动物营养学报    2018, Vol. 30 Issue (9): 3517-3523    PDF    
二乙烯三胺/一氧化氮聚合物诱导的奶牛外周血单个核细胞氧化损伤模型的建立
郑亚光, 齐敬宇, 张博綦, 史彬林, 闫素梅     
内蒙古农业大学动物科学学院, 呼和浩特 010018
摘要: 本试验旨在利用二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)作为一氧化氮(NO)供体,以细胞存活率和抗氧化指标作为判断依据,确定建立奶牛外周血单个核细胞(PBMC)的氧化损伤模型的适宜条件。试验分2部分进行。试验1采用单因子完全随机试验设计,以不同浓度[0(对照)、50、100、200、300、500 μmol/L]的DETA/NO作为刺激源,在37℃下分别作用细胞2、4、6、8、12 h,通过测定细胞存活率,初步确定适宜的DETA/NO作用时间。试验2根据试验1得出的DETA/NO适宜作用时间,以不同浓度[0(对照)、50、100、200、300、500 μmol/L]的DETA/NO作为刺激源,依据抗氧化指标和炎症因子含量进一步筛选出适宜的DETA/NO作用浓度。结果显示:200 μmol/L DETA/NO作用细胞4 h,PBMC存活率降低至72.3%,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性均较对照组显著降低(P < 0.05),白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、丙二醛和NO含量均较对照组显著上升(P < 0.05)。结果提示,在37℃下,DETA/NO诱导PBMC建立PBMC氧化损伤模型的适宜作用浓度和作用时间分别为200 μmol/L和4 h。
关键词: 奶牛外周血单个核细胞     二乙烯三胺/一氧化氮聚合物     氧化损伤    
Establishment of Oxidative Damage Model of Dairy Cow Peripheral Blood Mononuclear Cells Induced by Diethylenetriamine/Nitric Oxide Adduct
ZHENG Yaguang, QI Jingyu, ZHANG Boqi, SHI Binlin, YAN Sumei     
College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
Abstract: This study was conducted to investigate the suitable condition for oxidative damage model of dairy cow peripheral blood mononuclear cells (PBMC) induced by diethylenetriamine/nitric oxide adduct (DETA/NO) which was a nitric oxide (NO) donor. The oxidative damage model of PBMC was established by detecting the cell survival rate and antioxidant parameters. The test was divided into 2 parts. Test 1 was conducted as a single factor randomized arrangement, PBMC was exposed in DETA/NO with different concentrations[0 (control), 50, 100, 200, 300 and 500 μmol/L] for 2, 4, 6, 8 and 12 hours at 37℃, respectively. The suitable action time of DETA/NO was determined by detecting the cell survival rate. Based on the results of suitable action time of DETA/NO in test 1, the cells exposed in DETA/NO with different concentrations[0 (control), 50, 100, 200, 300 and 500 μmol/L] in test 2, the suitable action concentration of DETA/NO was further screened by detecting the antioxidant parameters and inflammatory cytokine contents. The results showed that the PBMC survival rate decreased to 72.3%, the activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase decreased significantly (P < 0.05), and the contents of interleukin-1, interleukin-6, tumor necrosis factor-α, malondialdehyde and NO increased significantly (P < 0.05) after treated with 200 μmol/L DETA/NO for 4 hours. It is concluded that the suitable action concentration and action time at 37℃ of DETA/NO for establishing the oxidative damage model of dairy cow PBMC are 200 μmol/L and 4 hours, respectively.
Key words: peripheral blood mononuclear cell     diethylenetriamine/nitric oxide adduct     oxidative damage    

高产奶牛尤其是泌乳高峰期的奶牛,由于较高的营养需求和代谢水平,通常伴随着自由基类代谢产物的增加。过量的自由基可以诱导动物机体产生脂质过氧化,引起细胞膜结构和功能的改变,造成机体的抗氧化应激能力、免疫功能及炎症应答能力下降,使奶牛对疾病的易感性增强。研究表明,从妊娠后期到围产期和泌乳高峰期,奶牛氧化应激水平的进程性提高是导致免疫功能障碍的主要原因[1-2]。因此,深入探讨奶牛机体的氧化应激发生机制、减缓氧化应激的发生、提高其免疫功能对保障奶牛的健康生产具有重要的理论与实际意义。一氧化氮(NO)是生物体内的一种气体信号分子和活性氮自由基,存在于多种细胞(如巨噬细胞、肝细胞、肌细胞和内皮细胞等)中,主要具有免疫调节、神经信号传递、血压生理调控和血小板凝聚抑制等生理功能[3]。研究证实,NO的浓度与机体多种信号通路的活性和炎症反应有关,低剂量的NO对维持机体免疫功能、血流量、血小板凝集反应和神经传递等内环境的稳定具有重要的生理作用,而过多的NO通常伴随有炎症和免疫紊乱。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在生理情况下不表达,而在炎症状态下iNOS被激活产生大量NO,导致组织损伤,加剧炎症进程[4],由此得出,NO的过量产生可能是引起奶牛氧化应激产生的原因之一。本课题组的前期研究表明,高剂量二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)使奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)产生明显的氧化应激反应,并已成功建立NO诱导的BMEC氧化损伤模型[5]。奶牛外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是一类重要的免疫效应细胞,能够反映机体感染及疾病的发生,其抗氧化应激能力与奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相关。目前,关于PBMC氧化应激发生机制的研究报道较少。有研究认为,分布于巨噬细胞的iNOS在机体的免疫应答后激活并产生过量的NO,是引起PBMC氧化应激和机体炎症反应加剧的原因之一[6]。鉴于此,本研究以DETA/NO为NO供体,筛选NO的作用浓度与作用时间,建立奶牛体外PBMC的NO损伤模型,为通过体外法揭示奶牛PBMC的氧化应激机制,进一步缓解高产奶牛氧化应激提供基础性理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

PBMC,采用单次密度梯度离心分离法分离培养制备;RPMI-1640基础培养基,购自美国Gibco公司;台盼蓝、牛PBMC分离液,购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;DETA/NO,购自美国Sigma公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8),购自上海碧云天生物技术有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS),购自美国HyClone公司。

1.2 DETA/NO培养液的配制

准确称取10 mg DETA/NO溶于612.8 μL的超纯水中,配制成浓度为0.1 mol/L的母液,配制方法参照本课题组前期试验[5]。再将DETA/NO母液按试验要求配制成不同浓度(0、50、100、200、300、500 μmol/L)的DETA/NO贮备液。取不同浓度的DETA/NO贮备液加入到RPMI-1640基础培养基中,配制成DETA/NO终浓度分别为0、50、100、200、300、500 μmol/L的细胞培养液。各细胞培养液中除DETA/NO浓度不同外,其他成分均相同。将上述细胞培养液经22 μm的过滤器过滤,现用现配,避光保存。

1.3 PBMC的培养

本试验利用单次密度梯度离心分离法分离培养PBMC,分离培养方法参照天津灏洋TBD牛PBMC分离液说明书。健康奶牛尾静脉采血后,12 h内进行PBMC分离。将血液样本用RPMI-1640基础培养基稀释1倍后,小心地将血液加于牛PBMC分离液上方,15 mL离心管中稀释后血液与分离液比例为1 : 1,400~500×g分离40 min(离心机温度低于25 ℃, 细胞获得率高低与室温有关,超过25 ℃时会影响细胞获得率),离心后由上至下分为4层,第1层为血浆层,第2层为环状乳白色PBMC层,第3层为透明分离液层,第4层为红细胞层。吸取第2层,并用PBS重悬清洗细胞,250×g离心10 min后弃上清,重复清洗细胞2次后,将细胞接种于25 cm2培养瓶中,于37 ℃、5%CO2培养箱中培养,培养68 h后将细胞离心后收集进行后续试验。在细胞培养结束前4 h取部分细胞用台盼蓝进行染色并计数活细胞数( > 95%)

1.4 试验设计

试验分为2个部分。试验1采用单因子完全随机试验设计,将细胞离心后重悬于不同浓度的DETA/NO培养液中,以6×106个/mL的密度接种于96孔培养板中,并随机分为30个组,每组8个重复,细胞培养液中DETA/NO的终浓度分别为0、50、100、200、300、500 μmol/L,并在37 ℃下分别作用2、4、6、8、12 h,通过测定其对细胞存活率的影响,初步筛选DETA/NO适宜的作用时间,其中以0 μmol/L为对照组。试验2采用单因子完全随机试验设计,将培养后得到的PBMC以6×106个/mL的密度接种于24孔培养板中,并随机分为6个组,每组6个重复,细胞培养液中DETA/NO的终浓度分别为0、50、100、200、300、500 μmol/L,在37 ℃下以试验1筛选得出的DETA/NO适宜作用时间为DETA/NO的处理时间,通过检测细胞培养液抗氧化指标和炎症因子,进一步筛选出DETA/NO的适宜作用浓度,其中以0 μmol/L为对照组。

1.5 样品采集与处理

将24孔培养板中的细胞培养液以重复为单位,分别收集于1.5 mL Eppendorf离心管中,于4 ℃、10 000×g离心5 min,收集上清液用于抗氧化指标与炎症因子的测定,样品采集与处理方法参照本课题组前期相关试验[7]

1.6 测定指标与方法 1.6.1 细胞存活率

采用CCK-8法检测细胞存活率,以吸光度值反映细胞的数量[8]。按照试验1的试验设计将细胞悬液以6×106个/mL的密度接种于96孔培养板,100 μL的细胞悬液加入CCK-8的体积为10 μL,避光37 ℃孵育4 h后在波长450 nm处检测各孔的吸光度值(OD450 nm),各组的细胞存活率用相对于对照组OD450 nm的百分比表示。对照组的细胞存活率表示为100%。

1.6.2 抗氧化指标与炎症因子

抗氧化指标:超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黄嘌呤氧化酶法测定,过氧化氢酶(CAT)活性采用比色法测定,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定,丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定,操作步骤按照试剂盒说明书进行,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

炎症因子:NO、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量均采用双抗体夹心法测定,具体操作按照试剂盒说明书进行,试剂盒购自美国R&D公司。

1.7 数据统计与分析

试验数据用Excel 2007进行初步整理,采用SAS 9.0统计软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析,应用Duncan氏法进行多重比较,P < 0.05表示差异显著。

2 结果 2.1 DETA/NO作用浓度与作用时间对PBMC存活率的影响

表 1可以看出,与对照组相比,作用时间为4~12 h时,所有作用浓度的DETA/NO对PBMC存活率均具有显著的降低作用(P < 0.05),且随着DETA/NO作用浓度的增加,PBMC存活率呈逐渐的降低趋势。作用时间为4 h时,DETA/NO作用浓度为50、100 μmol/L时,PBMC存活率组间差异不显著(P > 0.05),但数值上有下降的趋势;DETA/NO作用浓度为200~500 μmol/L时,PBMC存活率随作用浓度的增加显著下降(P < 0.05);作用浓度为300、500 μmol/L时PBMC存活率分别为59.3%和47.7%,显著低于作用浓度为50、100和200 μmol/L时(P < 0.05),作用浓度为50、100和200 μmol/L时PBMC存活率均在70%以上。作用时间为6、8 h的各浓度组中,100~500 μmol/L组作用6 h时PBMC存活率为30.9%~54.1%,作用8 h时PBMC存活率为22.1%~52.6%,均显著低于对照组和50 μmol/L组(P < 0.05);作用时间为12 h的各浓度组中,100~500 μmol/L组PBMC存活率为22.5%~50.4%,显著低于对照组和50 μmol/L组(P < 0.05)。当DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时,作用时间分别为2、4、6 h时,PBMC存活率均在80%以上,当作用时间延长至8、12 h时,PBMC存活率降低,分别为76.8%、75.8%。当DETA/NO作用浓度分别为300、500 μmol/L时,随着DETA/NO作用时间的延长,PBMC存活率分别由2 h的83.7%、79.5%均降低至60%以下,最低降到22.1%。

表 1 DETA/NO作用浓度与作用时间对PBMC存活率的影响 Table 1 Effects of action concentration and time of DETA/NO on PBMC survival rate
2.2 DETA/NO作用浓度对PBMC抗氧化指标和炎症因子的影响

表 2可以看出,不同浓度的DETA/NO作用4 h后,SOD活性随着DETA/NO作用浓度的增加呈下降趋势。当DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时,SOD活性相比对照组差异不显著(P > 0.05);当DETA/NO浓度为100~500 μmol/L时,SOD活性相比对照组显著降低(P < 0.05),且DETA/NO作用浓度为200~500 μmol/L时的SOD活性还显著低于DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时(P < 0.05),尤以作用浓度为500 μmol/L时SOD活性最低。GPx和CAT活性呈现与SOD活性相似的变化规律,MDA含量则呈现与SOD活性相反的变化规律,且以作用浓度为DETA/NO 500 μmol/L时GPx和CAT活性最低,MDA含量最高。

表 2 DETA/NO作用浓度对PBMC抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of DETA/NO action concentration on antioxidant parameters of PBMC

表 3结果可以看出,不同浓度的DETA/NO作用4 h后,随着DETA/NO作用浓度的增加TNF-α含量逐渐升高,以500 μmol/L组TNF-α含量最高;DETA/NO作用浓度为50~500 μmol/L时的TNF-α含量相较对照组均显著上升(P < 0.05)。NO、IL-1、IL-6含量与TNF-α含量呈现相似的变化趋势,但DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时IL-1含量与对照组相比在数值上呈上升趋势,但差异未达显著水平(P > 0.05)。

表 3 DETA/NO作用浓度对PBMC炎症因子含量的影响 Table 3 Effects of DETA/NO action concentration on inflammatory cytokine contents of PBMC
3 讨论

NO是生物体内的一种气体信号分子和活性氮自由基,介导多种生物功能,如宿主防御、血管舒张等[9]。NO是由L-精氨酸向L-瓜氨酸转化过程中生成的,并通过一氧化氮合酶(NOS)内源合成。巨噬细胞来源的NO在生理、病理和炎症反应中起重要作用,然而NO的过量产生引发机体炎症反应及氧化应激[10]。DETA/NO是人工合成的NO/核苷化合物,无需酶催化便能迅速释放NO且半衰期长,有利于体外试验的长时程观察,是较为理想的外源性NO供体[11]。因此,以DETA/NO为NO供体,诱导PBMC建立氧化损伤模型,可为科学调控奶牛抗氧化能力及机制研究提供理想的试验平台。

周丽娜等[12]的研究指出,细胞死亡率为20%~30%可以作为建立小鼠脊髓神经元细胞氧化应激模型的评判标准。Huo等[13]报道,在小鼠的心肌细胞中,选取细胞存活率为40%~50%作为过氧化氢(H2O2)氧化损伤模型的依据。孙婧陶等[14]指出,以细胞死亡率为50%~60%作为建立延边奶山羊BMEC氧化损伤模型的判别标准。叶新平等[15]在人的体外淋巴细胞损伤试验中,使用低浓度乙醇建立了氧化损伤模型,将乙醇对淋巴细胞的抑制率控制在10%。郭咏梅等[5]在用DETA/NO建立BMEC损伤模型时,将细胞死亡率控制在20%~30%作为判断标准。根据上述研究报道可知,由于细胞种类及使用的刺激源不同,细胞对氧化损伤的耐受能力也不相同,在选择细胞损伤标准上也存在差异。

本试验初步确定将细胞死亡率控制在20%~30%作为判断标准,结果表明,当DETA/NO作用4 h后,50、100 μmol/L组的PBMC存活率分别为89.9%和87.2%,而200 μmol/L组的PBMC存活率表现出显著下降,为72.3%。在全部浓度组中以细胞存活率控制在70%~80%内的DETA/NO作用浓度与作用时间可供参考的是:50 μmol/L作用8或12 h,PBMC存活率分别为76.8%和75.8%;200 μmol/L作用4 h,PBMC存活率为72.3%;500 μmol/L作用2 h,PBMC存活率为79.5%。

DETA/NO作用时间为2 h时,各浓度组的PBMC存活率随着作用浓度的增加在数值上有下降的趋势,除500 μmol/L组PBMC存活率为79.5%外,其余各组PBMC存活率均在80%~90%之间,表现为细胞在不同浓度的DETA/NO处理下仍保持较好的生长状况和细胞活力,即PBMC对DETA/NO的氧化损伤具有较好的耐受性;但考虑到作用浓度过高不适合作为DETA/NO损伤的适宜作用浓度。另外,当DETA/NO作用时间为12 h时,尽管50 μmol/L组PBMC存活率为75.8%,但作用时间过长,不便于试验进行。200 μmol/L DETA/NO作用4 h,可使PBMC存活率降低至72.3%,综合作用时间不宜过长、作用浓度不宜过高,初步筛选DETA/NO作用4 h即可使PBMC的氧化应激达到较为理想的损伤效果,便于后续试验继续对DETA/NO的作用浓度进行合理筛选。

活性氧物质的生物效应在体内受到多种酶和非酶防御机制的控制,SOD、CAT、GPx活性及MDA含量可反映出细胞是否受到氧化损伤以及细胞的氧化损伤程度[16]。NO、IL-1、IL-6、TNF-α是当机体发生氧化应激后产生的常见的炎症因子,测定这些炎症因子含量可以进一步反映细胞氧化损伤的程度[17]。因此,细胞氧化应激模型的建立,除了以细胞存活率作为判别指标外,细胞的抗氧化指标和炎症因子含量的变化也是非常关键的判别指标。通过本试验的结果可以看出,与对照组相比,当DETA/NO作用时间为4 h、作用浓度为100~500 μmol/L时,即可引起SOD、CAT、GPx活性显著下降,MDA含量显著升高;当DETA/NO作用时间为4 h、作用浓度为50 μmol/L时,即可引起NO、IL-6、TNF-α含量显著上升。如前所述,引起PBMC存活率达到70%~80%的DETA/NO作用浓度为200 μmol/L、作用时间为4 h,因此,结合以上抗氧化指标与炎性因子的结果可以得出,以DETA/NO为外源刺激源作用于PBMC时,当其作用浓度为200 μmol/L、作用时间为4 h时,即可引起PBMC的氧化应激损伤和抗氧化能力降低,并增强炎症反应。

4 结论

以DETA/NO为刺激源,其在37 ℃下诱导PBMC建立PBMC氧化损伤模型的适宜作用浓度和作用时间分别为200 μmol/L和4 h。

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