铁是动物体必需的矿物元素之一，铁在动物体内除了参与合成多种功能蛋白质和含铁酶以外，还能参与造血功能，在机体的正常生长发育过程中发挥重要作用[1-3]。动物缺铁时会损害红细胞的体积、形状和结构，最终导致缺铁性贫血症。铁过量主要以诱导氧化对机体造成损伤[4-5]。随着我国养殖业的快速发展，养殖带来的环境污染问题也日益严重，逐渐被社会关注。重金属污染是土壤污染中最突出的问题之一，重金属被生物吸收后通常在生物体内积累和转化，从而对人类和动物健康产生潜在的威胁。由于重金属污染产生积累性、不可逆性和长期性等后果，这一领域的研究一直是国内外环境科学、生态科学等领域的研究热点[6]。其中，铁就是重金属污染中一个重要的污染物质。因此有必要对减少饲粮中铁添加水平技术进行更为深入的研究。动物体内微量元素的营养状况直接关系着动物的生长发育和健康状况。微量元素铁对畜禽的促生长作用在许多试验中已得到证实。研究表明，适宜的铁添加水平可以提高猪生长速度，改善饲料利用率[7-8]。铁缺乏可以降低肉仔鸡生长性能[9]，增加饲粮中铁添加水平，肉鸡的增重和采食量会随着铁添加水平(0~50 mg/kg)的提高而增加[10]，然而饲粮中添加高水平(400~800 mg/kg)的铁时，肉仔鸡体重和采食量却显著下降，提示高水平的铁会导致肉仔鸡生长性能下降[11]。
枯草芽孢杆菌作为益生菌的一种，可以有效地改善肠道环境，具有促进生长的作用。有研究证实，枯草芽孢杆菌能够抑制由产气荚膜梭菌引起的肉仔鸡坏死性肠炎，提高肉仔鸡的肠道健康水平[12]，能够显著地增加蛋鸡的采食量、饲料转化率与产蛋率[13]，显著提高肉鸡的生长性能[14]。还有研究指出，枯草芽孢杆菌属菌株具有强大的吸附金属能力，因为金属离子能够与该菌细胞表面上的阴离子相互作用而被固定[15]。在之前的研究中，本实验室马传兴等[16]进行过五龙鹅雏鹅对铁需要量的研究，得出1~4周龄雏鹅饲粮铁适宜添加水平为99.56 mg/kg，与其他国家提出的雏鹅铁营养需要量参数有一定差异，有必要进行进一步验证；而在雏鹅饲粮中添加枯草芽孢杆菌条件下铁适宜添加水平的研究还处于空白。为此，本试验以五龙鹅为研究对象，通过研究不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对五龙鹅雏鹅生长性能、造血功能、铁代谢及肾脏功能的影响，旨在探索铁与枯草芽孢杆菌协同关系和家禽饲粮中低铁添加水平的可行性与方法。
1 材料与方法 1.1 试验动物与设计选择1日龄健康五龙鹅360只，采用随机分配编号法，随机分为6个组，每组6个重复，每个重复10只鹅(公母各1/2)。试验设计如表 1所示，Ⅰ组为对照组，在基础饲粮中添加100 mg/kg铁，不添加枯草芽孢杆菌；Ⅱ~Ⅵ组为试验组，在基础饲粮中分别添加0、25、50、75、100 mg/kg铁，枯草芽孢杆菌添加水平均为250 mg/kg。试验期4周。试验鹅由国家水禽产业技术体系育种基地高密市银河润雁鹅业有限公司提供。试验用铁源为一水硫酸亚铁(FeSO4·H2O)，其有效成分为91.4%；试验用枯草芽孢杆菌为冻干菌粉粉末，活菌数为2×109 CFU/kg，二者均购自青岛普兴生物科技有限公司。
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表 1 试验设计 Table 1 Experimental design |
基础饲粮参照NRC(1994)家禽营养需要量设计，基础饲粮组成及营养水平见表 2。
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验前对鹅舍进行全面消毒；全期采取舍饲，网上分栏饲养；试验鹅自由饮水和采食，少添勤喂，注意观察鹅群的生长状况。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能指标4周龄末，分别对试验鹅进行空腹称重，计算雏鹅的平均日增重(ADG)；每日统计饲料消耗量，计算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每天记录各组死亡及淘汰情况，计算死淘率(mortality rate，MR)。
1.4.2 屠宰性能指标4周龄末，从每重复中分别抽取2只(公母各1/2)体重接近该组平均体重的试验鹅，每组6只，总共36只进行屠宰，宰前禁食12 h，按照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NY/T 823—2004)测定屠体重、半净膛重、全净膛重、腹脂重、胸肌重和腿肌重，并计算屠宰率(slaughter rate，SR)、半净膛率(half-eviscerated rate，HER)、全净膛率(all-eviscerated rate，AER)、腹脂率(abdominal fat rate，AFR)、胸肌率(chest muscle rate，CMR)和腿肌率(leg muscle rate，LMR)6项屠宰性能指标。
1.4.3 血液指标和血清生化指标4周龄时，从每重复中分别抽取2只(公母各1/2)体重接近该组平均体重的试验鹅，每组6只，总共36只。称重后采用含肝素钠抗凝的采血管及不锈钢采血针进行心脏穿刺采血，一部分全血4 ℃保存，采用全自动生化分析仪(日立7600-020)测其中的血红蛋白(HGB)含量、红细胞(RBC)数量、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)和平均血红蛋白含量(MCH)；另一部分3 000 r/min离心得血清后，于-20 ℃保存，用于测定血清总铁结合力(total iron binding capacity, TIBC)、转铁蛋白饱和度(transferrin saturation, TS)及铁、尿酸(uric acid, UA)、尿素氮(urea nitrogen, UN)和肌酐(creatinine, Crea)含量。
1.5 统计分析采用SPSS 22.0软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD法和配对t检验2种分析方法，试验数据以“平均值±标准误”表示。用不相关比较法分析各指标随饲粮中铁添加水平的线性或曲线反应，采用曲线拟合法，确定饲粮中铁的适宜添加水平。P < 0.05和P < 0.01分别为差异显著和极显著水平。
2 结果与分析 2.1 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅生长性能的影响由表 3可知，通过配对t检验分析，与Ⅰ组(未添加枯草芽孢杆菌)相比，Ⅵ组(添加枯草芽孢杆菌)雏鹅体重、ADG均升高(P > 0.05)，ADFI、F/G均降低(P > 0.05)。
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表 3 枯草芽孢杆菌对雏鹅生长性能的影响 Table 3 Effects of Bacillus subtilis on growth performance of goslings |
由表 4可知，饲粮铁添加水平对雏鹅体重、ADG和F/G影响极显著(P < 0.01)，且随着饲粮中铁添加水平的增加，雏鹅体重、ADG均先升高后降低，F/G先降低后升高。其中，Ⅳ、Ⅴ组体重、ADG极显著高于Ⅱ组(P < 0.01)，显著高于Ⅲ、Ⅵ组(P < 0.05)；Ⅳ组F/G极显著低于Ⅱ、Ⅵ组(P < 0.01)，显著低于Ⅲ组(P < 0.05)，与Ⅴ组差异不显著(P > 0.05)。各组ADFI和MR差异不显著(P > 0.05)。
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表 4 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅生长性能的影响 Table 4 Effects of Bacillus subtilis supplementation in different iron supplemental level diets on growth performance of goslings |
通过曲线拟合，在饲粮中添加250 mg/kg枯草芽孢杆菌的前提下，只有ADG(Y1)和F/G(Y2)与饲粮铁添加水平(X)之间的二次曲线回归方程拟合比较理想：
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由上述曲线回归方程得出：在基础饲粮中添加250 mg/kg的枯草芽孢杆菌的条件下，饲粮中添加80.50 mg/kg铁，ADG最大；饲粮中添加60.34 mg/kg铁，F/G最佳。
以上结果表明，枯草芽孢杆菌和铁均有促进雏鹅生长发育的作用。另外，在添加枯草芽孢杆菌条件下，基础饲粮中铁添加水平达到100 mg/kg时，生长性能指标有降低趋势，MR有升高趋势，说明铁添加水平过高无生物学意义。
2.2 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅屠宰性能的影响由表 5可知，通过配对t检验分析，与Ⅰ组相比，Ⅵ组雏鹅SR、HER、AER、CMR和LMR均升高(P > 0.05)，AFR均降低(P > 0.05)。
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表 5 枯草芽孢杆菌对雏鹅屠宰性能的影响 Table 5 Effects of Bacillus subtilis on slaughter performance of goslings |
由表 6可知，饲粮铁添加水平对雏鹅AER和CMR影响显著(P < 0.05)，且随着饲粮铁添加水平的增加，雏鹅SR、HER、CUR、CMR、LMR均先升高后降低，AFR先降低后升高。其中，Ⅳ组CMR极显著高于Ⅱ组(P < 0.05)，显著高于Ⅲ组(P < 0.05)，与Ⅴ、Ⅵ组差异不显著(P > 0.05)；Ⅴ组CMR显著高于Ⅱ组(P < 0.05)，与Ⅲ、Ⅵ组差异不显著(P > 0.05)。
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表 6 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅屠宰性能的影响 Table 6 Effects of Bacillus subtilis supplementation in different iron supplemental level diets on slaughter performance of goslings |
以上结果表明，饲粮中添加适宜水平铁和枯草芽孢杆菌均能够提高鹅屠宰性能，降低腹脂沉积量。另外，在添加草芽孢杆菌条件下，基础饲粮中铁添加水平达到100 mg/kg时，屠宰性能各项指标有下降趋势，AFR有升高趋势，说明铁添加水平过高无生物学意义。
2.3 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅造血功能的影响由表 7可知，通过配对t检验分析，与Ⅰ组相比，Ⅵ组雏鹅血液HGB含量(P > 0.05)、RBC数量(P < 0.05)、HCT(P > 0.05)、MCV(P > 0.05)、MCH(P < 0.05)均升高。
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表 7 枯草芽孢杆菌对雏鹅造血功能的影响 Table 7 Effects of Bacillus subtilis on hematopoietic function of goslings |
由表 8可知，饲粮铁添加水平对雏鹅血液HGB含量、RBC数量、HCT、MCV和MCH的影响极显著(P < 0.01)，且随着饲粮铁添加水平的增加，雏鹅血液HGB含量、RBC数量、HCT、MCV和MCH均先升高后降低。其中，Ⅴ、Ⅵ组血液HGB含量极显著高于Ⅱ、Ⅲ组(P < 0.01)，显著高于Ⅳ组(P < 0.05)；Ⅴ组血液RBC数量极显著高于Ⅱ、Ⅲ组(P < 0.01)，显著高于Ⅳ组(P < 0.05)，与Ⅵ组差异不显著(P > 0.05)；Ⅴ组血液HCT极显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ组(P < 0.01)，显著高于Ⅳ组(P < 0.05)；Ⅳ组血液MCV极显著高于Ⅱ、Ⅲ组(P < 0.01)，显著高于Ⅴ、Ⅵ组(P < 0.05)；Ⅴ组血液MCH极显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P < 0.01)，显著高于Ⅵ组(P < 0.05)。
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表 8 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅造血功能的影响 Table 8 Effects of Bacillus subtilis supplementation in different iron supplemental level diets on hematopoietic function of goslings |
以上结果表明，枯草芽孢杆菌和铁均有改善雏鹅造血功能的作用。另外，在添加草芽孢杆菌条件下，基础饲粮中铁添加水平达到100 mg/kg时，造血功能各项指标有下降趋势，说明铁添加水平过高无生物学意义。
2.4 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅铁代谢和肾脏功能的影响由表 9可知，通过配对t检验分析，与Ⅰ组相比，Ⅵ组雏鹅血清铁含量、TIBC、TS均升高(P > 0.05)，血清UA、UN、Crea含量均降低(P > 0.05)。
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表 9 枯草芽孢杆菌对雏鹅铁代谢和肾脏功能的影响 Table 9 Effects of Bacillus subtilis on iron metabolism and kidney function of goslings |
由表 10可知，饲粮铁添加水平对雏鹅血清TIBC和UA含量影响极显著(P < 0.01)，且随着饲粮中铁添加水平的增加，雏鹅血清铁含量、TIBC、TS均先升高后降低，血清UA、UN、Crea含量先降低后升高。其中，Ⅳ、Ⅴ组血清TIBC显著高于Ⅲ、Ⅵ组(P < 0.05)，与Ⅱ组差异不显著(P > 0.05)；Ⅳ组血清UA含量极显著低于Ⅱ组(P < 0.01)，显著低于Ⅵ组(P < 0.05)，与Ⅲ、Ⅴ组差异不显著(P > 0.05)。各组血清TS及铁、UN和Crea含量差异不显著(P > 0.05)。
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表 10 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅铁代谢和肾脏功能的影响 Table 10 Effects of Bacillus subtilis supplementation in different iron supplemental level diets on iron metabolism and kidney function of goslings |
以上结果表明，饲粮中添加适宜水平铁和枯草芽孢杆菌，均能够提高雏鹅铁代谢水平，改善雏鹅的肾脏功能。另外，在添加草芽孢杆菌条件下，基础饲粮中铁添加水平达到100 mg/kg时，铁代谢指标有下降趋势，肾脏功能指标有升高趋势，说明铁添加水平过高无生物学意义。
3 讨论 3.1 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅生长性能的影响铁作为动物的必须矿物元素之一，在维持动物正常的生长、代谢、繁殖等方面发挥着重要的作用。动物体内铁的含量直接影响磷的含量，进而影响细胞中DNA的合成；同时通过体内含铁酶调控细胞中线粒体和微粒体，影响蛋白质的合成。Vahl等[17]在1~39日龄海佩科肉鸡的玉米-豆粕型饲粮中添加0、20、60 mg/kg的硫酸亚铁，发现肉鸡的增重随着铁添加水平的提高而增加。林映才等[18]在生长猪的基础饲粮中添加0、150、250、350 g/t的复方富力铁，能显著提高生长猪的ADG，显著降低F/G。枯草芽孢杆菌是我国农业部公布的12种可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂之一，对提高动物生长性能、饲料转化率等效果明显[19]。Hooge等[20]研究证实，枯草芽孢杆菌制剂对肉鸡、肉鹅具有促生长作用。Molnár等[21]研究发现，枯草芽孢杆菌能够增加肉仔鸡的ADG，提高饲料转化率。本试验结果表明，饲粮中添加枯草芽孢杆菌，能提高雏鹅体重、ADG，降低F/G；而在基础饲粮中添加适量的铁和枯草芽孢杆菌能极显著提高雏鹅体重、ADG，极显著降低F/G，且各指标最值均优于对照组(铁添加水平100 mg/kg)。这表明枯草芽孢杆菌与铁具有协同作用，二者能协同提高鹅的生长性能。
3.2 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅屠宰性能的影响屠宰性能反映出家禽的产肉性能，因此是其生长性能和屠宰加工效益的重要依据之一。王彦文等[22]报道肉仔鸡活体重会影响屠宰肉量，当给肉仔鸡饲粮中补充适宜的铁，肉仔鸡的生长速度就会增加，屠宰性能也会相应的增加。张仁义等[23]研究发现，饲粮添加50、100、200 mg/kg地衣芽孢杆菌制剂，对麻羽肉鸡的SR、AER和HER无显著影响，却能提高CMR和LMR，各指标与抗生素组均无显著差异。本试验结果表明，饲粮中添加枯草芽孢杆菌能提高雏鹅的屠宰性能；在基础饲粮中添加适量的铁和枯草芽孢杆菌均能提高雏鹅的屠宰性能，尤其是AER和CMR提高最为明显，且各指标均优于对照组(铁添加水平100 mg/kg)。这表明枯草芽孢杆菌与铁具有协同作用，二者能协同提高鹅的屠宰性能。
3.3 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅造血功能的影响动物血液、血清生化指标的改变通常预示着动物生理机能发生改变，血液中的任何有形成分发生病理变化都会影响全身的组织器官，进而使各种生理机能发生改变。血液中RBC数量、HGB含量和HCT是反映动物机体铁代谢状况和营养状况的重要指标[24, 3]。本试验结果表明，饲粮中添加枯草芽孢杆菌能提高雏鹅的造血功能，尤其以雏鹅的血液RBC数量和MCH升高最为显著；在基础饲粮中添加适量的铁和枯草芽孢杆菌能极显著改善雏鹅的造血功能，且各指标均优于对照组(铁添加水平100 mg/kg)。这表明枯草芽孢杆菌与铁具有协同作用，二者能协同改善鹅的造血功能。铁的添加不仅能直接促进血液HGB和RBC的合成，还能通过改善肾脏的功能合成促红细胞生成素间接促进RBC的合成，提高鹅的造血功能[15]；枯草芽孢杆菌能改善雏鹅的造血功能的机理还有待于进一步研究。
3.4 不同铁添加水平饲粮中添加枯草芽孢杆菌对雏鹅铁代谢和肾脏功能的影响血清中铁和铁蛋白含量是反映机体铁代谢状况、生长发育状况和新陈代谢状况的重要指标[25-26]。血清TIBC是指能与100 mL血清中全部转铁蛋白结合的最大铁量。血清铁含量可以确定动物体铁的营养状态，能够较真实地反映肝脏及体内的铁总量，血清铁含量不足时会引起血清铁传递蛋白的饱和度过低，导致造血组织铁的供应不足和贫血症状的产生[27-28]。
血液中的非蛋白氮包括UA、UN和Crea等，分别为嘌呤、蛋白质和肌肉代谢的终末产物，均通过肾脏从尿中排出，直接反映肾脏的功能[29]。UA是鸟类和爬行类的主要代谢产物，微溶于水，易形成晶体。如果机体未能将UA从肾脏排出，这些物质会最终形成结晶体积存于体内，导致肾功能衰竭。UN为机体蛋白质分解代谢的产物，90%以上通过肾脏排泄，其余则由肠道和皮肤排出。当肾脏发生各种病变，正常的排泄功能遭到破坏时，即引起血清UN含量升高。血清中UN的含量是肾功能变化的一项重要指标。Crea是机体肌肉代谢的产物，包括外源性和内源性2种。外源性Crea是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性Crea是体内肌肉组织代谢的产物。在正常情况下，机体内Crea的含量基本稳定。如果机体肌肉的容积无明显变化，内源性Crea的生成量是相对恒定的，主要通过肾小球滤过排出体外。所以，在外源性Crea稳定的情况下，血清中的Crea含量可作为检测肾小球滤过功能的指标之一。
血清铁含量不足时会引起血清铁传递蛋白的饱和度过低，导致造血组织铁的供应不足和贫血症状的产生，而贫血是肾功能衰竭的重要并发症。在临床医学上发现，口服补铁可以有效的改善肾脏功能[30]。本研究结果中血清铁含量的变化趋势与血清UA、UN和Crea含量的变化趋势相反，表明铁代谢与肾脏功能之间有密切关系，此结果与Meara等[31]的研究一致。
本试验结果表明，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌能改善雏鹅铁代谢和肾脏功能；在基础饲粮中添加适量的铁和枯草芽孢杆菌能改善雏鹅的铁代谢和肾脏功能，尤其以血清TIBC和UA含量最为显著，且各指标均优于对照组(铁添加水平100 mg/kg)。这表明枯草芽孢杆菌与铁具有协同作用，二者能协同改善鹅的铁代谢和肾脏功能。
4 结论① 饲粮中添加适宜水平铁和枯草芽孢杆菌，均能够提高雏鹅的生长性能和屠宰性能，降低腹脂沉积量。
② 饲粮中添加适宜水平铁和枯草芽孢杆菌，均能够改善雏鹅造血功能和肾脏功能。
③ 饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够降低饲粮中铁添加量，枯草芽孢杆菌与铁具有协同作用。
④ 雏鹅机体铁营养需要量具有一定阈值，过高或过低都不利于机体的生长发育。
⑤ 以最佳生长性能为目标，雏鹅饲粮中添加250 mg/kg枯草芽孢杆菌条件下，建议铁的添加水平为60.34~80.50 mg/kg。
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