2. 中国农业大学动物科技学院, 北京 100193;
3. 华中农业大学动医动科学院, 武汉 430070;
4. 北京生物饲料添加剂重点实验室, 北京 100193
, ZHAO Jianfei2, WANG Shuai3, YU Haitao2, ZENG Xiangfang2, CHEN Hongyu2, QIAO Shiyan2,4
2. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
3. College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
4. Beijing Bio-Feed Additive Key Laboratory, Beijing 100193, China
抗生素被广泛用于动物生产已有60多年历史[1]。在大型养猪场和养鸡场，抗生素主要用于疾病的预防、治疗和促进生长。世界卫生组织(WHO)2012年报道，全球被用于食用动物生产的抗生素超过抗生素总量的50%，且其中90%用于促生长和提高饲料转化率，给畜禽养殖业带来了显著的经济效益。但是，由于抗生素在生产实际中存在不合理以及滥用等现象，加之长期使用造成了细菌对抗生素产生耐药性或不敏感性，细菌耐药性问题导致越来越多的抗生素疗效降低甚至无效，从而对畜禽、食品安全和人类公众健康构成重大威胁[2-3]。因此，寻找传统抗生素替代物用于动物生产是迫切需要解决的任务。
抗菌肽(antimicrobial peptide, AMPs)是生物体产生的一类具有生物活性的小分子多肽，广泛地存在于生物界，是重要的天然免疫和抗感染的宿主防御肽[4-5]。抗菌肽具有广谱抗菌活性，广泛地作用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒和原生动物。大多数抗菌肽通过破坏细菌细胞膜的完整性发挥抗菌活性，一些抗菌肽能够穿透细胞膜并与胞内不同的靶标结合抑制细菌生长，且不易产生耐药性，因此成为抗生素替代物研究的热点[6-7]。
Sublancin是美国马里兰大学Hansen研究团队从枯草芽孢杆菌168菌株的发酵液中分离得到一种具有抑菌活性的物质，它是由37个氨基酸组成并含有2个二硫键的阳离子肽，其性质极其稳定，可以耐受1.5~9.5的pH，还可以在高温环境中稳定存在[8-10]。Sublancin具有抗革兰氏阳性菌活性，其抗菌谱包括巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、产气夹膜梭菌等，对革兰氏阴性菌无明显抑菌效果[11-12]。Paik等[13]认为Sublancin通过作用于细菌细胞膜合成的特定分子，使细胞膜形成孔洞，从而发挥其抗菌活性。Kouwen等[14]的研究发现，Sublancin的抑菌活性与其对细菌膜机械敏感性离子通道有关，Sublancin可能通过抑制这种离子通道的关闭，使细菌细胞内物质快速溢出，从而使细菌裂解或死亡。Wang等[11]研究发现，Sublancin可能通过抑制细菌的能量代谢而抑制细菌的分裂。目前关于Sublancin的研究主要集中在其结构、表达调控、杀菌活性以及杀菌机制等方面。关于Sublancin作为饲料添加剂对肉鸡生长性能和养分利用的作用效果尚未完全阐明。因此，本试验以健康肉鸡和大肠杆菌感染肉鸡为模型，研究Sublancin对肉鸡生长性能、养分表观代谢率、氮沉积和盲肠菌群的影响，旨在为抗菌肽Sublancin作为动物生产中抗生素替代品提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 抗菌肽Sublancin的制备抗菌肽Sublancin由国家饲料工程技术研究中心构建1个新型重组质粒并将其转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W800中，获得高效表达的Sublancin，再通过AKTA纯化系统得到纯度高达99.6%的Sublancin冻干粉样品。其氨基酸序列为GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQN YRQFCR，分子质量约为3 879.8 u。通过抑菌活性检测冻干粉样品的活性单位，确定相应添加剂量。
1.2 试验设计与试验饲粮本试验选用1日龄健康爱拔益加(AA)肉公雏为试验动物，平均初始体重为(41.90±3.21) g。试验用基础饲粮为参照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制的玉米-豆粕型饲粮，其组成及营养水平见表 1。所有饲粮均为粉料。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis) |
试验1：将432只1日龄AA肉公雏随机分为4组，每组6个重复，每个重复18只鸡。对照组饲喂不含抗生素的基础饲粮，抗生素组饲喂基础饲粮+20 mg/kg硫酸黏杆菌素，低剂量抗菌肽组饲喂基础饲粮+150 mg/kg Sublancin，高剂量抗菌肽组饲喂基础饲粮+300 mg/kg Sublancin，试验期内肉鸡自由采食和饮水，试验持续42 d。整个饲养试验分为2个阶段，1~21 d为前期，22~42 d为后期。
试验2：将288只1日龄AA肉公雏随机分为3组，每组8个重复，每个重复12只鸡。对照组饲喂不含抗生素的基础饲粮，抗生素组饲喂基础饲粮+80 mg/kg金霉素，抗菌肽组饲喂基础饲粮+300 mg/kg Sublancin。Sublancin添加剂量依据试验1的结果。试验期内肉鸡自由采食和饮水，试验持续28 d，第22天进行大肠杆菌攻毒，即每只鸡灌服大肠杆菌K88菌悬液(109 CFU/mL)1 mL。
1.3 饲养管理试验鸡采用3层笼(90 cm×40 cm)平养，滴头式饮水器，自由采食和饮水，电脑控制温湿度，人工调节光照。试验前3 d室温控制在33 ℃，随后温度每周下降3 ℃直到24 ℃恒温。24 h光照，保持良好通风。所有肉仔鸡在试验第7天和第28天时接种新城疫疫苗，第14天和第21天时接种传染性法氏囊疫苗。试验于农业部饲料效价与安全监督检验测试中心(北京)畜禽试验基地进行，所有操作均按照中国农业大学动物福利的相关程序和要求执行。
1.4 样品采集与测定方法 1.4.1 试验1 1.4.1.1 生长性能的测定在试验第1天、第21天和第42天，对试验鸡只进行称重，并记录耗料量，用于计算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)和饲料转化率(feed conversion ratio，FCR)。
1.4.1.2 盲肠菌群的测定于试验第21天和第42天，每个重复随机抽取1只鸡，屠宰，取盲肠食糜，用纱布包好于-80 ℃速冻待测，所选鸡只体重见表 2。
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表 2 试验1与试验2用于盲肠菌群分析的肉鸡体重 Table 2 Body weight of broilers for cecal bacterial analysis in Exp.1 and Exp.2 |
将盲肠食糜在常温下解冻，混匀，无菌称取盲肠食糜样品0.5 g，溶解于4.5 mL无菌生理盐水中，充分混合，然后逐级稀释至10-7。选择10-3~10-7的稀释度，取0.1 mL稀释液接种到厌氧滚管中进行乳酸杆菌培养；选择10-2~10-4的稀释度，取0.2 mL稀释液于平板培养基中进行大肠杆菌培养；选择10-4~10-8的稀释度，取0.2 mL稀释液于平板培养基中进行总需氧菌培养。所有培养基置于37 ℃培养箱中，其中乳酸菌和大肠杆菌培养24 h，总需氧菌培养48 h后计数。每个稀释度设2个重复，选择30~300个菌落的平板或者滚管做计数用。
大肠杆菌的培养采用麦康凯琼脂培养基，培养基组成及pH如下：蛋白胨，20.0 g/L；乳糖，10.0 g/L；胆盐，5.0 g/L；氯化钠，5.0 g/L；中性红，0.075 g/L；琼脂，20.0 g/L；pH，7.4±0.2。乳酸杆菌的培养采用MRS琼脂培养基、总需氧菌的培养采用平板计数琼脂培养基，上述培养基均购自英国OXIDE公司。
1.4.2 试验2 1.4.2.1 生长性能的测定在试验第1天、第21天，对试验鸡只进行称重，并记录耗料量，用于计算ADFI、ADG和FCR。
1.4.2.2 养分表观代谢率与氮沉积的测定于试验第19~21天收集粪尿，将其混匀，称重，60 ℃烘48 h，粉碎至40目用于实验室常规养分分析。饲料和粪尿样品中的干物质和粗蛋白质含量依照AOAC(2006)的标准方法测定，总能采用氧弹式热量计(Parr 1281，美国)测定，进而计算各养分的表观代谢率。记录试验第19~21天的采食量，以及第19~21天的粪尿重，测定饲料和粪尿氮含量后计算氮沉积量和氮沉积率。
氮沉积量(g/d)=氮摄入量-粪尿氮排放量；
氮沉积率(%)=100×氮沉积量/氮摄入量。
1.4.2.3 盲肠菌群测定于试验第28天时，每个重复随机抽取1只鸡屠宰，取盲肠食糜，用纱布包好于-80 ℃速冻待测，鸡只体重见表 2。盲肠中乳酸杆菌、大肠杆菌的培养和计数方法同1.4.1.2。
1.5 统计分析数据采用SAS 9.2的一般线性模型(GLM)中的ANOVA方法进行分析，所有指标以重复为单位。若组间存在显著差异，则用Student-Newman-Keuls test多重比较进行检验。统计结果用平均值以及均值标准误(SEM)来表示，P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 试验1 2.1.1 生长性能由表 3可知，在试验前期(1~21 d)，与对照组相比，饲粮添加150和300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏杆菌素显著提高了肉鸡的ADG(P < 0.05)，并显著改善了FCR(P < 0.05)。抗生素组和抗菌肽组肉鸡的ADG和FCR没有显著差异(P>0.05)。在试验后期(22~42 d)，与对照组相比，饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin显著提高了肉鸡的ADG(P < 0.05)。与150 mg/kg Sublancin组和对照组相比，饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏杆菌素显著改善了FCR(P < 0.05)。整个试验期间(1~42 d)，与对照组相比，饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin显著提高了肉鸡的ADG(P < 0.05)，并显著改善了FCR(P < 0.05)。抗生素组和抗菌肽组肉鸡的ADG和FCR没有显著差异(P>0.05)。饲粮中添加抗菌肽Sublancin和抗生素硫酸黏杆菌素对任何阶段肉鸡的ADFI均无显著影响(P>0.05)。
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表 3 试验1：抗菌肽Sublancin对肉鸡生长性能的影响 Table 3 Effects of antimicrobial peptide Sublancin on growth performance of broilers in Exp.1 |
由表 4可知，与对照组相比，饲粮添加150和300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏杆菌素显著降低试验第21天和第42天肉鸡盲肠中大肠杆菌和总需氧菌的数量(P < 0.05)；但是，150和300 mg/kg Sublancin组之间上述指标不存在显著差异(P < 0.05)。与150 mg/kg Sublancin组相比，饲粮添加20 mg/kg抗生素硫酸黏杆菌素显著降低了试验第21天和第42天肉鸡盲肠中大肠杆菌和总需氧菌的数量(P < 0.05)。饲粮中添加抗菌肽Sublancin和抗生素硫酸黏杆菌素对试验第21天和第42天肉鸡盲肠中乳酸杆菌数量无显著影响(P>0.05)。
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表 4 试验1：抗菌肽Sublancin对肉鸡盲肠菌群的影响 Table 4 Effects of antimicrobial peptide Sublancin on cecal microbiota of broilers in Exp.1 |
由表 5可知，与对照组相比，饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素显著提高了肉鸡的ADG，并显著改善了FCR(P < 0.05)，但对肉鸡的ADFI没有显著影响(P>0.05)。抗菌肽组与抗生素组肉鸡的生长性能无显著差异(P>0.05)。
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表 5 试验2：抗菌肽Sublancin对肉鸡生长性能的影响 Table 5 Effects of antimicrobial peptide Sublancin on growth performance of broilers in Exp.2 |
由表 6可知，与对照组相比，饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素对干物质和能量表观代谢率没有显著影响(P>0.05)，但显著提高了粗蛋白质表观代谢率(P < 0.05)；抗菌肽组肉鸡的养分表观代谢率与抗生素组没有显著差异(P>0.05)。抗菌肽组肉鸡的氮沉积量显著高于对照组和抗生素组(P < 0.05)，达到8.49 g/d。与对照组相比，饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素显著提高了氮沉积率(P < 0.05)，但抗菌肽组与抗生素组之间没有显著差异(P>0.05)。
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表 6 试验2：抗菌肽Sublancin对肉鸡养分表观代谢率和氮沉积的影响 Table 6 Effects of antimicrobial peptide Sublancin on nutrient apparent metabolic rate and nitrogen retention of broilers in Exp.2 |
由表 7可知，与对照组相比，饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素显著降低了感染大肠杆菌K88肉鸡盲肠中大肠杆菌的数量(P < 0.05)；抗菌肽组感染大肠杆菌K88肉鸡盲肠中大肠杆菌数量与抗生素组无显著差异(P>0.05)。饲粮添加抗菌肽Sublancin和抗生素金霉素对感染大肠杆菌K88肉鸡盲肠中乳酸杆菌数量没有产生显著影响(P>0.05)。
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表 7 试验2：抗菌肽sublancin对感染大肠杆菌K88肉鸡盲肠菌群的影响 Table 7 Effects of antimicrobial peptide Sublancin on cecal microbiota of broilers after challenge with Escherichia coli K88 in Exp.2 |
由于抗生素耐药性问题日趋严重，关于抗生素替代品的研究显得越来越重要[15]。抗菌肽因其独有的生物学特性和抗菌机制，很有潜力替代抗生素，给临床医学、药学、食品加工、农业等领域带来革命性进展[16-18]。Bals等[19]研究显示，抗菌肽可促进动物生长，提高动物抗病能力。温刘发等[20]研究发现，在仔猪断奶料里添加抗菌肽，抗菌肽的抗腹泻效果与抗生素无显著差异，且适量的抗菌肽比抗生素的促生长效果好。陈晓生等[21]研究表明，在肉鸭饲粮中添加天蚕素AD-酵母制剂显著增强了血清代谢激素活动，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)浓度增高，营养物质合成加快；尿素氮浓度显著降低，体内氮排出减少，同时对免疫器官并未产生副作用。王广军等[22]的研究表明，在饲料中添加抗菌蛋白后，南美白对虾的日生长速度、相对增重率、饲料转化率、成活率和抗病力均有显著提高。由此可见，抗菌肽具有代替抗生素成为新型饲料添加剂的潜能。
本实验室前期研究发现抗菌肽Sublancin具有一定的体外和体内抑菌活性。给小鼠口服抗菌肽Sublancin后发现，抗菌肽Sublancin可以诱导卵清蛋白(OVA)免疫小鼠产生Th1和Th2混合型免疫反应，增强体液免疫和细胞免疫应答[23]。但是，目前关于抗菌肽Sublancin替代抗生素在肉鸡生产和疾病控制中的作用的报道较少。因此，本试验在已有研究工作基础上，以肉鸡为研究对象，进一步探讨抗菌肽Sublancin对其生长性能及肠道菌群的影响，基于以上研究结果再通过灌服大肠杆菌等应激措施，观察饲粮中添加抗菌肽Sublancin对肉鸡生长性能、养分利用以及肠道菌群的影响，旨在为抗菌肽Sublancin作为替代抗生素在饲料添加剂方面的应用提供理论依据。
硫酸黏杆菌素和金霉素曾长期作为促生长剂用于畜禽生产[17, 24]，并起到了良好的效果。但由于硫酸黏杆菌素导致细菌耐药性的产生，农业部发布公告禁止使用。所以很多研究学者开始寻找新的替代物，本试验选择硫酸黏杆菌素和金霉素作为阳性对照的目的是研究抗菌肽Sublancin能否作为新型添加剂替代硫酸黏杆菌素和金霉素用于畜禽生产。本试验结果发现，饲粮中添加抗菌肽Sublancin能够改善肉鸡的生长性能。这一结果与王万云等[25]和卢宇等[26]的研究结果一致，即肉鸡饲粮中添加抗菌肽可显著提高生产效率。此外，Choi等[27]的研究发现，在肉鸡饲粮中添加合成抗菌肽-p5提高了肉鸡的ADG和FCR。本试验中还发现，饲粮中添加抗菌肽Sublancin对肉鸡的ADFI无显著影响。这一结果与Bao等[28]和Ohh等[29]的研究结果一致。本试验中，饲粮中添加抗菌肽Sublancin和抗生素硫酸黏杆菌素与金霉素能够同等改善肉鸡的生长性能，这表明抗菌肽Sublancin有潜力作为肉鸡饲粮中抗生素的替代品。这一结果与Ohh等[29]和Choi等[27]的研究结果一致。抗生素的促生长机制包括抑制病原菌、降低亚临床病原菌的侵染以及通过调控微生物组成减少肠道菌群的营养竞争[16-17, 30]。在本研究中饲粮添加抗菌肽Sublancin提高了肉鸡的生长性能可能是由于提高了养分的吸收利用和减少肠道中有害微生物数量。
从试验1中我们发现饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin显著改善了肉鸡的生长性能。在进一步研究的试验2中我们发现饲粮添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin显著增加了肉鸡的氮沉积。Ohh等[29]和Choi等[27, 31]的研究均发现肉鸡饲粮中添加抗菌肽可提高氮沉积，进而改善生长性能。本试验中，饲粮中添加抗菌肽对干物质和能量的表观代谢率没有显著影响。这一结果与Ohh等[29]和Choi等[27, 31]所得结果相似。从盲肠菌群结果发现，在正常肉鸡饲粮中添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏杆菌素显著减少了盲肠中大肠杆菌的数量。在大肠杆菌K88攻毒条件下，饲粮中添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素显著减少了盲肠中大肠杆菌的数量，与Wu等[24]的研究结果相似。由此表明，抗菌肽Sublancin可能具有抑制肠道内有害细菌增殖的作用，从而提高肉鸡的抗感染能力。
除了直接的抗菌作用，抗菌肽还能通过抑制微生物增殖来间接调节免疫功能，包括免疫细胞的募集，从而调节炎症反应和降低感染的程度。本实验室前期研究发现，抗菌肽Sublancin通过降低肠道核因子-κB(NF-κB)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，减轻肠道损伤，减少金黄色葡萄球菌感染小鼠的死亡率[11, 30]。除此之外，本实验室前期研究还发现，抗菌肽Sublancin降低了小鼠回肠促炎因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平[30]。然而，关于抗菌肽Sublancin是否调控了宿主的免疫功能以及对宿主盲肠菌群的影响是否与免疫功能相关有待进一步探讨。
4 结论抗菌肽Sublancin用于肉鸡饲粮中抗生素替代物具有潜在的价值。饲粮中添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin可通过提高养分利用率，减少肠道有害细菌数量来提高肉鸡的生长性能。
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