2. 广东省农业科学院, 广州 510640
2. Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
动物胃肠道是一个开放且复杂的生态系统，每克肠道内容物中含有1 011~1 014个微生物，且种类丰富多样，这些微生物会对宿主的营养、生理及免疫产生显著影响[1-2]。因此，胃肠道菌群对宿主健康的影响备受研究者的关注。饲用抗生素的不合理和不规范使用，导致动物自身免疫力下降、采食量下降及肠道菌群失调。鉴于此，功能性饲料添加剂如酸化剂、酶制剂、益生素等抗生素替代物在近20年得到广泛的研究与应用。研究认为，酸化剂可改善畜禽的生产性能和肠道菌群，如提高饲粮的养分消化率、改善肠道微生态环境、改善小肠组织结构、促进肠道有益菌增殖、减少致病菌及细菌毒素的产生等[3-8]。硫酸新霉素属于氨基糖苷类广谱抗生素，临床上主要用于治疗畜禽细菌性胃肠道感染，口服给药很少出现毒性反应，口服后大部分以原形药随粪便排出，畜禽体内无药物残留。鉴于硫酸新霉素具有对畜禽的高度安全性以及不易产生耐药性和交叉耐药性等优点而成为国外最常用的兽药之一。目前，大多数研究报道均为基于酸化剂和抗生素促生长剂对畜禽肠道内容物微生物丛的研究，而硫酸新霉素作为预防用药和酸化剂对畜禽胃肠道黏膜微生物影响的研究尚未见报道。因此，本试验以岭南黄羽肉鸡作为试验素材，采用聚合酶链式反应(PCR)-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术与16S rDNA基因序列技术分析酸化剂和亚剂量硫酸新霉素对黄羽肉鸡回肠黏膜菌群组成及多样性的影响，为今后深入开展饲用抗生素和酸化剂的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与试验设计试验于2014年10月29日至2014年12月9日在广东省农业科学院动物科学研究所试验场地完成，试验期42 d。选择800只1日龄健康岭南黄羽肉鸡，随机分为4个组，每组5个重复，每个重复40只鸡，各组的初始体重无显著差异(P>0.05)。对照组(A组)饲喂基础饲粮，B、C和D组饲粮分别在基础饲粮中添加0.2%酸化剂Ⅰ、0.3%酸化剂Ⅱ和50 mg/kg硫酸新霉素。酸化剂Ⅰ[(2009)外饲准字198号]为国外品牌，组成成分为磷酸、甲酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸和酒石酸；酸化剂Ⅱ[粤饲添字(2007)186007]为国内品牌，组成成分为延胡索酸、乳酸、柠檬酸、丙酸和甲酸。2种酸化剂的用量均按其说明书推荐的剂量。硫酸新霉素(干品效价：675 U/mg)购于宜昌三峡制药有限公司，其用量依据《进口兽药质量标准》(1999年版)。
1.2 饲养管理试验鸡均在封闭式肉鸡舍内地面平养，地面铺放木屑，光照时间24 h，自由采食和饮水。试验选用玉米-豆粕型基础饲粮，参照NRC(1994)建议的《鸡的营养需要量》、《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)和《中国饲料成分及营养价值表(2005年)》，按照1~21日龄和22~42日龄2个阶段进行饲粮配制。1~21日龄饲粮的粗蛋白质水平为21%，代谢能水平为12.12 MJ/kg；22~42日龄饲粮的粗蛋白质水平为19%，代谢能水平为12.54 MJ/kg。试验采用常规免疫程序，鸡舍平均温度约22 ℃，相对湿度控制在60%~65%。试验期间鸡只未发生疾病，采用常规消毒。
1.3 指标测定分别于试验鸡1、21和42日龄时，以重复为单位进行空腹称重。称重前12 h停料、不停水，于第2天08:00进行空腹称重。计算每个重复试验鸡的平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F/G)。
1.4 样品采集、前处理及DNA提取分别于试验鸡1、7、14、21、28、35和42日龄时，早上喂料前从每个重复中随机挑选2只(每组10只)健康的试验鸡屠宰，采集回肠黏膜样品(中部2 cm)，截取1 cm立即放入液氮中速冻，于-80 ℃保存备用。前处理方法参照文献[9-10]，即将样品解冻后，将1 cm肠段纵向剪开，用灭菌生理盐水漂洗掉大块的内容物，重复冲洗2次，使黏附在肠壁上的消化物和结合松懈的细菌和黏液分离；将冲洗干净的肠段样品放入1 mL灭菌生理盐水(包含0.1%土温80)中，漩涡振荡30 s，使贴于黏膜的细菌分离，此步骤重复1次；将得到的细菌悬液13 000 r/min、4 ℃离心30 min，收集菌体。合并每组10只鸡的另外1 cm回肠黏膜样品，菌体置于1.5 mL的TE缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]中，取500 μL用来提取DNA；其余1 mL立即置于液氮中速冻，于-80 ℃保存备用。采用EZgeneTM Bacterial gDNA Kit(Biomiga，美国)试剂盒进行DNA提取，其操作步骤按说明书进行。
1.5 PCR-DGGE与图谱分析 1.5.1 PCR-DGGE根据参考文献[11]设计出16S rDNA的V3区PCR扩增引物(由上海生物工程有限公司合成)，341F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCG-GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。PCR反应体系(50 μL)：10×buffer(含氯化镁)5 μL，dNTPs(10 mmol/L)4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA(20 ng/μL)5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O补足50 μL，同时设不添加模板的阴性对照；PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR产物用1.2%的1×TAE琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物采用试剂盒(上海生物工程有限公司)回收，其方法依照试剂盒的使用说明。
采用Bio-Rad Dcode系统进行PCR-DGGE凝胶电泳。凝胶梯度为40%~60%，变性方向与电泳方向一致。100%变性剂溶液含7 mol/L尿素和40%去离子甲酰胺。使用1×TAE缓冲液，70 V、60 ℃电泳14 h，PCR产物上样量为20 μL。采用硝酸银染色法，将银染的凝胶放置在白光投射仪上，用数码相机拍照并保存图片。
1.5.2 PCR-DGGE凝胶图像与数据分析采用Phoretix 1D Pro (Totallab)软件对PCR-DGGE图像进行聚类分析。动态变化性计算公式[12]为：
% change=100-% similarity。
式中：% similarity表示2个相邻时间点相似性的比较；% change为变化值或者改变值，表示在一段时间内某个微生态系统的改变或更新程度。
1.6 16S rDNA随机克隆文库的构建 1.6.1 细菌16S rDNA V3区PCR扩增以42日龄黄羽肉鸡回肠黏膜细菌基因组DNA为模板，根据参考文献[11]设计出16S rDNA V3区的引物(无GC夹)进行PCR扩增。引物(由上海生物工程有限公司合成)：341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。PCR反应体系、扩增条件、电泳检测和PCR产物回收同1.5.1。
1.6.2 随机克隆文库构建与数据分析PCR回收产物连接到pMD18-T载体[购于宝生物工程(大连)有限公司]，置于4 ℃冰箱连接过夜，用DH5α感受态细胞[购于宝生物工程(大连)有限公司]进行重组载体转化，将转化产物加入LB培养基中37 ℃、160 r/min培养1 h后，取适量培养物涂布于LB抗性平板[含50 μg/mL氨苄青霉素(Amp)、20%异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和2.5% 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)]上，将平板移置37 ℃培养箱中培养12~14 h，取出置于4 ℃冰箱过夜。从平板中挑取100个白色单菌落，接入LB培养液(含50 μg/mL Amp)中，移入摇床170 r/min、37 ℃振荡培养12~14 h。以菌液作为模板，用引物BcaBEST Primer M13-47[购于宝生物工程(大连)有限公司]扩增pMD18-T载体目的片段，进行阳性克隆PCR鉴定，并挑选阳性克隆子的菌液进行测序(华大基因)，建立克隆文库。文库数据分析方法见文献[13]。
1.7 数据处理与分析肉鸡生产性能数据用SPSS 13.0软件进行统计，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)程序和Duncan氏多重比较法进行分析，数据结果以“平均值±标准误”来表示。
测序得到的16S rDNA V3区基因序列经DNASTAR找出目的片段，并在RDP数据库中寻找相似性序列(相似性≥95%)进行比对分析。回肠随机克隆文库中克隆子所占比例均采用u检验法进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 岭南黄羽肉鸡的生产性能由表 1可知，各组各阶段肉鸡的终未体重、平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著差异(P>0.05)。由此可见，饲粮中添加酸化剂和硫酸新霉素对不同生长阶段岭南黄羽肉鸡的生产性能无显著影响。
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表 1 酸化剂与硫酸新霉素对岭南黄羽肉鸡生产性能的影响 Table 1 Effects of acidifiers and neomycin sulfate on performance of Lingnan yellow-feathered broilers |
回肠黏膜细菌DNA电泳结果发现，片段大小约2 300 bp，经核酸蛋白仪测定可作为PCR扩增16S rDNA V3区序列的模板。16S rDNA V3区PCR产物大小约为240 bp，片段大小与预期的一致(图略)。克隆子PCR鉴定结果显示(图 1)，用引物BcaBEST Primer M13-47扩增的PCR产物大小约为330 bp。条带单一无引物二聚体，片段大小正确的鉴定为阳性克隆子。4组分别从LB抗性平板上随机挑选100个阳性克隆子，A组符合测序的克隆子总数为94个，B组为87个，C组为98个，D组为94个。
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M泳道：DL 2000；1~23泳道：A、B、C及D组LB抗性平板随机挑选的单克隆子；24泳道：阴性对照。 Lane M:DL 2000;lane 1 to 23:clones selected randomly from LB resistance plates in groups A, B, C and D; lane 24:negative control. 图 1 克隆子PCR鉴定结果 Figure 1 PCR identification result of the clones |
Phoretix 1D Pro软件分析PCR-DGGE图谱发现(表 2)，A组与B、C、D组1~42日龄肉鸡回肠黏膜菌群结构的相似性较低，分别为36%~75%、33%~75%、40%~71%。聚类分析发现(图 2)，A组的1日龄和B组的1日龄聚为一小类，A组的其他日龄单独聚为一小类，且与其他各组的不同日龄均未发生聚类。动态变化趋势分析发现(图 3)，1~42日龄时4组肉鸡回肠黏膜菌群结构发生变化的程度不同，1~28日龄时A组的动态变化值为9%~33%，B、C、D组的动态变化值分别为8%~90%、8%~56%、17%~45%；35~42日龄时A组的动态变化值仅为11%~17%，B、C、D组的动态变化值分别为5%~67%、12%~20%和29%~33%。由此可见，饲粮中长期添加酸化剂和亚剂量硫酸新霉素导致B组肉鸡1~42日龄、C和D组肉鸡1~28日龄时回肠黏膜菌群结构发生剧烈变化。
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表 2 肉鸡回肠黏膜菌群结构相似性矩阵分析 Table 2 Analysis of the similarity matrix of ileal mucosa microbiota structure of broilers |
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A1~A42、B1~B42、C1~C42、D1~D42：A组、B组、C组、D组1、7、14、21、28、35、42日龄肉鸡回肠黏膜细菌基因组DNA样品。 A1 to A42, B1 to B42, C1 to C42 and D1 to D42: samples of genomic DNA of ileal mucosa microbiota of broilers in groups A, B, C and D at 1, 7, 14, 21, 28, 35 and 42 days of age, respectively. 图 2 肉鸡回肠黏膜菌群结构相似性聚类分析树状图 Figure 2 The similarity clustering analysis dendrogram of ileal mucosa microbiota structure of broilers |
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图 3 肉鸡回肠黏膜菌群结构动态变化趋势图 Figure 3 The dynamic change trend curves of ileal mucosa microbiota structure of broilers |
由表 3可知，A组的库容值低于其他3组，OTUs(operational taxonomic units)、香农指数、均匀度、丰富度和辛普森指数均高于B和C组，A组的香农指数和丰富度高于D组，均匀度和辛普森指数与D组相当。说明A组42日龄肉鸡回肠黏膜菌群的多样性高于B、C和D组，菌群多样性信息丰富，物种丰富度高。
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表 3 42日龄肉鸡回肠黏膜菌群多样性分析 Table 3 Analysis of the diversity of ileal mucosa microbiota of broilers at 42 days of age |
由表 4可知，A组肉鸡回肠黏膜细菌16S rDNA随机克隆文库有94个序列，共6个属，归为4个科和2个门；B组有87个序列，共3个属，归为3个科和1个门；C组有98个序列，共2个属于，归为2个科和1个门；D组有94个序列，共3个属，归为3个科和2个门。4组中未知序列所占克隆总数的比例分别为55.32%、86.21%、88.78%和47.87%，这些细菌在GenBank数据库中找到与其相似性为100.0%的序列(FJ471462.1)；其次是厚壁菌门(Firmicutes)，所占克隆总数的比例分别为43.62%、13.79%、11.22%和51.06%，厚壁菌门中乳杆菌科(Lactobacillaceae)所占克隆总数的比例最大，分别为39.36%、6.90%、10.20%和50.00%。A和D组乳杆菌属(Lactobacillus)所占克隆总数的比例分别为39.36%和50.00%，极显著高于B(6.90%)和C组(10.20%)(P < 00.01)；A组与其他各组其他菌属的种类与组成比例存在差异，且均未发现与埃希氏菌属(Escherichia)相关序列。由此可见，饲粮中长期添加酸化剂和亚剂量硫酸新霉素会影响42日龄肉鸡回肠黏膜细菌的种类和组成比例，尤其是优势菌群乳杆菌属的比例。
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表 4 42日龄肉鸡回肠黏膜细菌16S rDNA随机克隆文库分析 Table 4 Analysis of the random clone library of 16S rDNA of ileal mucosa microbiota of broilers at 42 days of age |
肉鸡生长速度快，易受生理、环境等因素的影响造成肠道酸度不足和炎症，而酸化剂可调节肠道适宜的酸性环境，酸化剂和抗生素均可抑制有害菌、促进有益菌增殖和消除肠道炎症；但长期使用酸化剂和抗生素，会扰乱宿主肠道菌群的平衡。本试验PCR-DGGE图谱分析表明，1~42日龄时A组与B、C、D组肉鸡回肠黏膜菌群结构的相似性较低，1~28日龄时B、C和D组回肠黏膜菌群结构发生剧烈变化，35~42日龄时B组回肠黏膜菌群结构发生剧烈变化。试验期间观察肉鸡的采食、饮水、排泄等行为均表现正常，各组肉鸡的生产性能无显著差异，显示了酸化剂与抗生素的持续压力造成肠道内环境发生改变，迫使黏膜细菌重新选择与定植，导致黏膜菌群的多样性相对减少，各组回肠黏膜菌属的种类与组成比例存在差异，尤其是乳酸杆菌属的组成比例。宿主肠道微生物丛的成熟和稳定性受年龄、饲粮组分、抗生素、遗传等因素的影响，进而影响宿主的生命活动[14-15]。
酸化剂在家禽生产中的应用研究滞后于仔猪。研究表明，饲粮中添加酸化剂能显著降低鸡十二指肠[16]、回肠[16-18]、空肠[19]和盲肠[17, 19-22]内容物中大肠杆菌的数量，但对乳酸杆菌数量影响的报道有争议。抗生素的主要功能是疾病防治和促生长，对肠道微生态影响的研究鲜有报道，且主要集中在常见抗生素促生长剂对鸡肠道内容物微生物的影响，如阿维菌素、亚甲基水杨酸杆菌肽、恩拉霉素、维吉尼亚霉素、盐霉素等[14, 23-27]。然而，抗生素促生长剂已被世界各国禁止在畜禽饲粮中添加使用或限制其最高用量，近年来关于饲用抗生素对动物肠道微生态影响的研究资料极少。本研究旨在探讨酸化剂与硫酸新霉素(农业部许可使用)对肉鸡回肠黏膜菌群的影响，研究发现，A和D组乳杆菌属所占克隆总数的比例分别为39.36%和50.00%，极显著高于B(6.90%)和C组(10.20%)，这与多数有关酸化剂对鸡回肠内容物乳酸杆菌的影响结果不一致，其原因可能是酸化剂的组成种类和处理技术不同。未经包被的酸化剂进入胃肠道后迅速发挥酸化作用，降低肠道pH，抑制大肠杆菌等有害菌的增殖，而对有益菌未发生显著影响；酸化剂经包被后不易被饲粮成分中和，达到缓释效果，调节肠道pH，能显著提高乳酸杆菌等有益菌的增殖[20, 28]。各组肉鸡回肠黏膜细菌16S rDNA随机克隆文库分析均未发现与埃希氏菌属(Escherichia)相关序列，其原因可能是：1)肉鸡的品种不同，肠道微生物的选择与定植不同。报道认为，5~6周龄罗氏(ROSS)肉鸡回肠黏膜中可检测到埃希氏菌属相关系列[29-30]，与本试验结果不一致；2)细菌的适宜生长环境不同。大多数有害菌适宜在中性偏碱性环境中生长，如大肠杆菌pH为6.0~8.0，而有益菌更适宜于在酸性环境中生长(pH为5.4~6.4)。本试验测得各组肉鸡(42日龄)整个肠道(嗉囊至盲肠)内容物均属于酸性环境(pH为3.2~6.7)(数据未列出)，较适宜有益菌的生长。此外，回肠黏膜细菌16S rDNA随机克隆文库分析发现，饲粮中长期添加亚剂量硫酸新霉素能增加回肠黏膜优势菌群乳酸杆菌属的组成比例，提示亚剂量抗生素作为预防用药在畜禽生产上的应用将是新的研究方向，是一种积极信号，其结果目前暂未见文献报道，有待深入研究。而有关酸化剂或抗生素、肠腔微生物和黏膜微生物3者间相互影响的研究目前尚不清楚，关于饲用抗生素与肠道黏膜菌群的相互影响需进一步研究。
4 结论饲粮中长期添加酸化剂和亚剂量硫酸新霉素会使1~28日龄岭南黄羽肉鸡回肠黏膜菌群结构发生剧烈变化，42日龄肉鸡回肠黏膜菌群的多样性下降，乳酸杆菌属的组成发生改变。
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