益生菌，亦称益生素、活菌制剂、微生态制剂等，是指摄入一定量后能起到促进宿主健康功效的一类活的微生物。益生菌为纯生物制品，具有绿色、无残留、无耐药性等特点^[1]；益生菌作为饲料添加剂使用可降低饲料中的抗营养因子，提高饲料利用率^[2]，当动物摄入后能调节肠道微生态平衡，增强机体免疫力，提高动物生产性能^[3-4]，从而给养殖户创造巨大的经济效益。丁酸梭菌，也称宫入菌、酪酸梭菌，它是硬壁菌门、梭菌纲、梭菌目、梭菌科、梭菌属的一种革兰氏阳性菌，普遍存在于正常人和动物的肠道中。已有的研究证明了丁酸梭菌的急性经口毒性试验和艾姆斯试验均呈安全性^[5]，且因其能形成芽孢而具有很强的抗逆性，能够抵抗饲料加工过程中的高温及胃肠道酸性环境^[6]。研究发现，丁酸梭菌具备良好的胃肠道黏附性，可以通过空间占位等作用拮抗鳗弧菌等致病菌^[7]，同时代谢产生多种益生物质来增强宿主免疫功能。可见，丁酸梭菌符合益生菌的安全性、功能特性和技术可行性等筛选标准^[8]。刘红露等^[9]报道了丁酸梭菌CBM01能够提高肉鸡生产性能，增强机体抗氧化功能，并改善肠道菌群结构，然而其生物学特性并不清晰。本试验通过对丁酸梭菌CBM01的碳、氮源优化与其对胃肠道耐受性研究，以深入了解丁酸梭菌CBM01，并为其作为一株益生菌的生产与应用提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验菌种

丁酸梭菌CBM01由四川农业大学动物医学院动物微生态实验室提供。

1.1.2 试验试剂及培养基

人工胃液、人工肠液参照《中国药典》2015版附录项下进行配制。猪胆盐由成都市科龙化工试剂厂提供，FeSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O购自成都市科龙化工试剂厂，MnSO₄购自重庆九龙化学试剂厂。

梭菌增菌培养基(reinforced clostridial medium，RCM)：牛肉膏10 g，葡萄糖5 g，酵母粉10 g，氯化钠5 g，乙酸钠3 g，胰蛋白胨10 g，可溶性淀粉1 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.15 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

基础培养基：葡萄糖5 g，磷酸二氢钾6 g，磷酸氢二钾4 g，硫酸铵2 g，硫酸镁0.2 g，柠檬酸钠1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2~7.4，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

淀粉培养基：蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉膏5 g，可溶性淀粉2 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2~7.4，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2~7.4，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

1.2 主要仪器设备

灭菌锅(Hirayama，HVE-50)、电子天平(Sartorius，BS-224S)、厌氧培养箱(Thermo Scientific，1 029)、紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific，BioMate-3S)。

1.3 试验方法 1.3.1 丁酸梭菌CBM01的活化

准备活化菌种的前2天打开混合气体(CO₂、H₂、N₂)，使厌氧培养箱里面充满混合气体达到严格厌氧的状态。将冻干保存的菌种在厌氧培养箱里用生理盐水稀释后接种于固体RCM，连续传代2次后，再接种于液体RCM中以富集丁酸梭菌CBM01。将活化好的菌种分装，石蜡封顶，置于4 ℃冰箱保存，待用。

1.3.2 丁酸梭菌CBM01生长曲线的测定

将活化的丁酸梭菌CBM01以1%的比例接种于液体RCM，置36 ℃厌氧培养箱(5% CO₂、10% H₂、85% N₂)中培养48 h，每隔4 h取出3支测定其吸光度(OD)_{600 nm}值，绘制菌株的生长曲线。

1.3.3 丁酸梭菌CBM01在不同培养基上的生长情况

将活化的丁酸梭菌CBM01分别接种到基础培养基、RCM、淀粉培养基和牛肉膏蛋白胨培养基上，36 ℃厌氧培养24 h，统计培养基中丁酸梭菌CBM01的生长情况。

1.3.4 丁酸梭菌CBM01的碳源优化试验

选用质量浓度为2%的乳糖、果糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖分别替换RCM中的碳源(葡萄糖和可溶性淀粉)，然后接种丁酸梭菌CBM01，36 ℃厌氧培养24 h，采用血球计数板法计数。

1.3.5 丁酸梭菌CBM01的氮源优化试验

分别选取2%的牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵和硝酸钠替换RCM中的氮源(牛肉膏和胰蛋白胨)，再接种丁酸梭菌CBM01，36 ℃厌氧培养24 h后血球计数板法计数。

1.3.6 丁酸梭菌CBM01的胆盐耐受性试验

分别在质量浓度为0.30%、0.40%和0.50%猪胆盐的液体RCM中接种1%的丁酸梭菌CBM01，每个浓度3个重复，置厌氧培养箱内培养24 h，观察丁酸梭菌CBM01的生长情况。

1.3.7 丁酸梭菌CBM01的胃肠道耐受性试验

将培养至48 h的丁酸梭菌CBM01分别接种于人工胃液和人工肠液中，36 ℃恒温厌氧培养，每小时各取出3只试管测定其活菌数，共测定3 h。取其平均值，计算存活率。

2 2结果与分析 2.1 丁酸梭菌CBM01的生长曲线

以丁酸梭菌CBM01的培养时间为横坐标轴，OD_{600 nm}值为纵坐标轴，绘制其生长曲线。如图 1所示，丁酸梭菌CBM01的延滞期为4 h；4 h后进入对数生长期，该时期的细菌数量呈指数增长，测得OD_{600 nm}值呈线性上升；12 h后则进入稳定期，此时期活菌数量最高。

2.2 丁酸梭菌CBM01在不同培养基上的生长情况

以血球计数板法计数结果或测量培养基上的菌落直径为指标，比较了该菌株在4种不同培养基上的生长情况。由表 1可知，丁酸梭菌CBM01不能在基础培养基和牛肉膏蛋白胨培养基上生长，但能在RCM和淀粉培养基中生长。丁酸梭菌CBM01在RCM中的生长情况优于其在淀粉培养基上的生长情况，考虑到试验效果，故选用RCM来进行后续的试验研究。

2.3 丁酸梭菌CBM01最佳碳源的确定

如图 2所示，丁酸梭菌CBM01能够利用淀粉、蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和麦芽糖6种碳源。可以看出，以葡萄糖作为碳源时培养得到的总细菌数量最高。

2.4 丁酸梭菌CBM01最佳氮源的确定

如图 3所示，有机氮源中蛋白胨培养该菌株的效果最好，牛肉膏次之；无机氮源中，硫酸铵的效果较硝酸钠好；以尿素为氮源时，得到的总细菌数量为1.12×10⁸个/mL。

2.5 丁酸梭菌CBM01对胆盐的耐受能力

由表 2可知，丁酸梭菌CBM01在0.30%胆盐的培养基上能生长，在0.40%胆盐的培养基上也能生长，但在0.50%胆盐的培养基上不生长，这表明了丁酸梭菌CBM01对胆盐的耐受能力良好，具有很好的应用价值。

2.6 丁酸梭菌CBM01对人工胃液和人工肠液的耐受性

本研究按照《中国药典》的要求配制人工胃液和人工肠液作为模拟人体胃肠道环境，对丁酸梭菌CBM01的人工胃液和人工肠液耐受性进行了初步评价，结果如图 4。如图 4所示，随着时间的延长，丁酸梭菌CBM01在人工胃液和人工肠液中的存活率逐步降低：丁酸梭菌CBM01在人工胃液和人工肠液中作用3 h后存活率分别为90.33%和92.09%。

3 讨论

作为动物益生菌制剂，丁酸梭菌早已在日本和韩国被广泛地用作畜禽饲料添加剂^{[8, 10]}。丁酸梭菌为严格的厌氧菌^[11]，培养难度较大，同时受技术和设备的限制，所以我国对丁酸梭菌的研究起步较晚。丁酸梭菌作为芽孢类益生菌，具有很好的开发前景和应用价值，因此受到了广泛地关注与研究。大量的研究和报道证实了丁酸梭菌良好的益生作用^[12-15]，故此我国于2009年批准丁酸梭菌为新饲料添加剂，并在2013版《饲料添加剂品种目录》中规定了其适用范围^[16]。

3.1 丁酸梭菌CBM01的生长曲线绘制

本试验通过测定培养液的OD_{600 nm}绘制丁酸梭菌CBM01的生长曲线(图 1)。丁酸梭菌CBM01的延滞期约为4 h，表明它能够快速地适应环境；4~12 h为对数生长期，12 h以后进入稳定期，此时细菌数量达到峰值。除此之外，我们发现丁酸梭菌CBM01的生长曲线与丁酸梭菌JMY1^[17]的生长曲线较为相似。由丁酸梭菌CBM01在不同培养基上的生长情况，分析该菌株不能在基础培养基和牛肉膏蛋白胨培养基上生长的原因可能是未提供生长需要的碳氮源或生长因子^[18]。

3.2 丁酸梭菌CBM01的最佳碳源和最佳氮源筛选

研究微生物的前提是分离得到单个细菌并能将它连续培养。本试验通过单因素多变量的研究方法，对培养丁酸梭菌CBM01所需的最佳碳源和最佳氮源进行了筛选。当以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源时，得到的总细菌数量最高，同时综合性价比可虑，碳源中葡萄糖的价格最低，氮源中蛋白胨的价格虽然较高，但是其试验效果最好，因此确定丁酸梭菌CBM01的最佳碳源和最佳氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。丁酸梭菌CBM01的最佳碳源与戚薇等^[19]优化的碳源结果一致，与宋会仪^[20]的结果不同；优化得到丁酸梭菌CBM01的最佳氮源为蛋白胨，这与赵旭冬^[21]的研究报道一致，与姜芳芳等^[22]对丁酸梭菌C.L24的优化结果不同，造成此现象的原因可能是由于菌株之间的特异性。

3.3 丁酸梭菌CBM01对胆盐和人工胃、肠液的耐受性研究

随着抗生素作为饲料添加剂使用弊端的不断显现，世界各国相继颁发了一系列法律以限制或禁止抗生素在动物饲料中的使用^[23]，而作为理想的抗生素替代品——益生菌，受到了广大从业人员的青睐。众所周知，益生菌必须具有良好的耐酸和耐胆盐能力，这样才能使其进入消化道内保持一定的活菌数量以发挥作用。丁酸梭菌CBM01对胆盐的耐受性较丁酸梭菌ZJU-F1^[10]的好，能在0.40%的培养基上存活生长，而肠道中胆盐浓度一般不超过0.30%，暗示了丁酸梭菌CBM01进入肠道后可迅速定植并发挥功效。另外，丁酸梭菌CBM01对人工胃、肠液也具有较好的耐受能力，这可能与芽孢杆菌在生长后期形成的芽孢有关。上述结果表明丁酸梭菌CBM01具有优良的生物学特性，可用于微生态制剂或生物饲料进一步的开发与应用。

4 结论

丁酸梭菌CBM01的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨；该菌株对胆盐和人工胃、肠液均有良好的耐受性，能在胃肠道环境中存活较长时间。综上所述，丁酸梭菌CBM01具有优良的生物学特性，是一株理想的潜在益生菌。