乳糖是牛奶的主要成分，是限制牛奶产奶量的关键因素之一，在一定范围内产奶量随着乳糖合成的增加而增加[1-3]。氨基酸(AA)是合成乳蛋白的主要前体物，在影响乳蛋白合成的同时，也对乳糖合成产生影响[4]。赖氨酸(Lys)是乳蛋白合成主要的必需氨基酸(EAA)，也是奶牛的限制性氨基酸[5]。因此，深入研究Lys对乳糖合成的影响及机理，对调节乳腺内乳成分的合成和增加产奶量具有重要意义。王丽娜[6]发现以奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为模型，在培养基中添加EAA可同时促进了乳蛋白和乳糖的合成。云伏雨[7]研究表明，在奶牛饲粮中添加适宜水平的Lys可以提高产奶量、乳蛋白率和乳糖率。可见，Lys在一定程度上影响了乳糖的合成，但前人的研究多集中在向奶牛体内灌注Lys及体外培养添加Lys影响乳蛋白合成的方面，对体外添加Lys影响乳糖合成及其机理方面的探索研究甚少，有必要对此进行深入研究。鉴于此，本研究以BMECs为模型，研究不同浓度Lys对乳糖合成相关基因表达的影响，为进一步探讨Lys对BMECs内乳糖合成的影响机理提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器试验主要试剂：Ⅱ型胶原酶、DMEM/F12培养基、胰岛素转铁蛋白硒钠、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)，购自Gibco公司；赖氨酸(Lys，L8662)、氢化可的松、表皮生长因子、催乳素、琼脂糖，购自Sigma公司；RNAiso PLUS、PrimeScript RT Master Mix和SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ，购自TaKaRa公司；牛D乳糖酶联免疫吸附试剂盒(EHJ-90716h)，购自厦门慧嘉生物技术有限公司。
试验主要仪器：二氧化碳恒温培养箱(Forma-311，Thermo)、倒置显微镜(Olympuse，日本)、全自动酶标仪(Synergy H4 BioTek，美国)及荧光定量PCR仪(ABI-7500，美国)。
1.2 原代BMECs体外培养与试验设计在内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场选取3头3~5岁经产的健康泌乳中期的高产荷斯坦奶牛乳腺组织，参考Sheng等[8]的胶原酶消化法获得和培养BMECs，当原代细胞贴壁率达到80%~90%后，用0.25%胰蛋白酶/EDTA对细胞进行纯化和传代。将第3代的BMECs按照试验要求的细胞密度接种于6孔培养板上(5×105个/孔)，以含10% FBS的DMEM/F12培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。采用单因子随机试验设计，当细胞贴壁率达到80%~90%时，换为无血清的DMEM/F12饥饿培养基，继续培养12 h后，将细胞分为6个组，在每组中加入不同浓度的Lys工作液，使反应体系中Lys终浓度分别为0.5(对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，每组6个重复，在37 ℃、5% CO2条件下培养48 h。各组DMEM/F12培养基中亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸浓度分别为0.45、0.13、0.25、0.70、0.42、0.22、0.45、0.04和0.45 mmol/L，Lys的浓度参考高海娜等[9]和李喜艳[10]的研究结果并通过测定细胞增殖率[RGR(%)=试验组OD490/对照组OD490×100]确定。
1.3 测试指标与方法BMECs内乳糖的含量采用双抗体夹心法测定。将细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板上，按试验设计培养结束后，收集细胞培养液，按照牛D乳糖ELISA试剂盒说明书的方法步骤测定细胞培养液中乳糖含量，即根据梯度稀释法用标准品稀释液将1.8 mg/L标准品稀释成1 200、800、400、200和100 μg/L 5个浓度，每个浓度分别在酶标包被板上加2个孔(50 μL/孔)，再向待测样品孔中加入40 μL样品稀释液，之后加入10 μL待测样品，用封板膜封板置于37 ℃培养箱温育30 min；温育结束后，弃液体甩干，用洗涤液清洗5次，在每孔中加入50 μL酶标试剂，温育30 min，再洗涤；每孔加入50 μL显色剂A，之后加入50 μL显色剂B，37 ℃避光显色15 min，每孔再加入50 μL终止液，以空白孔调零，用全自动酶标仪测定OD450，根据标准曲线计算样品中乳糖的含量。
BMECs内总RNA按照Trizol法提取。将细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板，按试验设计培养结束后，用酶标仪检测RNA的纯度与浓度，OD260/OD280在1.8~2.2范围内表示RNA纯度较好。RNA完整性用2%琼脂糖凝胶电泳检测。将RNA反转录成cDNA采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒的方法进行，反转录体系为10 μL。基因表达量采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒的方法进行测定，反应体系为20 μL。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体RNA(18S rRNA)为管家基因，对乳糖合成相关基因α-乳清白蛋白(LALBA)、β-1, 4-半乳糖基转移酶-1(β-4GALT1)、葡萄糖转运载体蛋白1 (GLUT1)、已糖激酶Ⅰ(HKⅠ)和已糖激酶Ⅱ(HKⅡ)的相对表达量进行测定，其引物序列见表 1。实时荧光定量PCR的反应程序为：95.0 ℃预变性30 s；95.0 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸20 s，进行40个循环反应；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，51个循环，绘制熔解曲线。实时荧光定量PCR结果用GAPDH、β-actin和18S rRNA这3个管家基因的几何平均值进行分析，基因的相对表达量采用2-△△Ct法计算得出。
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表 1 乳糖合成相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of genes related to lactose synthesis |
所有数据通过Excel 2010进行计算整理，采用SAS 9.0软件的方差分析(ANOVA)程序进行显著性检验，同时用回归统计程序进行一次线性与二次曲线回归分析，P＜0.05表示组间的差异或回归关系显著，0.05＜P＜0.10表示组间的差异或回归关系趋于显著，P>0.10表示组间的差异或回归关系不显著。
2 结果表 2的结果表明，BMECs内乳糖含量随着Lys浓度的增加呈显著的二次曲线升高(P=0.016)，回归方程为y=102.481 83+15.765 10x-0.885 87x2 (R2=0.777 0)，x为Lys浓度，y为乳糖含量，其中以2.0~16.0 mmol/L组乳糖含量较高，趋于显著高于对照组(0.05＜P＜0.10)，以4.0 mmol/L组最高，之后随着Lys浓度的升高促进效果减弱。随着Lys浓度的增加，GLUT1和HKⅡ基因表达量呈显著的一次线性升高(P=0.002和P=0.018)，回归方程为y=0.908 21+0.077 48x(R2=0.936 0)，x为Lys浓度，y为GLUT1基因表达量；y=0.741 29+0.052 45x(R2=0.787 9)，x为Lys浓度，y为HKⅡ基因表达量；其中GLUT1基因表达量以4.0~16.0 mmol/L组较高，显著高于对照组(P＜0.05)，HKⅡ基因表达量以8.0~16.0 mmol/L组较高, 显著高于其他组(P＜0.05)，但1.0~2.0 mmol/L Lys显著抑制了其表达，表现出先降低后升高的变化趋势。随着Lys浓度的增加，HKⅠ基因表达量呈显著的一次线性降低(P=0.031)，回归方程为y=1.086 87-0.043 21x(R2=0.727 2)，x为Lys浓度，y为HKⅠ基因表达量；其中以2.0 mmol/L组最高，高于对照组，而4.0~16.0 mmol/L组低于对照组，尤以16.0 mmol/L Lys显著抑制其表达(P＜0.05)；LALBA和β-4GALT1基因表达量均以2.0~8.0 mmol/L组较高(P＜0.05)，16.0 mmol/L组高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。
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表 2 Lys对BMECs内乳糖合成及相关基因表达量的影响 Table 2 Effect of Lys on lactose content and expression levels of genes related to lactose synthesis in BMECs |
在体外研究中，乳腺组织不能通过糖异生合成葡萄糖[15]，只能从血液吸收获得，因此，添加Lys对BMECs内乳糖合成的影响仅能通过调控作用来完成。本研究发现，添加Lys对乳糖含量的促进效果呈显著的二次曲线升高(回归方程中R2=0.777 0)，方差分析结果显示，不同浓度Lys趋于显著地提高乳糖含量，即在适宜浓度范围内，乳糖含量随着Lys浓度的增加而增加，在4.0 mmol/L时促进效果最好，再随着浓度的进一步增加，其促进效果减弱，说明Lys对乳糖合成的促进作用呈显著的剂量依赖关系。
乳腺对葡萄糖的摄取是调控乳产量的限速步骤，GLUT1是葡萄糖转运蛋白，己糖激酶(HKs)是利用葡萄糖的限速酶，可以催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，HKⅠ和HKⅡ是HKs在乳腺组织中发现的2种基因表达[16]，并且HKⅡ的基因表达与葡萄糖摄取密切相关[17]。Fueger等[18]研究发现，HKⅡ基因过表达后促进葡萄糖吸收。本研究结果发现，Lys浓度对GLUT1与HKⅡ基因表达的促进作用呈显著的一次线性升高，8.0~16.0 mmol/L Lys显著促进GLUT1与HKⅡ基因表达，而1.0~2.0 mmol/L Lys抑制HKⅡ基因表达；Lys对HKⅠ基因表达的影响呈显著的一次线性降低，2.0 mmol/L Lys促进其表达，高剂量具有抑制作用，与赵艳丽[19]的研究结果相似，即亮氨酸可促进HKⅠ基因表达，但高剂量抑制其表达；这些结果说明，Lys可能促进葡萄糖摄取和磷酸化。结果也得出，添加Lys可趋于显著增加乳糖含量，但高剂量的促进效果减弱，可能与适宜浓度Lys促进葡萄糖摄取与磷酸化，而高剂量抑制HKⅠ基因表达有关，这进一步解释了Lys对乳糖合成的作用效果呈剂量依赖关系的原因。
乳糖合成酶由β-4GALT1及LALBA组成，LALBA是乳糖合成酶中的调节亚基，调控乳糖合成与分泌；β-4GALT1是催化亚基，只有在LALBA存在的条件下，才能发挥作用，催化UDP-半乳糖与葡糖糖以β-1, 4糖苷键形成乳糖，控制着乳糖合成效率，进而调节乳产量[20]。本研究发现，2.0~8.0 mmol/L Lys显著促进LALBA和β-4GALT1基因表达，而16.0 mmol/L Lys的促进作用减弱，与Lys促进乳糖含量的结果相吻合，因此进一步解释了BMECs内乳糖含量的增加可能与Lys促进LALBA和β-4GALT1基因表达有关。
综上所述，Lys对乳糖含量和GLUT1、HKⅠ和HKⅡ基因表达的促进作用存在剂量依赖关系，并且乳糖含量以2.0~16.0 mmol/L Lys、GLUT1基因表达量以4.0 ~16.0 mmol/L Lys、HKⅡ基因表达量以8.0~16.0 mmol/L Lys、LALBA和β-4GALT1基因表达量以2.0~8.0 mmol/L Lys的促进效果较好，但16.0 mmol/L Lys对LALBA和β-4GALT1基因表达的促进作用减弱，1.0~2.0 mmol/L Lys显著抑制HKⅡ基因表达，4.0~16.0 mmol/L Lys抑制HKⅠ基因表达。因此，Lys浓度为2.0~8.0 mmol/L时，对BMECs内乳糖合成促进效果较好。
4 结论Lys对乳糖含量和GLUT1、HKⅠ和HKⅡ基因表达量的影响呈剂量依赖关系，以浓度为2.0~8.0 mmol/L时促进效果较好，但浓度为16.0 mmol/L时抑制了HKⅠ基因表达，且减弱了对乳糖合成的促进作用。
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