2. 成都动物园, 成都 610081;
3. 四川省畜牧科学研究院, 成都 610066
2. Chengdu Zoo, Chengdu 610081, China;
3. Sichuan Animal Science Institute, Chengdu 610066, China
川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)别名仰鼻猴,属哺乳纲、灵长目、仰鼻猴属[1],是我国特有的国家一级保护动物,主要分布于四川、甘肃、陕西和湖北等地[2],其外形优美且种群稀少,是典型的森林树栖动物,群栖于高山密林中,其食性复杂,但均以植物性食物为主[3]。随着人类活动的增多,川金丝猴的栖息地受到严重破坏,加上环境因素以及少量天敌的影响,其数量不断减少。而四川南坪白河、陕西周至和湖北神农3个国家级金丝猴自然保护区的建立[4]及人工饲养繁育使川金丝猴的繁殖和种群逐渐得以恢复。并且,胃肠道微生物的研究和利用也是目前野生动物繁殖及种群保护的重要措施[5]。肠道微生物组成及功能与宿主的消化、免疫应答和生理功能密切相关[6-7]。近年来,已有研究初步报道了川金丝猴部分肠段及粪便菌群结构及组成等信息[3, 8-9],但其整个胃肠道菌群的信息仍处于未知状态。因此,研究整个胃肠道菌群结构及组成对川金丝猴的饲养繁殖及种群保护具有重要的指导意义。
聚合酶链式反应(PCR)-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是近年来在菌群多样性方面应用最为广泛的分子生物学技术,它为菌群结构及组成的研究提供了强有力的保障[10]。因此,本试验拟运用PCR-DGGE技术研究1只死亡野生川金丝猴胃肠道(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和粪便)菌群的多样性,并对主要条带进行克隆测序后构建系统发育树,以期丰富川金丝猴胃肠道菌群信息,为其饲养、健康生长及种群保护提供科学的指导。
1 材料与方法 1.1 样品采集2016年3月,四川省绵阳市平武县救护站在野外发现1只消瘦、濒临死亡的野生老龄雌性川金丝猴(18岁),并送至成都动物园救治,对其补充营养及补液(5%葡萄糖、生理盐水和碳酸氢钠),期间其未进食任何食物,收集其粪便样品,救治无效死亡,解剖后脏器病理观察仅见心脏有陈旧性梗死灶并伴有心肌纤维化和钙化,判断可能死于心脏病。同时收集胃肠道内容物样品(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)至灭菌2 mL离心管中,液氮速冻后-80 ℃保存备用。
1.2 总DNA提取采用QIAamp® DNA Stool Mini Kit提取样品细菌总DNA,溶于200 μL的Buffer AE溶液中保存,置-20 ℃备用。
1.3 细菌总DNA的16S rDNA V3区PCR扩增以样品细菌总DNA为模板,使用大肠杆菌通用扩增细菌16S rDNA V3区序列[10]。上游引物为5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′(带下划线部分为“GC”夹子);下游引物为5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。PCR扩增体系(50 μL):模板DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,2×Taq Master Mix 25 μL,补双蒸水(ddH2O)至50 μL。PCR扩增程序为:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,58 ℃复性30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;最终72 ℃延伸10 min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.4 PCR产物的PCR-DGGE指纹图谱分析及条带克隆测序采用Bio-Rad Dcode系统对PCR产物(10 μL)进行DGGE分析,凝胶梯度为35%~65%,在1×TAE缓冲液中100 V、60 ℃条件电泳16 h。用硝酸银染色法对DGGE结果显色,并用Bio-Rad® GS800 Calibrated Densitometer对结果扫描成像。切胶回收DGGE指纹图谱上的共性条带和特异性条带,用Gel Extraction Kit(美国Omega公司)回收条带,并用PMD19-T载体和大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆筛选目的条带,阳性克隆送至上海生物工程有限公司进行测序。测定序列在GenBank数据库中进行比对,下载亲缘关系最近的细菌或克隆序列,用MEGA软件分析并获得序列的进化树。
1.5 数据分析用Excel 2013对DGGE指纹图谱的多样性进行统计分析,用SPSS 19.0软件进行主成分分析(PCA),用NTSYS 2.1软件进行聚类分析,用MEGA软件对克隆测序结果进行系统进化树分析。其中,多样性指标的计算公式如下:
式中:H为香农-威纳指数(Shannon-Wiener index),用于表示多样性指数(diversity index);pi为物种i的相对丰度比例;E为均匀度(evenness);R为丰富度(richness);s为样品在DGGE的条带数。
2 结果与分析 2.1 野生川金丝猴胃肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱的聚类分析野生川金丝猴胃肠道样品16S rDNA PCR产物的DGGE检测结果如图 1所示。DGGE图谱的非加权分组平均(UPGMA)法分析显示,来自胃、十二指肠和空肠的样品聚为一大簇,其相似性系数为0.97;来自回肠、盲肠、结肠和直肠的样品同样聚为一簇,其相似性系数为0.60;而来自粪便的样品则单独聚为一簇,与其他胃肠道样品的相似性系数仅为0.45。DGGE图谱条带结果显示,野生川金丝猴胃肠道栖息着大量细菌,且栖息在各部位的细菌种类和数量存在一定差异。所有胃肠道样品共分离出52个条带。其中,粪便样品中的细菌种类最丰富,条带数为32;其次是胃和小肠(十二指肠和空肠)样品,条带数分别为27、27和28;而大肠(回肠、盲肠、结肠和直肠)样品中的细菌种类相对较少,条带数分别为13、13、16和15。这些部位菌群组成差异的产生可能与宿主健康状态或其胃肠道各部位的消化功能及细菌定植差异相关。
野生川金丝猴胃肠道菌群的多样性分析结果如图 2所示。由图可知,胃肠道各样品菌群的多样性存在差异。粪便菌群的多样性指数、均匀度和丰富度最高,分别为3.47、0.88和32.00;胃、十二指肠和空肠菌群的多样性指数、均匀度和丰富度较高,分别为3.30、0.83、27.00和3.30、0.83、27.00及3.33、0.84、28.00;而大肠菌群的多样性指数、均匀度和丰富度较低,其中,回肠菌群的多样性指标最低,分别为2.56、0.65和13.00。随着胃肠道部位按照由前往后顺序推移,菌群多样性呈现出高—低—高的趋势,这与前面DGGE图谱聚类分析结果一致。
对野生川金丝猴胃肠道DGGE图谱进行主成分分析后发现,菌群结构及组成不同的样品在主成分分析中的分布与DGGE图谱的聚类分析结果一致,见图 3。结果表明,主成分因子1和2的贡献率分别为42.90%和29.79%,共同将野生川金丝猴的胃肠道菌群区分为3个聚类。其中,胃、十二指肠和空肠的菌群聚类在一起,回肠、盲肠、结肠和直肠的菌群聚类在一起,而粪便菌群单独分离开来。这表明野生川金丝猴胃肠道相邻肠段的菌群结构及组成相似性高,而作为肠段末端的粪便样品与其他样品间存在一定差异。
在野生川金丝猴胃肠道菌群的PCR-DGGE图谱上共回收了18个条带(图 1箭头所指1~18),测序结果在NCBI上进行亲缘关系比对,结果如表 1所示。经鉴定,野生川金丝猴胃肠道细菌主要来自5个菌门,分别是变形菌门(Proteobacteria,38.89%)、厚壁菌门(Firmicutes,22.22%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,5.56%)、放线菌门(Actinobacteria,5.56%)、疣微菌门(Verrucomicrobia,5.56%)和不可培养菌(uncultured bacterium,22.22%)。其中,变形菌门和厚壁菌门分布于整个胃肠道,拟杆菌门和疣微菌门主要分布于胃、小肠和粪便,放线菌门则主要分布在胃和小肠。野生川金丝猴胃肠道中的变形菌门主要来自假单胞菌属(Pseudomonas)的4个菌种[Pseudomonas proteolytica、Pseudomonas cerasi、无花果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)和韦龙氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)]、埃希菌属(Escherichia)的2个菌种[费格森埃希菌(Escherichia fergusonii)和大肠埃希杆菌(Escherichia coli)]和志贺菌属(Shigella)的宋内志贺菌(Shigella sonnei);厚壁菌门主要是来自梭菌属(Clostridium)的煎盘梭菌(Clostridium sartagoforme)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)的扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)、梭杆菌属(Fusobacterium)的普氏梭杆菌(Flavonifractor plautii)和肠球菌属(Enterococcus)的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。并且,与维持消化道黏膜屏障功能和防止肥胖相关代谢的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)在胃、小肠、回肠和粪便中均有检测到。更重要的是,条带测序结果分析表明,在野生川金丝猴整个胃肠道中均检测到不可培养菌,说明其胃肠道中存在大量未被检测和鉴定的细菌种类。野生川金丝猴胃肠道菌群的系统进化树(图 4)表明,在4个不可培养菌中,仅条带4与已鉴定的粪肠球菌进化分类相似,说明条带4所代表的细菌可能是来自厚壁菌门的1株肠球菌;而其他不可培养菌与已知的菌种进化分支差异较大,这些菌种还需要进行深入的鉴定分析,同样说明在野生川金丝猴的胃肠道中有大量的菌群信息未被鉴定。
野生动物是地球生物圈中宝贵的生物资源,近40年全球野生动物数量减少了1/2[11],其种群数量的下降不仅会加速物种的灭绝,并且会导致人畜共患疾病发生趋势的上升[12]。研究表明,微生物的稳态平衡及多样性促进宿主健康生长[13]。健康状态、环境、宿主基因型、饮食和性别不仅影响动物机体的生理功能,而且影响动物胃肠道菌群的结构及组成。尽管野生动物因保护特性而难以获得其胃肠道样品,但随着人们对野生动物种群保护的重视,死亡野生动物胃肠道菌群信息已被陆续报道[3, 8],这为其生存和保护提供了重要的基础资料。同样,本研究运用PCR-DGGE指纹图谱技术首次分析了1只死亡野生川金丝猴胃、小肠、大肠和粪便菌群的多样性,并对图谱中主要条带进行克隆测序及系统进化树分析,结果发现其胃肠道中栖息着大量菌群,不同肠段的菌群多样性有差异,且DGGE条带克隆测序鉴定出的菌群主要来自变形菌门,这些结果丰富了野生川金丝猴胃肠道菌群信息。
本研究中,PCR-DGGE指纹图谱技术在分子水平上快速和直观地反映了野生川金丝猴胃肠道菌群的结构特点及多样性。图 1表明野生川金丝猴胃肠道中栖息着大量的菌群,且克隆测序鉴定出的菌群主要来自变形菌门(38.89%)、厚壁菌门(22.22%)、拟杆菌门(5.56%)、放线菌门(5.56%)和疣微菌门(5.56%)。其中,变形菌门和厚壁菌门分布于整个胃肠道,但变形菌门是优势菌群。而在刘燕等[8]的研究中,其采用16S rRNA的Illumina MiSeq测序技术检测了1只湖北神农架死于肺炎的半野生川金丝猴(雄性,20岁)部分肠段(十二指肠段、小肠段、盲肠段及大肠段)样品,其菌群种类与本研究相同,但其丰度与本研究差异较大,其主要菌群来自厚壁菌门。同样,有研究者对北京动物园1只死亡健康雌性川金丝猴胃内容物的宏基因测序分析发现优势菌群来自厚壁菌门[3]。产生这样的差异可能是因为研究的动物健康状态、环境、动物个体、性别、饮食及研究的方法均不同而导致。本研究是运用PCR-DGGE技术分析1只雌性可能死于心脏病的四川平武野生川金丝猴胃肠道菌群多样性。研究表明,变形菌门丰度的变化与动物健康状态密切相关,是导致动物个体间菌群结构及组成差异的主要菌群[14]。且已有研究表明心脏衰竭的人粪便中来自变形菌门的埃希菌属的数量显著增加[15]。同样,McKnney等[16]研究表明,健康恒河猴粪便菌群主要来自厚壁菌门,而患结肠炎恒河猴粪便中的优势菌群是弯曲菌属(来自变形菌门)。王剑等[17]的研究同样表明,健康川金丝猴粪便中有更多的双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)和乳酸菌(Lactobacillus spp.)等有益菌群,而腹泻川金丝猴的粪便中则出现较多的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和梭菌类群Ⅰ(Clostridium Ⅰ)等病原菌。Aivelo等[18]研究了来自71只赤色倭蜂猴的160份样品,结果提示性别影响动物肠道菌群结构及组成。尽管本研究中的野生川金丝猴与Zhou等[3]研究的川金丝猴性别均为雌性,但菌群信息仍然有差异,可能与研究的动物个体、胃肠道部位及研究方法均不同有关。与Zhou等[3]研究中使用的能一次并行对成千上万条DNA分子进行序列测定的高通量测序技术相比[19],本研究中的PCR-DGGE技术主要用于简单、快速和直观地体现菌群的丰度及多样性[10]。Zhou等[3]研究的是1只北京动物园圈养的川金丝猴,本试验研究的是1只野生川金丝猴,因此动物的生活环境和饮食均不同,而且有研究表明,圈养后的动物肠道菌群丢失严重[20]。尽管如此,本研究与刘燕等[8]和Zhou等[3]的研究用不同的微生物研究方法检测肠道菌群共同丰富了川金丝猴胃肠道菌群的信息。与本研究不同的是,在Yildirim等[21]的研究中,厚壁菌门是黑白疣猴、红疣猴和红尾猴粪便的主要菌群。同样,厚壁菌门也是猕猴[22]和叶猴[23]粪便菌群的优势菌群,这些结果与本研究结果不同,可能是因为动物品种和动物健康状态不同而引起的。
野生川金丝猴胃肠道DGGE图谱条带的聚类分析(图 1)和主成分分析(图 3)结果表明,来自胃、小肠的样品聚为一簇,来自大肠的样品聚为一簇,而来自粪便的样品单独聚为一簇。动物胃肠道各部位除了共有的特征菌群,也存在因其不同的微环境及与生理功能相适应的特异性菌群[24],因此粪便菌群的研究结果不能完全反映动物胃肠道中菌群结构及组成。胃是动物初次处理和消化食物的部位,也是消化吸收营养物质的重要器官。尽管川金丝猴的胃因囊腔膨大且胃壁菲薄而不利于食物的机械磨碎,但其分泌胃酸的幽门部处于低位而使得胃酸不会影响处于高位的胃体和胃底的共栖微生物,而最终有利于对纤维素的分解和利用[25]。川金丝猴是植食性灵长类动物,在其进化过程中有69.7%快速进化嗅觉基因可能与水果和植物等气味相关,且其胃中的厚壁菌门与碳水化合物代谢密切相关[3]。同样,在本研究中,厚壁菌门也是胃中的主要菌群,表明川金丝猴胃中菌群代谢与碳水化合物代谢有关。动物的小肠主要负责单糖代谢和氨基酸代谢,有利于变形菌门和乳杆菌目(Lactobacillales)细菌的生长[26]。而大肠主要代谢复杂多糖,主要菌群来自拟杆菌门和梭菌目(Clostridiales)[27]。川金丝猴的小肠长达255 cm,大肠长度约为182 cm。同样,本研究中DGGE图谱主要条带克隆测序结果表明,野生川金丝猴小肠菌群主要来自假单胞菌属的Pseudomonas proteolytica、Pseudomonas cerasi和无花果假单胞菌,埃希氏杆菌属的费格森埃希菌和大肠埃希菌,以及志贺菌属的宋内志贺菌,而这些菌属被报道是动物肠道或粪便中常见病原菌[28-29];而大肠中的主要菌群煎盘梭菌和粪肠球菌是动物消化道常见菌,尽管大多数粪肠球菌是有益菌,但含有基因Cassette(毒力岛的一部分)的粪肠球菌是致病性菌种,危害动物健康[30]。野生川金丝猴胃肠道中有病原菌的检出可能与动物的健康状态相关,本试验中的样品来自1只死于心脏病的野生老年川金丝猴,王剑等[17]和简平等[31]的研究均表明年龄和健康状态影响动物肠道菌群结构。
野生川金丝猴肠道菌群PCR-DGGE条带克隆测序结果显示其胃肠道中存在大量不可培养菌(表 1),且主要来自胃和小肠,说明其胃肠道中有大量菌群信息未被挖掘,这可能与川金丝猴动物本身的珍稀特性而使得对其胃肠道菌群的研究大多集中在易于采集的粪便样品有关。目前更新的菌群系统进化树结果显示,有大量不可培养菌与厚壁菌门聚类在一起[32]。同样,在本研究中,野生川金丝猴胃肠道DGGE条带的系统进化树也表明(图 4)不可培养菌大多来自厚壁菌门,主要是扭链瘤胃球菌、煎盘梭菌和粪肠球菌。赵晗旭等[33]研究表明,厚壁菌门是6种野生动物的肠道优势菌群,瘤胃球菌属是单胃草食动物(袋鼠和大象)和反刍动物(长颈鹿和羊驼)肠道的差异菌群,该菌属在前者数量高于后者。同样,本研究结果显示厚壁菌门分布于野生川金丝猴整个胃肠道。因此,对厚壁菌门,特别是对瘤胃球菌属和粪肠球菌的研究可作为今后川金丝猴胃肠道菌群研究的重点关注方向。本试验运用PCR-DGGE技术首次分析了1只死于心脏病的老龄野生川金丝猴胃肠道菌群的多样性,其胃肠道菌群结构及组成代表了老龄死亡野生川金丝猴胃肠道的菌群特点,极大丰富了野生川金丝猴胃肠道菌群的信息。今后可借助宏基因组学技术对其菌群组成和功能进行深入分析,为野生川金丝猴的健康生长及种群保护提供指导。
4 结论本试验运用PCR-DGGE技术分析了1只老龄死亡野生川金丝猴胃肠道菌群多样性,获得了与其健康状态、性别、年龄和研究方法相适应的菌群特点,其菌群多样性随着胃肠道由前至后的顺序呈现高—低—高的趋势,且胃肠道菌群以变形菌门(38.89%)和厚壁菌门(22.22%)为主,但胃肠道中仍有大量不可培养菌(22.22%)有待深入研究。
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