哺乳动物体内褪黑素(melatonin,MT)是主要由松果体合成和分泌的一种吲哚类激素,广泛分布在很多器官、组织和细胞中[1-2]。研究显示,MT可促进绵羊卵母细胞成熟[3]、维持精子功能[4]、促进胚胎发育[5]和提高机体的抗氧化能力[6],因此适当提高血浆MT含量可能对绵羊生殖和机体健康具有重要的意义。色氨酸(tryptophan,Trp)作为动物体内合成MT的前体物质,在体内经羟化、脱羧、乙酰化和甲基化形成MT。本实验室前期研究表明,补喂瘤胃保护性色氨酸(rumen protected tryptophan,RPTrp)可提高绵羊血浆总Trp和游离Trp含量,同时犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)含量也升高。提高Trp转化为MT合成量首先要提高5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)合成量,而四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)是Trp合成5-HT的关键酶色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)的辅酶[7]。亚叶酸钙(calcium folinate,CF)是叶酸的衍生物,经吸收后可直接提供叶酸在体内的活化形式,具有稳定BH4的作用[8-9]。因此,本试验选择绵羊为试验动物,在RPTrp饲粮中添加CF,探究CF对调控反刍动物体内MT合成的影响。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点试验于2017年7月30日至2017年8月14日在新疆惠康畜牧生物科技有限公司羊场、自然光照条件下进行。采集血样当天日出时间为07:12,日落时间为21:15,昼长14.03 h。
1.2 试验动物选择(3.0±0.5)岁、平均体重(64.45±3.48) kg的健康萨福克绵羊15只。
1.3 试验设计将15只萨福克绵羊随机分为3组,每组5只,分别为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。所有试验羊只饲喂同一营养水平精料补充料(购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司),每天每只羊精料补充料饲喂量为12 g/kg BW、RPTrp(购自北京亚禾营养高新技术有限公司,Trp含量≥45%,过瘤胃率≥85%)为222.2 mg/kg BW(补喂量参考Itabashi等[10]的研究结果)、玉米青贮为1.8 kg,混合干草(苜蓿:麦秸=1 : 1)为自由采食,自由饮水,在此基础上,试验Ⅰ组每天每只羊添加50 mg的CF(购自上海柯维化学技术有限公司),试验Ⅱ组每天每只羊添加100 mg的CF(添加量参考Ravaud等[11]的研究结果)。精料补充料组成及营养水平见表 1,玉米青贮、苜蓿和麦秸的营养水平见表 2。
试验羊只单栏位饲养,每天每只羊的RPTrp、CF、精料补充料和玉米青贮平均分成2份,分别于08:00、20:00饲喂。为保证RPTrp和CF采食完全,先将RPTrp、CF与50 g精料补充料混匀后饲喂,待绵羊采食完毕后再投喂剩余精料补充料、玉米青贮,自由采食混合干草和饮水。根据试验羊场的饲养管理规定,定期打扫圈舍。
1.5 样品的采集与处理于试验的第16天采集血样,采集时间点为上午饲喂前0 h(07:30)、饲喂后1.5、3.0、4.5、6.0、8.0、10.0、12.0 h,通过颈静脉采集血液至肝素钠抗凝采血管中,3 500 r/min离心15 min制备血浆,分装至1.5 mL Eppendorf管中,标记后-20 ℃冰箱中冷冻保存。
1.6 指标的测定采用高效液相色谱法测定血浆Trp、Kyn含量[12]。采用酶联免疫吸附法测定血浆5-HT、MT含量;上午饲喂前0 h血浆总抗氧化能力(T-AOC),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用比色法测定,样品均送至北京华英生物技术研究所进行检测。
1.7 数据处理采用SAS 8.0统计软件的ANOVA进行单因素方差分析,差异显著则用Duncan氏法进行多重比较。用P≤0.01、P≤0.05和0.05<P<0.10分别作为差异极显著、差异显著和有差异趋势的判断标准。
2 结果 2.1 RPTrp饲粮中添加CF对绵羊血浆Trp含量的影响由表 3可知,上午饲喂后0~12.0 h期间,各组间绵羊血浆Trp含量差异均不显著(P>0.05),变化趋势基本一致;在上午饲喂后6.0和8.0 h时,与对照组相比,试验组血浆Trp含量有降低的趋势(P=0.087 2、P=0.053 1)。
由表 4可知,上午饲喂后0~12.0 h期间,各组绵羊血浆Kyn含量无显著性差异(P>0.05),其中在上午饲喂后4.5~10.0 h期间,与对照组相比,试验组血浆Kyn含量有降低的趋势(P=0.094 8、P=0.066 7、P=0.090 9、P=0.054 2)。
由表 5可知,上午饲喂后0~8.0 h期间,与对照组相比,试验组绵羊血浆5-HT含量均有所提高,各组间变化趋势相似,但各组间差异不显著(P>0.05);其中在上午饲喂后4.5和8.0 h时,试验组血浆5-HT含量有增加的趋势(P=0.080 7、P=0.054 1);在上午饲喂后10.0 h时,试验组极显著高于对照组(P=0.005 7),试验组间差异不显著(P>0.05)。
由表 6可知,上午饲喂后0~8.0 h期间,各组间绵羊血浆MT含量差异不显著(P>0.05),但在上午饲喂后6.0和8.0 h时,试验组MT含量有增加的趋势(P=0.089 0、P=0.070 4)。上午饲喂后8.0~10.0 h期间,对照组绵羊血浆MT含量呈下降趋势,上午饲喂后10.0 h时为白天含量最小值,而试验组呈上升趋势,上午饲喂后10.0 h时极显著高于对照组(P=0.000 2)。
由表 7可知,上午饲喂前0 h,与对照组相比,试验Ⅱ组绵羊血浆T-AOC、GSH-Px活性显著提高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05),试验Ⅰ组T-AOC也显著提高(P<0.05),但试验Ⅰ组血浆GSH-Px活性、MDA含量与对照组差异不显著(P>0.05)。各组间血浆SOD活性无显著性差异(P>0.05)。
本试验中,上午饲喂后0~12 h期间,各组间绵羊血浆Trp含量无显著性差异,但试验组均低于对照组,且在上午饲喂后6.0和8.0 h时有降低的趋势。研究显示,CF是叶酸的衍生物,具有稳定和促进机体BH4合成的作用[8]。本试验结果可能与添加CF提高了绵羊体内BH4的含量和TPH的活性、促进Trp沿5-HT途径分解为5-羟色氨酸有关。本试验中,上午饲喂后4.5~10.0 h期间,与对照组相比,试验组绵羊血浆Kyn含量有降低的趋势,与血浆Trp含量的变化趋势基本一致。研究表明,动物体内约95%的L-Trp在色氨酸-2, 3双加氧酶(tryptophan-2, 3-dioxygenase,TDO)和吲哚胺-2, 3双加氧酶(indoleamine-2, 3-dioxygenase,IDO)作用下生成Kyn[13]。正常生理情况下,TDO是肝内催化Trp形成Kyn关键酶,活性主要受底物Trp和激素(糖皮质激素和雌激素)水平的影响[14-15],而IDO主要在机体受感染、炎症或应激时肝外组织发挥作用[16]。本试验中,添加CF可能对绵羊肝内TDO活性无显著影响,血浆Kyn含量降低可能与添加CF提高了绵羊体内TPH活性或表达量有关。
3.2 RPTrp饲粮中添加CF对绵羊血浆5-HT、MT含量的影响本试验中,上午饲喂后0~8.0 h期间,试验组绵羊血浆5-HT含量与对照组相比无显著性升高,但在上午饲喂后4.5和8.0 h时有升高的趋势。研究显示,动物体内TPH主要有2种不同基因编码的亚型TPH1和TPH2。TPH1主要分布在肠嗜铬细胞和松果体中,TPH2主要分布于肠神经系统和中枢神经系统5-HT神经元中[17-19]。在中枢神经系统中,BH4含量并不能使TPH2饱和,因此,直接向脑室注入10 μL浓度为20 nmol/L的BH4或通过微透析灌注BH4的类似物四氢生物蝶呤二盐酸均可显著增加小鼠脑部组织TPH2活性和5-HT含量[20-21]。能否通过提高血浆BH4含量进而提高TPH1活性和血浆5-HT含量还未见报道。本试验结果可能是CF添加量不足或CF在瘤胃中降解而导致,对TPH1活性无显著性影响。本试验中CF添加量是参考胃癌患者化疗时口服CF量(90 mg/d)设置[11],目前尚未有CF在反刍动物瘤胃内是否有降解的研究文献,今后的试验可通过增加CF添加量或瘤胃保护性CF进一步验证。本试验结果还可能与绵羊体内TPH表达量有关。如果TPH表达量较低,BH4已使其饱和,通过添加CF增加BH4含量也可能对TPH1活性无显著影响。研究表明,哺乳动物机体超过95%的5-HT分布于胃肠道,主要有肠嗜铬细胞合成[22-23]。本试验中,上午饲喂后10.0 h时,试验组绵羊血浆5-HT含量极显著高于对照组,这可能与添加CF促进了肠嗜铬细胞中TPH1的表达和5-羟色氨酸合成有关。由于本试验未采集绵羊肠黏膜组织,在以后试验中可通过测定绵羊肠黏膜中TPH1含量进一步验证。
研究表明,TPH1不仅是合成5-HT的限速酶,也是合成MT的关键酶[24]。在白天,哺乳动物血浆MT主要来于肠嗜铬细胞[25]。Namboodiri等[26]证实,腹腔注射20或200 mg/kg BW的5-羟色氨酸可显著提高绵羊血浆MT含量。本试验中,上午饲喂后6.0和8.0 h时,试验组绵羊血浆MT含量有增加的趋势,上午饲喂后10.0 h时极显著高于对照组。这可能与添加CF增加了绵羊肠嗜铬细胞中TPH1表达量、提高了血浆5-羟色氨酸含量有关。此外,5-HT既是色氨酸、5-羟色氨酸的转化产物,也是生成MT的前体物质。研究发现,肠嗜铬细胞、肠神经细胞、血小板、肝脏和肾脏广泛存在单胺氧化酶,可将5-HT转化为5-羟吲哚乙酸,最后经尿液排出体外[23, 27-28]。本试验中,上午饲喂后4.5 h时,试验组血浆5-HT含量有增加的趋势,而MT含量并未增加,可能与补喂CF增加了绵羊体内5-羟吲哚乙酸含量有关。在今后的研究中可进一步检测绵羊血浆和尿液中5-羟吲哚乙酸含量,验证RPTrp饲粮中添加不同剂量CF对绵羊血浆5-HT含量的影响。
3.3 RPTrp饲粮中添加CF对绵羊血浆抗氧化能力的影响本试验中,RPTrp饲粮中添加CF可提高绵羊血浆抗氧化能力。研究表明,叶酸可促进二氢生物喋呤(BH2)向BH4转化,而BH4具有抗氧化的功能[29]。由于CF可直接提供叶酸在体内的活化形式,促进BH2向BH4转化。本试验结果可能与绵羊血浆BH4含量升高有关。此外,本试验结果还可能与绵羊血浆MT含量升高有关,MT是一种有效的抗氧化剂,可减少机体活性氧和活性氮的含量,增加抗氧化酶的表达和活性[6]。
4 结论在RPTrp(222.2 mg/kg BW)饲粮中每天每只绵羊添加50或100 mg的CF,有降低血浆Kyn含量的趋势,对白天血浆Trp、5-HT、MT含量整体没有显著影响,但可提高绵羊血浆抗氧化能力。
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