当机体遭受体内外各种有害刺激时，由于机体内氧化系统与抗氧化系统平衡失调，机体内活性氧(ROS)会大量聚集，使组织细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物，从而引起细胞的氧化损伤。研究发现氧化损伤可引起动物严重的生精障碍，导致睾丸组织发生明显的病理变化，睾丸指数和精子数下降，精子畸形率升高，造成雄性动物不育^[1-2]。白藜芦醇(RES)是一种广泛存在于葡萄、花生、虎杖、决明、藜芦等植物性食物中的天然多酚类物质，具有很广泛的生物学活性，在治疗氧化损伤、炎症、过敏、肿瘤、心血管疾病等方面都得以应用^[3-4]。目前，RES在畜禽生产中也被广泛应用，它能提高畜禽的生产性能、改善畜禽酮体品质和肉品质、提高畜禽免疫力和抗氧化能力^[5]。高糖高胆固醇饮食可导致小鼠睾丸间质细胞的睾酮合成能力受损，添加RES能够通过减轻其氧化应激，并通过激活沉默调节蛋白1(SIRT1)及影响下丘脑-垂体-性腺轴的调控发挥保护作用^[6]。成海建等^[7]研究发现RES可通过激活SIRT1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路促进牛皮下脂肪细胞的凋亡。周曦等^[8]研究发现RES可能通过调控SIRTl/解偶联蛋白2(UCP-2)信号通路抑制血管内皮细胞氧化应激损伤。SIRT1具有去乙酰化酶活性，通过对组蛋白、多种转录因子、转录共调控因子的翻译后修饰(去乙酰化)，可调节与氧化应激、凋亡、炎症反应相关基因和蛋白质的转录^[9]。UCP2作为解偶联蛋白，能影响线粒体的跨膜电位，当线粒体内膜电势升高时，UCP2能够降低细胞膜内外氢离子(H⁺)浓度，促进氧消耗，从而抑制ROS的产生^[10]。目前，虽已明确RES的抗氧化作用效果，但对于其具体的作用机制尚未完全明确。因此，本研究以小鼠睾丸间质细胞TM3为研究对象，在过氧化氢(H₂O₂)诱导的氧化应激状态下研究RES对氧化损伤细胞的治疗作用，并阐明其可能的作用机制，以期为防治由氧化损伤引起的雄性生殖系统疾病提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

小鼠睾丸间质细胞TM3细胞株由中国科学院上海细胞库提供；RES、H₂O₂、羊抗-UCP2多克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗羊免疫球蛋白G(IgG)购自美国Sigma公司；兔抗-SIRT1多克隆抗体和兔抗-β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体购自英国Abcam公司；HRP标记驴抗兔IgG购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；Trizol购自美国Life Technologies公司；HiScript^® Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒、ChamQTM SYBR^® qPCR Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；二辛可酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；ROS检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；放射免疫沉淀测定(RIPA)细胞裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM/F12培养基购美国Hyclone公司。

1.2 试验方法 1.2.1 细胞培养

小鼠睾丸间质细胞TM3细胞株用DMEM/F12培养基(添加10%的胎牛血清和1%青-链霉素)，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养。每天更换培养基，待细胞长至对数生长期即汇合度达到80%~90%时，使用胰酶消化制备细胞悬液。

1.2.2 iCELLigence细胞功能分析仪监测细胞增殖情况

将细胞消化离心后，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞并计数，制备成密度为2.5×10⁴个/mL的细胞悬液待用。在E-Plate L8板中加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基(150 μL/孔)，放入iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪(Roche，德国)，在仪器配备的iPad软件中，选择增殖试验，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基自动调零。随后取出E-Plate L8板，每孔加入细胞悬液300 μL，每组设置3个重复孔，待细胞静置30 min后将E-Plate L8板重新放置于iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪内，点击开始进行实时监测。具体操作过程中：1)在确定建立氧化损伤细胞模型的适宜H₂O₂浓度的试验中，待细胞生长曲线进入对数期后(即在培养板中培养24 h后)，将E-Plate L8取出，轻轻吸出100 μL培养基，再加入100 μL含不同浓度H₂O₂的培养基，使终浓度分别0(正常对照组)、150、200、250和300 μmol/L，轻轻混匀后再将E-Plate L8板置于分析仪中，继续监测8 h，此过程共监测32 h。2)在确定RES安全浓度的试验中，待细胞生长曲线进入对数期后(即在培养板中培养24 h后)，将E-Plate L8取出，分别采用0(正常对照组)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES处理，继续监测24 h，此过程共监测48 h。3)在RES干预处理氧化损伤细胞的试验中，待细胞生长曲线进入对数期后(即在培养板中培养24 h后)，先将细胞用150 μmol/L的H₂O₂处理8 h，再分别用0(H₂O₂组)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES处理，同时设未经H₂O₂和RES处理的正常对照组，继续监测24 h，此过程共监测56 h。设置iCELLigence系统每隔15 min实时监测细胞增殖情况，制作增殖曲线，不同曲线可反映不同处理条件下细胞实时增殖情况，细胞增殖情况用增殖指数(proliferation index，PI)表示。在监测结束时测定各个培养板中细胞的存活率。

1.2.3 2′, 7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测细胞中ROS含量

待RES(5.0 μmol/L)处理氧化损伤细胞结束后，按照ROS检测试剂盒说明书测定细胞中ROS含量，具体操作如下：去掉培养上清液，加入含10 μmol/L DCFH-DA探针的新鲜培养基，37 ℃孵育细胞40 min，用胰酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗1次，离心留细胞沉淀，用PBS重悬细胞，调整细胞密度为6×10⁵个/mL，使用荧光酶标仪在激发波长为485 nm、发射波长为525 nm处检测荧光强度。DCFH-DA本身没有荧光，当其进入细胞后被酯酶水解为DCFH，而DCFH可被细胞内的ROS氧化为强绿色荧光物质DCF，因此，其荧光强度与细胞内ROS的含量成正比，可用荧光强度表示ROS含量。

1.2.4 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)检测细胞中SIRT1和UCP2的mRNA相对表达量

待RES(5.0 μmol/L)处理氧化损伤细胞结束后，采用Trizol法提取细胞的总RNA，并用NanoDrop 2000测定总RNA的浓度和纯度。总RNA产物经HiScript^® Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒反转录后，得到cDNA作为模板用于qPCR。在ABI Step One荧光定量PCR仪上，使用ChamQTM SYBR^® qPCR Master Mix试剂盒进行RT-qPCR。反应体系：2 ChamQTM SYBR^® qPCR Master Mix 10 μL、上游引物0.4 μL(10 μmol/L)、下游引物0.4 μL(10 μmol/L)、50 ROX 0.4 μL、cDNA 2.0 μL、双蒸水(ddH₂O)6.8 μL，总体积为20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。熔解曲线反应条件：95 ℃，变性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃变性15 s。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，采用2^-△△Ct法计算目的基因的mRNA相对表达量，对照组基因的mRNA相对表达量设定为1。所用引物由华大基因股份有限公司设计合成，引物序列见表 1。

1.2.5 蛋白质印迹(Western-blot)法检测细胞中SIRT1和UCP2的蛋白质相对表达量

待RES处理氧化损伤细胞结束后，弃掉培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入200 μL RIPA细胞裂解液(含1% PMSF)，吹打均匀，冰上放置30 min，期间剧烈振荡3次，每次30 s，将细胞裂解液置于4 ℃，12 000 r/min离心10 min后吸取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质浓度的测定。取适量蛋白质样品用5 Loading Buffer混匀，100 ℃水浴中煮5 min使蛋白质变性。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，每孔上样量为30 μg，然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用0.2%明胶室温摇床封闭1 h，分别加入不同的一抗4 ℃孵育过夜；用三羟甲基氨基甲烷吐温(TBST)洗膜3次，每次10 min；加入相对应的HRP标记二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后用ECL化学发光液进行显色，于ChemiDoc^TM XRS⁺成像系统中检测蛋白质条带并用Quantity One软件分析条带的密度值和表达量，以β-actin为内参。

1.3 数据统计分析

试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0统计分析软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行方差分析，采用LSD法进行两两比较。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 H₂O₂对TM3细胞增殖的影响

不同浓度H₂O₂处理TM3细胞8 h后，根据iCELLigence细胞功能分析仪实时监测结果(图 1)可知，与正常对照组相比，各浓度H₂O₂组的细胞存活率均极显著下降(P < 0.01)，且呈浓度依赖。其中用150 μmol/L的H₂O₂处理时细胞存活率下降至75%左右，达到预计的损伤效果。因此，在后续试验中选用150 μmoL/L的H₂O₂处理细胞8 h构建本试验中所需的氧化损伤细胞模型。

2.2 RES对TM3细胞增殖的影响

为研究RES对H₂O₂致TM3细胞氧化损伤的作用效果，首先检测了RES对TM3细胞增殖的影响，由图 2可知，用浓度分别为2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES处理正常细胞24 h后，各浓度RES组与正常对照组的细胞存活率无显著差异(P>0.05)。由图 3可知，当用RES处理氧化损伤细胞24 h后，与H₂O₂组(仅经H₂O₂单独处理，未经RES处理的氧化损伤细胞)相比，各浓度RES组的细胞存活率均显著提高(P < 0.05)，但仍无法恢复到正常对照组水平，且各浓度RES组间无显著差异(P>0.05)，因此，后续试验中选取浓度为5 μmol/L的RES对氧化损伤TM3细胞进行处理。

2.3 RES对氧化损伤TM3细胞中ROS含量的影响

由图 4可知，正常细胞经H₂O₂的处理后，细胞内相对荧光强度极显著增强(P < 0.01)，即表明细胞中ROS含量显著升高；而氧化损伤细胞经RES处理后，细胞内相对荧光强度极显著下降(P < 0.01)，但仍无法恢复至正常对照组的水平。这说明RES能够在一定程度上抑制氧化损伤TM3细胞中ROS的产生。

2.4 RES对氧化损伤TM3细胞中SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白质相对表达量的影响

由图 5-A可知，正常细胞经H₂O₂的处理后，细胞中SIRT1 mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01)，UCP2 mRNA相对表达量极显著增加(P < 0.01)。而氧化损伤细胞经RES处理后，细胞中SIRT1 mRNA相对表达量极显著增加(P < 0.01)，UCP2 mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01)。由图 5-B可知，细胞中SIRT1和UCP2蛋白质相对表达量的变化趋势与其mRNA相对表达量变化趋势一致，即H₂O₂处理导致SIRT1蛋白质相对表达量极显著降低(P < 0.01)，而使UCP2蛋白质相对表达量表达极显著增加(P < 0.01)；RES处理可极显著提高氧化损伤细胞中SIRT1蛋白质相对表达量(P < 0.01)，显著降低UCP2蛋白质相对表达量(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 H₂O₂诱导TM3细胞氧化损伤模型的建立

目前，在细胞氧化损伤模型的建立中，多以H₂O₂作为诱导剂，不同类型的细胞对诱导剂的敏感性不一样，因此诱导剂的浓度和处理时间非常关键^[11-12]。当诱导剂浓度过高或处理时间过长时会导致细胞损伤太严重，不利于抗氧化机制的研究；而当损伤程度太弱时，细胞可能通过自身修复影响相关的研究。对于细胞氧化损伤模型，一般通过噻唑蓝(MTT)法检测，根据其吸光度值来判断细胞增殖情况从而确定氧化损伤程度，MTT法虽然有其优势，如重复性较好、特异性强等，但每次只能确定1个时间点细胞的增殖情况。本试验中采用iCELLigence细胞功能分析仪实时监测，可更直观地判断细胞的增殖情况，而且监测过程中不需要特殊试剂，可减少因多次操作所导致的误差。本试验中，通过iCELLigence细胞功能分析仪实时监测，发现150 μmol/L的H₂O₂处理细胞8 h，细胞存活率下降至75%左右，符合后续抗氧化损伤试验的要求，因此确定采用150 μmol/L的H₂O₂建立细胞氧化损伤模型。

3.2 RES对氧化损伤细胞的保护作用

研究表明，动物体中90%的ROS源于线粒体电子呼吸传递链，ROS的产生与线粒体能量代谢紧密相关，当ROS含量增加时，会对线粒体的结构、功能造成损伤，而线粒体受到损伤后又会促进ROS的生成，如此恶性循环，加重氧化损伤程度^[13-14]。解偶联蛋白(UCPs)是位于线粒体内膜上的一类转运蛋白，它们可以介导线粒体内膜的“质子漏”使能量以热的形式散失^[15]。UCP2作为UCPs家族成员之一，是UCPs在生殖系统中的主要存在形式^[16-17]。大量试验表明，UCP2可以调控ROS的生成，并参与多种组织的抗氧化损伤作用。Brand^[18]提出了UCP2对ROS的负调控假设模型，当ROS含量增加时，过氧化物在化学转化过程中产生的某种物质激活UCP2的质子漏活性，导致线粒体膜电位的下降，UCP2就以一种负反馈调节的方式来限制ROS的生成，表明在氧化应激过程中，UCP2可以通过降低ROS的生成量保护机体免受过氧化损伤。同样的结论在Zhang等^[19]、王晓娜等^[20]的试验中也得到证实。Zhang等^[19]的试验表明，高温诱导的凋亡能引起小鼠睾丸内ROS含量增加，UCP2蛋白质表达量也随之增加；王晓娜等^[20]试验发现，精子内UCP2蛋白质的表达量与过氧化氢的作用浓度呈正相关，UCP2为了对抗增加的ROS，表达量也随之增加。SIRT1作为一种核蛋白，能够以转录的形式抑制UCP2的转录活性，通过与UCP2启动子结合，抑制UCP2基因的表达，减少其编码的线粒体内膜蛋白的生成，从而抑制线粒体中解偶联反应的发生^[21]。相关研究表明，经不同药物诱导的大鼠或小鼠氧化应激模型中，SIRT1都表现出低表达状态，而SIRT1一经激活，可导致UCP2的表达下降^{[8, 22-23]}。结合以上信息推测，在本试验中，RES通过对SIRT1/UCP2信号通路的调节发挥对氧化损伤小鼠睾丸间质细胞TM3的保护作用。

本试验结果显示，与正常对照组相比，H₂O₂组细胞中ROS含量极显著增加，SIRT1 mRNA及蛋白质的相对表达量均极显著降低，而UCP2 mRNA及蛋白质的相对表达量极显著升高，提示细胞被H₂O₂损伤后细胞中SIRT1含量的降低可能诱导UCP2含量的增加，以抵抗细胞中增加的ROS。UCP2生成量增加，解偶联线粒体内氧化磷酸化过程，减少ATP的生成，ROS的生成量应该下降，但氧化应激在细胞中UCP2表达增强的情况下仍持续存在，推测可能是由于UCP2增加的量不足以抵抗ROS的过量产生。相比氧化损伤细胞，采用RES处理后由H₂O₂所致的SIRT1 mRNA及蛋白质表达的下调和UCP2 mRNA及蛋白质表达的上调均在一定程度上受到抑制，且细胞中ROS含量也极显著下降，提示RES作为SIRT1的激活剂，能够促进其表达。SIRT1被激活后，可抑制UCP2的表达，理论上应该会产生更多的ROS，但实际采用RES处理后氧化损伤细胞中ROS的含量相对未经RES处理的氧化损伤细胞而言是减少的，分析原因可能是UCP2对ROS存在负反馈调节，即UCP2表达被抑制后，细胞中ROS的含量增加，UCP2通过负反馈调节的方式限制ROS的产生。

此外，在本研究中发现，在正常TM3细胞中UCP2 mRNA的表达较丰富，而其蛋白质较难检测到，而经H₂O₂损伤后TM3细胞中UCP2蛋白质的相对表达量极显著增加。这种情况的出现可能与抗体的特异性有关；也可能是在生理状态下，某些器官中的UCP2 mRNA并不最终表达为蛋白质，而在病理状态下就可以启动UCP2 mRNA翻译为蛋白质。在Fisler等^[24]的研究中也在胰腺、脾脏、心脏、下丘脑、肺、睾丸、巨噬细胞等检测到大量的UCP2 mRNA，而用Western blot法仅在下丘脑、巨噬细胞、白色脂肪组织、脾脏、胰岛的实质细胞中检测到了UCP2蛋白质。

4 结论

SIRT1/UCP2信号通路介导了H₂O₂致TM3细胞的氧化损伤，RES通过活化SIRT1抑制UCP2表达，UCP2通过负反馈调节方式削弱氧化损伤细胞内ROS的生成，从而在一定程度上抑制TM3细胞的氧化损伤。