2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. Institute of Animal Science and Veterinary, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193, China
葡萄原花青素是葡萄果实中含有的酚类物质,其籽中含量较多[1-3]。它具有抗氧化[4-5]、清除自由基[6]、抗辐射和抗应激[7-8]等生物学作用。其在反刍动物及猪饲养中的添加试验国内外均有报道[9-18]。国内葡萄籽原花青素对奶牛生产性能方面的影响研究和对羊瘤胃发酵试验报道较多[9-14],而对奶牛瘤胃发酵及微生物区系影响的系统研究报道较少,有必要继续深入此方面的研究。
目前,通过添加植物皂苷类物质来改善家畜生产性能有着广阔的应用前景,尤其在调控奶牛瘤胃发酵等方面,成为当今研究的热点[19-21]。吴建敏等[9]研究报道,用葡萄渣代替部分玉米、麸皮和豆粕,或者添加适当比例的葡萄籽粕饲喂奶牛[10],对产奶性能、乳品品质和日产效益均没有不良影响,且有利于乳脂率和生产效益的改善。Gessner等[11]用葡萄籽粕替代等比例的苜蓿干草饲喂奶牛提高了奶牛的产奶量和乳脂率,还能降低体细胞数。孙占鹏等[12]研究发现,饲喂成年羊葡萄渣,羊生产性能和饲料转化效率均有显著改善。赵栋等[13]研究表明,添加葡萄渣能够提高绵羊的氮表观消化率和留存率,能提高绵羊瘤胃液丙酸含量、降低丁酸和乙酸/丙酸对瘤胃液pH的影响。李会菊等[14]在饲粮中添加不同水平的葡萄渣和葡萄籽对成年小尾寒羊平均日增重、粗蛋白质和能量的表观消化率效果尤为显著。同时,大量的研究报道发现,葡萄籽原花青素还对断奶仔猪的生产性能、肠道消化酶活性[15]、免疫力[16]、抗氧化能力[17]、繁殖性能[18]等方面均有改善。
综合来看,目前关于葡萄籽原花青素调控奶牛体外发酵模式的报道较少,尤其是对奶牛瘤胃发酵参数及微生物区系的影响。因此,本试验旨在通过体外法研究葡萄籽原花青素对奶牛瘤胃发酵参数及微生物区系的影响,为葡萄籽原花青素作为调控奶牛瘤胃发酵添加剂应用于生产实践提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料发酵底物:北京某奶牛养殖场精粗比为40:60的全混合日粮(TMR),干物质(DM)含量为54.80%,粗蛋白质(CP)含量为15.68%,中性洗涤纤维(NDF)含量为39.80%,经烘干粉碎过40目筛,其组成及营养水平见表 1。
葡萄籽原花青素:购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司,含花青素单聚体18.4%,二聚体20.4%,三聚体15.2%,四聚体14.1%,低聚体(5~13个单位)28.5%,酚醛类物质4.3%。
缓冲液:试验所用缓冲液按照Menke等[19]的方法配制而成,配制后持续通入CO2并于39 ℃水浴中保存备用。
瘤胃液:选用4头健康荷斯坦瘘管奶牛,其饲粮精粗比为40:60(羊草700 g/kg和精料补充料300 g/kg),晨饲前取瘤胃内容物,混合后在39 ℃水浴环境中经4层纱布过滤,装于保温瓶迅速带回实验室,操作应在尽量短的时间内完成[21]。
1.2 试验设计本试验采用单因素6水平试验设计,将500 mg发酵底物置于150 mL厌氧发酵瓶中,各组葡萄籽原花青素的添加量分别为0(对照)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg,每组6个重复。接种时迅速将每个瓶中加入预热的缓冲液50 mL和经4层纱布过滤的新鲜瘤胃液25 mL,向瓶中持续通入CO2 5 s后,立即加上瓶塞,并将每个发酵瓶与产气装置的每个传感器相连接[22],于39 ℃下连续培养24 h,试验重复3次。
1.3 样品采集和测定分析 1.3.1 发酵液样品采集与处理待培养管在体外培养24 h后,将培养管取出放入冰水浴中使发酵停止。将培养管中的发酵液取出,放入至已知质量的50 mL塑料离心管,立即测定发酵液的pH。发酵液在5 000×g离心10 min,取上清液用于氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和挥发性脂肪酸(VFA)含量的测定,具体操作按照严淑红等[24]的方法。
1.3.2 产气量和甲烷产量使用沈英等[24]研制的AGRS-Ⅲ微生物发酵微量产气自动记录仪测定24 h产气量。收集发酵24 h后的气体,使用安捷伦7890B型号气相色谱仪测定甲烷产量,色谱仪条件为:TCD检测器,载气为氢气,流量28 mL/min,PorapakQ填充柱,检测器温度100 ℃,进样口温度150 ℃,柱温38 ℃,进样量1 mL。
1.3.3 总DNA提取和细菌相对定量通过珠磨-十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取发酵液总DNA[25]。实时定量PCR的引物参照文献[23]的报道,引物序列见表 2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂建立20 μL反应体系及反应条件[26],每个样品3个重复。根据qRT-PCR测得的阈值循环(Ct)和以下公式将目标菌含量表示为相对于瘤胃总菌16S rDNA的百分比:
数据用SPSS 17.0软件中的one-way ANOVE程序进行单因素方差分析,采用Duncan氏法进行平均值的多重比较。显著性评判标准为P < 0.05。
2 结果 2.1 葡萄籽原花青素对发酵液瘤胃发酵参数的影响如表 3所示,与对照组相比,添加不同水平的葡萄籽原花青素均显著提高了发酵液pH(P < 0.05),其中以0.3 g/kg组的值最高(pH=6.3)(P < 0.05)。发酵液氨态氮含量的变化范围为37.29~47.43 mg/dL,0.2 g/kg组的值最低,显著低于对照组(P < 0.05),0.4 g/kg组的值最高,显著高于对照组(P < 0.05)。与对照组相比,0.2 g/kg组显著降低了甲烷产量(P < 0.05);0.3 g/kg组显著降低了产气量(P < 0.05)。各组发酵液微生物蛋白含量没有显著差异(P > 0.05)。
如表 4所示,与对照组相比,添加不同水平的葡萄籽原花青素对发酵液总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、戊酸含量及乙酸/丙酸均无显著影响(P > 0.05)。添加0.4和0.5 g/kg的葡萄籽原花青素显著降低了发酵液丁酸和异戊酸的含量(P < 0.05)。添加0.2 g/kg的葡萄籽原花青素显著提高了发酵液异丁酸含量(P < 0.05)。
如表 5所示,与对照组相比,0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg组显著降低了发酵液原虫、溶纤维丁酸弧菌含量(P < 0.05),0.1、0.2、0.4、0.5 g/kg组显著降低了发酵液甲烷菌含量(P < 0.05),0.3、0.4、0.5 g/kg组显著提高了发酵液真菌含量(P < 0.05),0.1、0.3、0.4、0.5 g/kg组显著降低了发酵液产琥珀酸丝状杆菌含量(P < 0.05)。各组发酵液黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的含量没有显著差异(P > 0.05)。
氨态氮是反刍动物瘤胃消化代谢的重要产物,同时也是大部分微生物合成菌体蛋白的原料,其含量直接反映了瘤胃内环境的发酵情况。在本试验中,适量添加葡萄籽原花青素能够显著降低发酵液氨态氮的含量。据报道,瘤胃液氨态氮含量如果过高,则会经瘤胃吸收进入血液,加重机体对氮的代谢负担[27],不仅造成氮源的浪费,动物还易发生氨中毒。在本试验中,葡萄籽原花青素添加水平为0.2 g/kg时,显著降低了发酵液氨态氮的含量。若含氮物质供应不足,则微生物生长受阻,动物的生产性能降低;而此时,微生物蛋白的含量也达到最低值。氨态氮含量与微生物蛋白含量密切相关[28]。米热古丽·伊马木等[29]报道,通过体外培养法,添加葡萄籽精油可降低发酵液氨态氮含量。李冲等[30]研究发现,饲喂葡萄渣可显著减低羔羊的瘤胃液氨态氮含量。李成云等[31-32]的研究发现,在体外试验中添加富含缩合单宁的物质能够降低发酵液中的微生物蛋白含量。Wang等[33]研究表明,在反刍动物饲粮中添加富含缩合单宁物质能够显著降低瘤胃中蛋白质的降解。潘发明等[34]研究表明,饲粮中的单宁含量越高越则对微生物蛋白的抑制作用就越明显。有研究报道,体外发酵液NH3-N含量与产气量存在高度正相关(r > 0.99)[35],与本试验的研究结果一致,添加不同水平的葡萄籽原花青素不仅降低了发酵液氨态氮的含量,而对产气量具有抑制作用。邸凌峰等[36]研究发现,单宁含量与产气量呈负相关。李晓鹏[37]在缩合单宁对体外瘤胃发酵影响的研究中得出,单宁破坏了瘤胃中部分细菌的膜,使细菌不能正常繁殖,同时阻止了酶与底物的结合,最终影响瘤胃发酵,导致产气量降低。
3.2 葡萄籽原花青素对发酵液挥发性脂肪酸含量的影响在反刍动物中VFA作为能量的主要来源,其含量及组成比例直接反映了瘤胃代谢活动水平。瘤胃发酵过程中所产生的VFA,主要以乙酸、丙酸、丁酸为主,占TVFA的95%左右,同时,发酵产生VFA的过程中有能量释放生成ATP,可被微生物作为能源用于微生物蛋白的合成[38]。本试验中,发酵液TVFA以及乙酸/丙酸在各组间没有显著差异,但是随着葡萄籽原花青素添加水平的增加,对丁酸的生成具有显著抑制作用,这与吕忠雷[39]、米热古丽·伊马木等[29]、赵栋等[13]的研究结果相一致。本试验发现,葡萄籽原花青素对发酵液异丁酸含量也有显著的影响。本试验中,发酵液pH在6.22~6.31,均在正常范围内[38],对瘤胃微生物的生长无不良影响。该研究结果与李晓鹏[37]和李成云[32]的研究结果相似,在体外发酵试验中,添加富含缩合单宁物质能够提高发酵液pH。由此可见,葡萄籽原花青素可改变体外瘤胃发酵模式。
3.3 葡萄籽原花青素对发酵液微生物含量的影响本试验中,葡萄籽原花青素显著降低了发酵液原虫及甲烷菌的含量。据报道,原虫在瘤胃中主要以细菌、真菌等为主要捕食对象,其代谢过程中会产生大量的甲烷,与甲烷菌存在共生关系[40]。因此,有文献报道指出可以通过驱除原虫来减少甲烷菌,进而降低甲烷的排放量[41]。王慧玲[42]在体外试验中添加单宁酸及Anantasook等[43]在饲粮添加缩合单宁均发现显著降低了瘤胃内的原虫的数量,与本试验结果一致,可能是因为破坏了某种原虫的生活环境或者是直接作用于原虫,从而导致原虫数量的降低。据报道,原虫为甲烷菌提供生长物质,而甲烷菌又含有与甲烷生成相关的辅酶[44]。本试验结果表明,添加葡萄籽原花青素后显著降低了发酵液甲烷菌的含量,这与赵薇[45]的研究结果一致。瘤胃中甲烷的产生大部分是甲烷菌的直接作用结果,因此减少甲烷菌对于甲烷减排具有重要作用。
在反刍动物瘤胃微生物降解纤维素的作用中真菌和细菌占主要地位。Wood等[46]通过体外研究表明,瘤胃内的真菌对纤维素的降解具有促进作用。袁英良[47]研究发现,在体外试验中添加单宁酸能够显著增加瘤胃内真菌的数量。这与本试验研究结果相似,通过添加葡萄籽原花青素能够显著提高发酵液真菌的含量。研究发现,瘤胃真菌分泌的纤维素分解酶的活性较高,但是真菌的繁殖速度较慢,所以细菌占主导地位[48]。瘤胃细菌主要包括溶纤维丁酸弧菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌。溶纤维丁酸弧菌是一种厌氧革兰氏阳性菌,对于瘤胃内蛋白质的降解具有重要作用。因其具有蛋白质降解酶的活性,当饲粮中含有抗性蛋白质则酶的活性则被抑制。本试验结果表明,葡萄籽原花青素显著降低了溶纤维丁酸弧菌的含量,这与赵薇[45]研究结果一致,可能是由于葡萄籽原花青素里的缩合单宁是一种植物性的抗性蛋白质,同时也可能是因为缩合单宁与饲粮中的蛋白质结合形成了复合物,最终导致溶纤维丁酸弧菌的含量降低。
产琥珀酸丝状杆菌为一种革兰氏阴性菌,其纤维素分解活性较高[44]。在纯培养的条件下,产琥珀酸丝状杆菌降解能力较强,如能降解结构性坚韧物质,还能降解部分黄色瘤胃球菌不能降解的纤维素,且产琥珀酸丝状杆菌对抗生素具有很强的耐受能力[49]。本试验中,葡萄籽原花青素显著降低了发酵液产琥珀酸丝状杆菌的含量。王川[50]报道缩合单宁对产琥珀酸丝状杆菌的细胞内源酶和外源酶均具有强烈的抑制作用,所以减少了产琥珀酸丝状杆菌的数量,与本试验的研究结果一致。
反刍动物瘤胃内的瘤胃球菌主要有黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌,在纤维素分解中起主要作用。黄色瘤胃球菌与白色瘤胃球菌之间既有协同作用也有抑制作用,白色瘤胃球菌可产生多种细菌素,并且所产生的这些细菌素对黄色瘤胃球菌的生长具有抑制作用[51]。李大彪等[52]研究发现,饲粮中添加单宁可显著降低山羊瘤胃液白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌含量。然而,本试验添加葡萄籽原花对发酵液黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌菌没有显著的影响,这可能由于体内复杂的瘤胃内环境与体外试验条件的差异所致。
4 结论① 葡萄籽原花青素可提高发酵液pH,但均在正常生理范围之内;适宜添加水平的葡萄籽原花青素可降低发酵液NH3-N含量、提高发酵液异丁酸含量、降低产气量和甲烷产量,超过0.2 g/kg时会促进NH3-N的释放及抑制丁酸和异戊酸生成;葡萄籽原花青素对发酵液总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、戊酸含量及乙酸/丙酸均无显著影响。
② 葡萄籽原花青素可降低发酵液中原虫、甲烷菌、溶纤维丁酸弧菌和产琥珀酸丝状杆菌含量;葡萄籽原花青素对发酵液黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌无显著影响。
③ 综合认为,在奶牛瘤胃体外发酵条件下,葡萄籽原花青素的适宜添加水平为0.2 g/kg。
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