的延长，试验组与对照组发酵液乙酸/丙酸也呈先升高后降低的趋势，这可能是由于发酵前期发酵底物纤维比例较高，微生物发酵以乙酸发酵模式为主，乙酸浓度逐渐增加，而在发酵后期，底物中纤维物质由于分解而逐渐减少，微生物发酵转为丙酸发酵模式，丙酸浓度逐渐增加^[23-24]。

3.3 添加LPS对体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度变化动态的影响

反刍动物瘤胃内NH₃-N是饲料蛋白质、非蛋白氮以及内源蛋白质降解的产物，是瘤胃MCP合成的主要原料。与张建勋等^[21]进行的体外发酵试验结果相同，本试验中，随着发酵时间的延长，发酵液NH₃-N浓度也逐渐增加，这可能是由于在瘤胃微生物的作用下，发酵瓶内NH₃-N浓度不断增加，且体外发酵试验相对于瘤胃内缺少了瘤胃壁的吸收及食糜的排空过程，从而造成NH₃-N的积累。然而欧阳克蕙等^[25]进行的体外发酵试验结果显示，随着发酵时间的延长，发酵液NH₃-N浓度呈先升高后降低的趋势。本试验中4、8、24 h 3个时间点试验组相比较于对照组，发酵液NH₃-N浓度有降低趋势。而井龙晖^[26]给奶牛颈静脉灌注LPS发现, 试验组瘤胃液NH₃-N浓度升高，推测可能是因为胃肠道移动减缓了NH₃-N的积累。据报道，低pH会影响瘤胃微生物生长，从而减缓底物发酵速率，降低NH₃-N生成速率^[23]，本试验中8、24 h 2个时间点试验组pH比对照组有降低的趋势，这可能解释了为什么4、8、24 h 3个时间点试验组相比较于对照组，NH₃-N浓度有降低趋势。

3.4 添加LPS对体外瘤胃发酵液MCP浓度变化动态的影响

反刍动物瘤胃中的MCP需要经过一系列复杂的生物过程来合成，可以为动物机体提供优质的氮源，瘤胃合成的MCP基本可以满足动物蛋白质需要量的40%~80%。本试验中随着发酵时间的延长，MCP浓度逐渐增加，这可能是由于发酵底物中的碳水化合物及氮源被逐步分解，瘤胃微生物利用NH₃-N等物质不断合成MCP。然而本试验结果表明，添加LPS不会影响发酵液中MCP浓度。

4 结论

在体外发酵条件下，添加LPS具有降低发酵液pH以及NH₃-N浓度的趋势，但这一影响并不显著。