乳蛋白是牛奶的主要成分，是评价牛奶质量的重要指标。氨基酸(amino acid，AA)是合成乳蛋白的主要前体物，可以影响乳蛋白合成[1]。赖氨酸(lysine，Lys)是乳蛋白合成主要的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)，也是奶牛的限制性氨基酸。因此，深入研究Lys对乳蛋白合成的影响及机理，对调节乳腺内乳成分的合成和改善乳品质具有重要意义。李沐阳等[2]研究发现，玉米秸秆饲粮条件下奶牛阴外动脉灌注氨基酸能促进乳蛋白合成。王立娜[3]以奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)为模型在培养基中添加EAA发现，乳蛋白的合成量增加了。Giallongo等[4]研究发现，奶牛灌注过瘤胃Lys后促进乳蛋白合成的同时，也改善了乳品质。可见，Lys在一定程度上影响了乳蛋白的合成，但前人的研究多集中在向奶牛体内灌注Lys影响乳蛋白合成的方面，对体外添加Lys影响乳蛋白合成及其机理方面的探索研究甚少，有必要对此进行深入试验研究。鉴于此，本研究以BMECs为模型，研究不同浓度Lys对乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响，为进一步探讨Lys对BMECs内乳蛋白合成的影响机理提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器Ⅱ型胶原酶、DMEM/F12培养基、胰岛素转铁蛋白硒钠、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)购自Gibco公司；Lys(货号L8662)、氢化可的松、表皮生长因子、催乳素、琼脂糖购自Sigma公司；RNAiso PLUS、PrimeScript RT Master Mix和SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ购自TaKaRa公司；兔抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗体(货号ab2732)、兔抗磷酸化mTOR抗体(货号ab84400)、兔抗真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)抗体(货号ab72116)、兔抗磷酸化eIF4E抗体(货号ab4774)、兔抗p70核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)抗体(货号ab64804)、兔抗磷酸化S6K1抗体(货号ab126818)、兔抗真核起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation 4E binding protein 1，4EBP1)抗体(货号ab2606)、兔抗磷酸化4EBP1抗体(货号ab75767)购自Abcam公司；兔抗磷酸腺苷活化的蛋白激酶α1(adenosine 5’-mono-phpsphate-active protein kinase，AMPKα1)抗体(货号YT0216)和兔抗磷酸化AMPKα1抗体(货号YP0575)购自Immunoway公司；一抗稀释液、二抗稀释液、十二烷基四乙酸二钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳液、转膜液、ECL化学超敏显色液购自北京碧云天公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗(货号04-15-06)购自KPL公司。主要仪器：全自动酶标仪(Synergy H4，美国BioTek)、实时荧光定量PCR仪(ABI-7500，美国ABI)、电泳仪、转膜仪、蛋白成像系统(美国BIO-RAD)。
1.2 原代BMECs的体外培养与试验设计在内蒙古自治区呼和浩特市北亚清真屠宰场选取3头3~5岁经产的健康泌乳中期的高产荷斯坦奶牛乳腺组织，参考Sheng等[5]采用的胶原酶消化法获得和培养BMECs，当原代细胞贴壁率达到80%~90%后，用0.25%胰蛋白酶/EDTA对细胞进行纯化和传代。将第3代BMECs按照试验要求的细胞密度接种于不同细胞培养板上，于37、5% CO2条件下培养24 h。当细胞贴壁率达到80%~90%时，换为饥饿培养基，培养12 h后，采用单因素完全随机试验设计，将细胞分为6组，在每组中加入不同浓度的Lys工作液，使反应体系中Lys终浓度分别为0.5(对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，每组6个重复，培养48 h。DMEM/F12培养基中Lys的浓度为0.5 mmol/L，Lys的浓度参考高海娜[6]和李喜艳[7]的研究结果，并通过测定细胞相对增殖率[相对增殖率(%)=(试验组OD490 nm/对照组OD490 nm)×100]确定。
1.3 测试指标与方法BMECs内ATP的含量采用化学发光法测定。将细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板上，按试验设计培养结束后，弃上清，每孔加入200 μL裂解液，待细胞充分裂解后，收集细胞悬液，4 ℃、15 455×g离心5 min，取上清，立即根据ATP检测试剂盒说明书的方法进行测定，即用ATP检测裂解液将ATP标准溶液稀释为0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00和10.00 μmol/L 6个浓度；然后，用ATP检测试剂稀释液将ATP检测试剂按1 : 9的比例稀释成ATP检测工作液；最后，在每个检测孔内加入100 μL ATP检测工作液，室温静置3~5 min，再向每孔内加入20 μL样品，迅速混匀后用全自动酶标仪测定Lum值，再根据标准曲线计算出样品ATP浓度，用二辛可酸(BCA)蛋白质浓度试剂盒测样品中蛋白质浓度，将ATP浓度换算成nmol/mg prot形式。
BMECs内总RNA按照Trizol法提取。将细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板，按试验设计培养结束后，用酶标仪检测总RNA的纯度与浓度，OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.2表示提取的RNA纯度较好。总RNA完整性用2%琼脂糖凝胶电泳检测。将总RNA反转录成cDNA，采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒的方法进行，反转录体系为10 μL。基因表达量采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒的方法进行测定，反应体系为20 μL。以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为管家基因，对乳蛋白合成相关基因[α-酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、β-酪蛋白(β-casein，CSN2)、κ-酪蛋白(κ-casein，CSN3)、酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、信号转导和转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)、mTOR、S6K1、4EBP1、eIF4E和AMPKα1]的表达量进行测定，其引物序列见表 1。实时荧光定量PCR的反应程序为：95.0 ℃预变性30 s；95.0 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸20 s，进行40个循环反应；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，51个循环，绘制熔解曲线。基因的表达量采用2-∆∆Ct法计算。
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表 1 乳蛋白合成相关基因的引物 Table 1 Primers of genes involved in milk protein synthesis |
BMECs内乳蛋白合成相关的蛋白磷酸化水平采用蛋白质免疫印迹法测定。将细胞以5×106个/瓶的密度接种于25 cm2细胞培养瓶中，按试验设计培养结束后，弃掉上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2遍，每瓶加入250 μL含0.1%苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的放射免疫沉淀测定(RIPA)细胞裂解液，4 ℃裂解5 min后刮下细胞，收集细胞悬液，4 ℃、15 455×g离心10 min，取上清用于检测蛋白磷酸化水平。取适量样品用BCA法测定总蛋白质浓度，随后分别向60 μg的每种样品中添加5×蛋白上样缓冲液，按照4 : 1的质量体积比混合，100 ℃加热5 min使蛋白质热变性，然后按照蛋白质免疫印迹法的步骤进行电泳、转膜；将转膜后的醋酸纤维素(PVDF)膜分别与用一抗稀释液稀释500倍的一抗结合，于4 ℃孵育过夜，随后使其分别与用二抗稀释液稀释1 000倍的山羊抗兔二抗结合，室温摇床孵育1 h；最后用ECL化学超敏显色液进行显色，在蛋白成像系统上照相分析。图片用Quantity one软件进行灰度值分析，各蛋白磷酸化水平数据采用各试验组与对照组相比的方法表示。
1.4 数据统计分析数据采用SAS 9.0软件的方差分析程序(ANOVA)进行显著性检验，同时用回归统计程序进行一次线性与二次曲线回归分析，P＜0.05表示组间的差异或回归关系显著，0.05≤P＜0.10表示组间的差异或回归关系趋于显著，P≥0.10表示组间的差异或回归关系不显著。
2 结果 2.1 Lys对BMECs内ATP含量及乳蛋白合成相关基因表达的影响由表 2可知，BMECs内RGR呈显著的一次线性下降(P＜0.001)，并且4.0~16.0 mmol/L组的RGR显著低于对照组和1.0~2.0 mmol/L组(P＜0.05)；ATP含量以2.0~16.0 mmol/L组显著高于对照组(P＜0.05)，2.0 mmol/L组最高，回归分析结果显示，随着Lys浓度的增加，ATP含量呈趋于显著的二次曲线升高(P=0.050)。随着Lys浓度的增加，CSN1S1基因表达量呈趋于显著的一次线性降低(P=0.081)；以1.0~2.0 mmol/L组显著高于其他组(P＜0.05)，尤以2.0 mmol/L组最高，但4.0~16.0 mmol/L组显著低于对照组和1.0~2.0 mmol/L组(P＜0.05)。1.0~2.0 mmol/L组的CSN2和STAT5基因表达量显著高于其他组(P＜0.05)，以2.0 mmol/L组最高，但CSN2以8.0 mmol/L组最低，STAT5以4.0~16.0 mmol/L组显著低于对照组(P＜0.05)；1.0~16.0 mmol/L组的JAK2基因表达量显著高于对照组(P＜0.05)。CSN3(P=0.093)、mTOR(P=0.005)、eIF4E(P=0.076)和AMPKα1基因表达量(P=0.045)随着Lys浓度的增加呈显著或趋于显著的二次曲线变化，均为先升高后降低。CSN3基因表达量以1.0~4.0 mmol/L组显著高于其他组，但8.0~16.0 mmol/L组显著低于对照组(P＜0.05)，mTOR基因表达量以对照组和1.0~8.0 mmol/L组显著高于16.0 mmol/L组(P＜0.05)，eIF4E基因表达量以2.0~8.0 mmol/L组显著高于其他各组(P＜0.05)，AMPKα1基因表达量以1.0~8.0 mmol/L组显著高于其他组(P＜0.05)。2.0 mmol/L组的S6K1基因表达量最高，显著高于对照组(P＜0.05)，以16.0 mmol/L组最低。对于4EBP1的基因表达量，1.0~16.0 mmol/L组较对照组显著降低(P＜0.05)。
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表 2 Lys对BMECs内ATP含量和乳蛋白合成相关基因表达量的影响 Table 2 Effects of Lys on ATP content and the expression levels of genes involved in milk protein synthesis in BMECs |
由表 3和图 1可知，随着Lys浓度的增加，mTOR(P=0.038)和S6K1磷酸化水平(P=0.022)呈显著的一次线性降低。eIF4E的磷酸化水平以2.0~4.0 mmol/L组较高，显著高于其他各组(P＜0.05)，但16.0 mmol/L组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平随着Lys浓度的增加呈显著的一次线性升高(P=0.014)。
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表 3 Lys对BMECs内乳蛋白合成相关蛋白磷酸化水平的影响 Table 3 Effects of Lys on phosphorylation levels of proteins involved in milk protein synthesis in BMECs |
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括号内为磷酸化位点。 Phosphorylation sits were showed in parentheses. 图 1 Lys对BMECs内mTOR信号通路磷酸化水平的影响 Figure 1 Effects of Lys on phosphorylation of mTOR signaling pathway in BMECs |
酪蛋白在牛乳蛋白中大约占80%，它主要包括CSN1S1、αs2-酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、CSN2和CSN3，尤以CSN1S1和CSN2的含量较高，分别为40%和25%左右[9]。CSN1S1、CSN2和CSN3是反映乳蛋白合成的3个主要基因，其表达量会影响BMECs内乳蛋白的合成。Nan等[10]研究发现，与0 mmol/L的Lys组相比，1.2 mmol/L的Lys组显著的上调了BMECs内CSN1S1、CSN2和CSN3基因的表达。本研究结果得出，Lys显著促进了CSN1S1、CSN2和CSN3基因表达，均以1.0~2.0 mmol/L组促进效果较好，且Lys对CSN3和CSN1S1基因表达的促进效果呈剂量依赖关系，高剂量的16.0 mmol/L组显著抑制其表达。
酪氨酸激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(STAT)和mTOR信号通路是调控蛋白质合成的2条重要通路[11-12]。JAK/STAT信号通路中，对乳蛋白合成调控的研究主要集中在JAK2/STAT5信号通路上。Liu等[13]研究指出，添加Lys可显著提高BMECs内STAT5基因表达量，然而STAT5沉默后CSN2基因表达量下降，过表达后上调其表达，说明Lys可能通过JAK2/STAT5信号通路影响乳蛋白的合成。本研究发现，Lys可显著促进STAT5和JAK2基因表达，STAT5以2.0 mmol/L组促进效果最好，但高剂量4.0~16.0 mmol/L组显著抑制其表达，与Lys对酪蛋白基因表达的作用效果相似，进一步验证了Lys可能通过JAK2/STAT5信号通路促进乳蛋白的合成。
mTOR信号通路在蛋白质翻译水平上调控乳蛋白合成[12]。4EBP1和S6K1是mTOR信号通路下游的2个关键元件，当mTOR被上游信号激活后会通过调节S6K1和4EBP1这2条下游通路来调控动物机体内蛋白质的翻译；然而4EBP1和elF4E的结合会抑制蛋白质翻译，当mTOR激活4EBP1磷酸化后，磷酸化的4EBP1与elF4E脱离，降低了对蛋白质翻译的抑制，促进蛋白质的合成。本研究发现，适宜浓度的Lys促进了mTOR、S6K1基因表达和eIF4E基因表达及磷酸化，但8.0~16.0 mmol/L组其促进作用减弱或具有抑制作用。Lys浓度的增加抑制了4EBP1的基因表达，而对其磷酸化水平无显著影响。毕微微[14]研究发现，添加Lys上调了BMECs内mTOR信号通路中与乳蛋白翻译相关的mTOR和S6K1基因表达，但下调了4EBP1基因的表达，与本研究的结果相似。这些研究结果提示Lys可能通过促进mTOR信号通路相关基因表达和磷酸化剂量依赖性地影响乳蛋白合成基因的表达。
氨基酸和ATP是蛋白质合成过程中非常重要的2个因素，二者的供给直接影响乳品质的高低。乳腺合成和分泌乳蛋白时需要大量的能量，大约会消耗掉BMECs内约50%的ATP[15]。AMPK是细胞内主要的能量感受器，参与多种代谢信号通路，调节机体代谢和能量的供需平衡[16]。AMPK还是mTOR信号通路的上游调控元件，负调控mTOR介导的下游信号通路[17]。当细胞内ATP/一磷酸腺苷(AMP)降低或营养物质缺乏会激活AMPK，从而增加ATP的分解和减少ATP的合成[18-19]。因此，AMPK可以通过mTOR信号通路从蛋白质翻译水平来调控乳蛋白的合成。王珊珊[20]研究表明，随着氨基酸浓度的下降细胞内营养物质和能量水平也下降了，进而激活AMPK，抑制mTOR、S6K1和4EBP1的磷酸化，减少乳蛋白的合成。本研究发现，添加一定浓度的Lys在提高mTOR基因表达量及ATP含量的同时，也促进了AMPKα1基因表达，但高剂量的16.0 mmol/L组反而显著降低了mTOR和AMPKα1基因的表达量，与前人的研究结果不尽一致，造成这些结果差异的原因尚不清楚，需要进一步探讨。
本研究结果也得出，Lys浓度与ATP含量，CSN1S1、CSN3、mTOR、eIF4E和AMPKα1的基因表达量以及mTOR、S6K1和AMPK的磷酸化水平存在显著或趋于显著的剂量依赖关系，ATP含量以2.0~16.0 mmol/L组，CSN1S1、CSN2、STAT5基因表达量以1.0~2.0 mmol/L组，mTOR基因表达量以1.0~8.0 mmol/L组，CSN3基因表达量以1.0~4.0 mmol/L组，JAK2基因表达量以1.0~16.0 mmol/L组，S6K1基因表达量以2.0 mmol/L组，eIF4E基因表达量以2.0~8.0 mmol/L组，eIF4E磷酸化水平以2.0~4.0 mmol/L组时促进效果较好；但16.0 mmol/L组的调节作用减弱或呈相反的变化趋势。李喜艳[7]研究发现，虽然提高了BMECs培养基中个别氨基酸的添加量，但是会导致氨基酸配比不平衡进而严重影响乳蛋白的合成，因此，高剂量Lys会抑制乳蛋白合成相关基因表达可能与氨基酸配比不平衡有关。此外，Mercier等[21]的研究指出，BMECs的数量在某种程度上可能决定了乳蛋白的合成量，同时，高海娜等[22]研究也发现，添加0.5~2.0 mmol/L Lys促进BMECs增殖，但高剂量会抑制其增殖，与本研究适宜浓度Lys促进细胞增殖，而高剂量抑制其增殖的结果相似，进一步解释了高剂量Lys会抑制乳蛋白合成相关基因表达。因此，Lys浓度为1.0~2.0 mmol/L时，对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的促进效果较好。
Brazil等[23]指出，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路是调控mTOR信号通路非常重要的上游调控通路，对mTOR信号通路起正调控作用。还有研究指出，Akt可能通过结节性硬化症复合物1(TSC1)/结节性硬化症复合物2(TSC2)间接地调控mTOR信号通路[24]。这些结果说明，Lys可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控mTOR通路进而促进乳蛋白合成相关基因的表达，但本试验并未对PI3K/Akt/mTOR信号通路进行研究，具体调控机理尚不清楚，需要进一步研究。
4 结论Lys对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的促进效果呈剂量依赖关系，以浓度为1.0~2.0 mmol/L时较好，高浓度(16.0 mmol/L) Lys抑制乳蛋白合成相关基因的表达，Lys可能通过JAK2/STAT5和mTOR信号通路促进乳蛋白合成相关基因的表达。
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