鱼类消化道黏膜表面附着着一个复杂的、动态的微生物群体，菌群数量基本固定在每克107~108个细菌的范围内[1]，这些细菌存在于宿主消化道中特定的位置，并参与宿主的饲料消化、营养吸收、能量代谢等过程[2-3]。通过对人类后肠微生物元基因组进行大规模鸟枪法测序分析发现，微生物基因组中含有大量与糖类、氨基酸、外来化合物、甲烷、维生素和胆固醇等物质代谢相关的基因[4]。Bairagi等[5]发现，草鱼(Ctenopharyngodon idella)肠道中富含能分泌淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的微生物。对鱼类肠道中能分泌消化酶的微生物进行纯化培养是获得水产益生菌的主要来源，通过不同途径将益生菌株定植在鱼类肠道内，可以协同鱼类肠道分泌的消化酶共同降解饲料中的营养成分，提高鱼类的饲料利用效率和生长效率。例如，向饲料中添加益生菌能有效提高重口裂腹鱼(Schizothorax davidi)[6]和奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus ♀×O. aureus ♂)[7]的生长速度和肠道消化酶活性。
此外，消化道内的菌群结构对食物具有可塑性，易受饲料营养成分的影响[8-11]。钟蕾等[12]通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)指纹分析并结合克隆、测序，对鳡(Elopichthys bambusa)的肠道菌群结构及多样性进行了研究，结果发现用配合饲料和冰鲜鱼饲喂的鳡肠道内容物菌群结构存在显著差异。水产养殖业的快速发展使得对鱼粉的需求量急剧上升，但由于过度捕捞、环境污染及厄尔尼诺现象等不良气候的影响，野生鱼粉资源日益减少，世界鱼粉的供应已不能满足养殖需求。减少水产饲料中鱼粉的添加量，从而降低水产饲料对鱼粉资源的依赖，是缓解鱼粉资源压力的有效措施之一。在对鱼粉替代蛋白质源的研究中，由于豆粕具有蛋白质含量高、消化率高和氨基酸平衡等特点，被作为水产饲料中适宜的植物蛋白质源。本研究通过对乌鳢(Channa argus)肠道内产蛋白酶好氧菌株的培养，并测定其产蛋白酶的能力，来评价不同蛋白质源(全鱼粉和豆粕替代部分鱼粉)对乌鳢肠道好氧菌组成及产蛋白酶能力的影响，为进一步完善乌鳢肠道微生态营养理论提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 试验饲料配方和制作对照组(D1组)饲料蛋白质源为脱脂鱼粉，添加量为55%。在对照组饲料的基础上，用豆粕替代不同比例的鱼粉配制2种试验组饲料，饲料中豆粕添加量分别为35%(D2组)和75%(D3组)。试验饲料组成及营养水平见表 1。配制饲料前，所有原料过80目筛，混匀，然后添加鱼油和大豆卵磷脂充分混合，加水混匀后在螺杆挤压机中制成3.0 mm×4.0 mm的颗粒，50 ℃烘箱内干燥后置-20 ℃冰箱保存。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
试验用乌鳢幼鱼购自江苏省扬州市高邮董氏特种鱼类养殖场，为当年人工培育的同一批种苗，大小均匀、健康无病。养殖试验在扬州大学水产养殖温室内进行，养殖容器为300 L的玻璃钢桶，桶内水流速度为2 L/min。试验前投喂商业饲料(粗蛋白质含量为45%)，暂养2周以适应环境。试验开始前禁食24 h，然后选择体重[(10.50±0.84) g]相近、体格健壮的乌鳢幼鱼，随机分为3组，每组设3个重复，每个重复放养28尾鱼。每天人工投喂2次(08:00和17:00) 试验饲料，每日观察摄食情况并记录，调整饲料投喂达饱食水平，试验周期为8周。在养殖期间，每周检测2次水质指标，水温为(27.5±1.5) ℃，pH为6.7~6.9，溶解氧浓度为5.5~6.5 mg/L，氨氮浓度为0.037~0.072 mg/L、亚硝酸氮浓度为0.014~0.031 mg/L。
1.3 样品收集及指标测定养殖试验结束后，乌鳢试验鱼禁食24 h后取样。所有试验鱼在取样前要用MS-222(100 mg/kg)麻醉，以减少取样操作对鱼体产生的应激。逐尾鱼称重，计算增重率(WGR)和特定生长率(SGR)；计数每桶的鱼尾数，计算成活率(SR)。
计算公式如下：
增重率(%)=100×(Wt-W0)/W0；
特定生长率(%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t；
成活率(%)=100×Nt/N0。
式中：W0为试验初各组鱼体总重(g)；Wt为试验终各组鱼体总重(g)；W0为试验初各组鱼平均体重(g)；Wt为试验终各组鱼平均体重(g)；t为试验天数(d)；N0为试验初各组鱼尾数；Nt为试验终各组鱼尾数。
随后，每桶随机取10尾鱼，用75%乙醇棉球擦拭鱼体表面以减少细菌污染，用无菌手术剪和手术刀进行解剖。取出肠道后，用灭菌棉线将肠道两端扎紧，置于离心管中，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)。为保证试验数据的可靠性，10尾鱼的肠道置于同一个离心管中，并进行3次重复试验。
好氧菌的培养：使用无菌手提式匀浆机匀浆肠黏膜，并用灭菌PBS按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度对匀浆液进行稀释后混匀；取不同梯度的稀释液各50 μL，分别涂布于淡水鱼类培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司产品，配方如下：蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.5 g，酵母膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，氯化钠15.0 g，硫酸镁0.05 g，磷酸氢二钾0.2 g，琼脂15.0 g，pH 7.2~7.4) 上，每个样品做3个平行。30 ℃恒温培养48 h后进行菌落计数，并用接种环依此挑取不同大小、不同颜色和不同形状的单个菌落在培养基上进行纯化培养。30 ℃恒温培养24 h后，选取纯化菌落，接种于淡水鱼类培养基中，置于摇床(200 r/min)30 ℃扩大培养18 h。各菌液分别取1 mL置于无菌离心管内，与40%甘油按1:1比例混合后保存于-20 ℃冰箱，待提取DNA用于菌株鉴定。
产蛋白酶好氧菌株的筛选及产蛋白酶能力的测定：将纯化的菌液稀释至10-7，混匀后取50 μL涂布于蛋白酶筛选培养基(配方如下：干酪素10.0 g，Na2HPO2 2.0 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 0.20 g，L-酪氨酸0.05 g，牛肉浸膏3.0 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 8.0，121 ℃灭菌20 min)中，每个样品设5个平行，28 ℃培养24 h后观察菌落周围有无水解圈，测量产蛋白酶菌株的直径(r，cm)和对应的水解圈直径(R，cm)，用水解圈直径与菌株直径之比值(R/r值)表示产蛋白酶能力的大小。
产蛋白酶好氧菌株的鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)对菌株进行细菌形态观察和生理生化鉴定。
16S rDNA鉴定方法如下：釆用天根公司细菌基因组提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)按试验操作提取目标菌株DNA。以DNA为模板，采用通用引物扩增其16S rDNA片段，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；反向引物为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系中含ddH2O 21 μL，Mix 25 μL，正向、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR扩增条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循环35次；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR扩增产物由华大基因公司测序。
1.4 数据统计分析采用Excel 2010和SPSS 19.0软件进行数据整理和统计分析，数据采用平均值±标准误(mean±SE)的形式表示，显著水平为P < 0.05。当差异显著时采用Tukey’s多重比较分析组内和组间的差异显著性。
2 结果 2.1 豆粕替代鱼粉对乌鳢生长性能的影响由表 2可知，D1组乌鳢的终末体重、增重率和特定生长率显著高于D2和D3组(P < 0.05)，D2组乌鳢的终末体重、增重率和特定生长率又显著高于D3组(P < 0.05)。D1、D2和D3组乌鳢的成活率分别为88.00%、86.67%和88.00%，豆粕替代不同比例鱼粉对乌鳢的成活率没有产生显著影响(P＞0.05)。
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表 2 豆粕替代鱼粉对乌鳢生长性能的影响 Table 2 Effects of replacement of fish meal by soybean meal on growth performance of Channa argus |
通过对各组乌鳢肠道菌群进行培养，共分离出21株具有产蛋白酶能力的好氧菌。其中，D1组为16株，D2组为19株，D3组为20株，菌株编号见表 3。其中，D1组未检出的菌株为P1003、P1006、P1015、P1016和P1020，D2组未检出的菌株为P1002和P1020，D3组未检出的菌株为P1002。
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表 3 分离自乌鳢肠道的产蛋白酶好氧菌株及其产蛋白酶能力 Table 3 Protease-producing aerobic bacteria strains isolated from Channa argus intestinal tract and their protease-producing activity (n=5) |
在菌株筛选的基础上，对每株好氧菌的产蛋白酶能力进行测定，测定结果用R/r值表示，结果见表 3。统计分析表明，同组内不同菌株间的R/r值存在显著差异(P < 0.05)。D1组内产蛋白酶能力较强的菌株为P1007、P1008和P1009，D2和D3组内产蛋白酶能力较强的菌株为P1009和P1012。其中，P1009菌株在3组内的产蛋白酶能力均最强，3组中该菌株的R/r值分别为2.91、3.22和3.15；D1组内产蛋白酶能力较弱的菌株包括P1002、P1010、P1014和P1019，D2组内产蛋白酶能力较弱的菌株包括P1003、P1010和P1014，D3组内产蛋白酶能力较弱的菌株包括P1003、P1014和P1019。
2.3 豆粕替代鱼粉对乌鳢肠道产蛋白酶好氧菌产蛋白酶能力的影响筛选肉眼可见明显水解圈，且水解圈界限明显可辨的菌株进行产蛋白酶能力比较。由表 4可知，豆粕替代鱼粉显著降低了菌株P1004和P1018的产蛋白酶能力(P < 0.05)，但显著增加了菌株P1009和P1012的产蛋白酶能力(P < 0.05)；另外，随着豆粕替代鱼粉比例的增加，菌株P1018的产蛋白酶能力显著下降(P < 0.05)。
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表 4 豆粕替代鱼粉对乌鳢肠道产蛋白酶好氧菌产蛋白酶能力的影响 Table 4 Effects of replacement of fish meal by soybean meal on protease-producing activity of protease-producing aerobic bacteria in intestinal tract of Channa argus (n=5) |
用淡水鱼类培养基进行培养时发现，菌株P1009的菌落较小，中央隆起，且为革兰氏染色阴性菌。其生理生化特征如表 5所示，精氨酸双水解酶试验、氧化酶试验、葡萄糖发酵试验和枸橼酸盐是验结果均为阳性，而氧化酶试验和麦芽糖酶试验结果均为阴性。对菌株P1009进一步进行16S rDNA序列分析鉴定，结果表明菌株P1009为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
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表 5 菌株P1009生理生化特征鉴定结果 Table 5 Identification results of physiological and biochemical characteristics of strain P1009 |
鱼粉具有高蛋白质，富含必需氨基酸、脂肪酸和未知生长因子，适口性好以及较好的消化率等优点，一直以来被作为水产饲料中的主要蛋白质源。在本研究中，全鱼粉对照组(D1组)乌鳢的增重率和特定生长率显著高于豆粕替代组(D2组、D3组)，充分说明鱼粉是水产饲料的优质蛋白质源[13]。当豆粕替代不同比例鱼粉，使得饲料中豆粕添加量分别为35%和75%时，乌鳢的生长受到了显著影响，这可能与大豆中含有的某些营养拮抗因子，比如大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子、皂角甙等有关[14]。
利用高通量测序技术发现，脊椎动物消化道内存在大量的微生物。以人体为例，结肠内聚积着10倍于人体细胞数、100倍于人体基因组的细菌，种类达到1 150种之多[15]，这些细菌在肠道内构成了复杂的微生态系统[16]。消化道菌群与宿主和消化道环境(如饲料或食物及生境)三者之间构成了相互作用与相互依赖的“三角”关系，参与动物饲料消化、营养吸收、能量代谢的过程[2-3, 17]。本试验通过对乌鳢肠道内的好氧菌进行培养，共筛选出21株具有产蛋白酶能力的好氧菌株。王建建等[18]通过对野生和养殖银鲳(Pampus argenteus)消化道内产酶菌进行分析，结果表明，野生银鲳消化道内分离到16株产酶菌，其中44%可培养菌能产蛋白酶，养殖银鲳消化道内分离到22株产酶菌，其中70%可培养菌可产蛋白酶。杨亚东等[19]用培养法对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道内的微生物进行培养，共获得27株产蛋白酶的菌株。以上结果说明，动物肠道内的微生物具有分泌消化酶的功能，能协助宿主对营养物质进行消化吸收，从而提高宿主对饲料的利用率[20]。
Ray等[21]研究发现，生长在同一环境下摄食不同食物的卡特拉(Catla catla)、印度鲮(Cirrhinus mrigala)和南亚野鲮(Labeo rohita)消化道菌群所产酶的种类和活性不同，这也证明了鱼类消化道菌群结构随食物的改变而发生“结构—功能”的变化。本研究中，用豆粕替代不同比例鱼粉后，乌鳢肠道产蛋白酶好氧菌株的种类和数量发生了变化。例如，D2和D3组乌鳢未检测出菌株P1002，D1组乌鳢未检测出菌株P1003、P1006、P1015和P1016，而D1和D2组乌鳢未检测出菌株P1020。同时，部分菌株的产蛋白酶能力也受到了显著的影响，豆粕替代鱼粉有助于提高菌株P1009和P1012的产蛋白酶能力。对其他鱼类的研究也证明，饲料蛋白质的来源显著影响肠道菌群结构。例如，用豆粕替代金头鲷(Sparus aurata L.)饲料中30%的鱼粉，其肠道中蓝藻和乳杆菌数量显著增加，但Synergistetes数量显著下降[22]。Gajardo等[23]用不同种类的植物性蛋白质源替代鱼粉饲喂大西洋鲑(Salmo salar L.)，结果发现，全鱼粉对照组的大西洋鲑肠道内含有较多的杆菌属、链球菌属、梭菌属和鲸杆菌属，以上结果可能与微生物生长所需营养成分有关，由于植物性蛋白质源中含有更多的难以消化的纤维和低分子低聚糖，因此也更利于以此为代谢底物的乳酸菌等微生物的生长[24-25]。
益生菌是一类具有巨大实用价值的生物工程产品，常见水产益生菌的种类主要有乳酸菌和芽孢杆菌等，其中应用最广泛的是能产生蛋白酶的芽孢杆菌，其在促进养殖动物生长、增强抗病力、改善水体环境等方面具有重要作用。另外，从养殖动物肠道内分离出的其他菌种也可以作为潜在益生菌进行开发利用。在本研究中，从乌鳢肠道内筛选的铜绿假单胞菌具有较高的产蛋白酶能力。Chythanya等[26]研究了铜绿假单胞菌胞外产物对哈维氏弧菌(V. harveyi)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、河弧菌(V. fluvialis)等对虾致病菌的抑菌效果，确定了铜绿假单胞菌对这些病原菌的抑菌作用。Vijayan等[27]发现铜绿假单胞菌能有效抑制弧菌和气单胞菌。鉴于铜绿假单胞菌在蛋白酶分泌和抑菌方面的重要功能，可以考虑将其作为益生菌开发的潜在菌种。同时，考虑到豆粕替代鱼粉后对乌鳢肠道内的产蛋白酶菌株及其产蛋白酶能力均产生了一定变化，因此在开发益生菌的同时，应考虑到饲料原料的影响，以期能最大程度地发挥益生菌的重要功能。需要注意的是，部分产蛋白酶菌株，如蜂窝哈夫尼亚菌和维氏气单胞菌，均属于条件致病菌[28-29]。
据估计，脊椎动物消化道内可被鉴定的微生物仅占10%，而能在实验室条件下进行培养的微生物仅占1%[30-31]。对淡水鱼如神仙鱼(Pterophyllum scalare)和眼斑星丽鱼(Astronotus ocellatus)以及海水鱼如漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)进行的研究也发现，消化道厌氧菌在鱼类营养物质消化和吸收过程中发挥重要的作用，这些厌氧菌能够提供多种不同的酶，包括糖酶、磷酸酶、脂肪酶以及蛋白酶等，从而帮助鱼类对营养物质进行消化和吸收[32]。因此，本试验采用基础培养试验的方法对乌鳢肠道内产蛋白酶菌株进行分析，本身存在一定的局限性。另外，由于本试验仅采用淡水鱼类培养基进行产蛋白酶菌株的筛选，可能会导致某些可培养菌无法正常生长。因此，对乌鳢肠道益生菌的开发还需依赖菌株培养方法和试验手段的进一步提高。
4 结论① 乌鳢肠道内存在着丰富的产蛋白酶好氧菌，这些好氧菌的产蛋白酶能力存在一定的差异。其中，菌株P1009、P1008、P1007、P1012和P1015的产蛋白酶能力较强，R/r值为2.44~3.22。
② 豆粕替代鱼粉显著降低了菌株P1004和P1018的产蛋白酶能力，但显著增加了菌株P1009和P1012的产蛋白酶能力。随着豆粕替代鱼粉比例的增加，菌株P1018的产蛋白酶能力显著下降，该结果说明了消化道内菌群结构对食物具有可塑性。
③ 通过16S rDNA序列分析鉴定表明产蛋白酶能力最强的菌株P1009是铜绿假单胞菌，结合铜绿假单胞菌的特性，可以考虑将其作为益生菌开发的潜在菌种。
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