脂联素(adiponectin，ADIPOQ，又名Acrp30、apM1、GBP28)是由脂肪组织特异性分泌的一种脂肪细胞因子。研究表明，猪ADIPOQ基因定位在13号染色体上[1]，其全长包含有3个外显子和2个内含子[2]，可编码242个氨基酸，而人类ADIPOQ基因与猪的ADIPOQ基因相比存在2个氨基酸的差别，含有244个氨基酸。ADIPOQ蛋白结构由4部分组成，即氨基端的信号序列、非同源序列、胶原样结构域以及羧基端具有生物活性的球状结构域。Yamauchi等[3]发现了脂联素受体(adiponectin receptor，ADIPOR)，并通过表达克隆的方法首先将它们从人类骨骼肌中分离出来。ADIPOR包含2种亚型：ADIPOR1和ADIPOR2，其中，ADIPOR1主要在肌肉组织中表达，与ADIPOQ的球形结构域有高度亲和性；而ADIPOR2则主要表达于肝脏和脂肪组织中，与全长ADIPOQ和ADIPOQ球形结构域都具有中度亲和性[4]。Ding等[5]首先成功地克隆出猪的ADIPOQ及ADIPOR，并发现ADIPOQ mRNA大量存在于猪的脂肪、肝脏、心脏和肌肉等组织中。沙子岭猪是脂肪沉积型动物，我们在前期试验中已成功在沙子岭猪中克隆出ADIPOQ基因并在毕赤酵母中进行了表达[6]。因此，不同组织ADIPOR相关基因mRNA表达量的变化对于进一步明确ADIPOR与沙子岭猪肉脂肪沉积规律的分子机制具有重要意义。本试验拟对沙子岭猪不同组织器官中ADIPOQ、ADIPOR及其相关基因mRNA和蛋白表达量的发育性变化规律进行研究，旨在为后续的深入研究提供科学数据支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验动物：沙子岭猪12只，购买于湘潭沙子岭原种猪场。
1.2 试验设计与方法选取1、28、140日龄的沙子岭猪各4头，测定不同组织中ADIPOQ、ADIPOR1、ADIPOR2 mRNA和蛋白表达量的发育性变化及2型拓扑异构酶β型(topoisomerase 2β，TOP2β)、TATA结合蛋白(TATA binding protein，TBP)mRNA表达量的发育性变化。
1.3 样品采集与基因表达检测 1.3.1 组织器官样品采集分别采取1、28和140日龄沙子岭猪的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背肌、背脂、腹脂和股肌，立即放入液氮，然后移入-80 ℃冰箱保存。
1.3.2 组织器官样品相关基因mRNA表达量的检测采用Trizol(Invitrogen公司，美国)法提取组织中总RNA，具体操作方法参照Simms等[7]，然后将RNA浓度调节一致，取1 000 ng进行反转录，反转录试剂盒购于TaKaRa公司(大连，中国)，具体方法按说明书进行。再利用实时定量荧光(real-time quantitative)PCR方法检测mRNA的表达量，引物均由维尔生物科技有限公司(长沙)合成，基因的引物设计见表 2。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因进行PCR测定，每个样本每个指标3个孔，共30 μL体系，每孔10 μL，具体组成如下：Template(反转录产物)1 μL，Primer A(10 μmol/L)0.5μL，Primer B(10 μmol/L) 0.5 μL，PCR H2O 13 μL，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。反应条件为95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变性10 s，39个循环，60 ℃退火50 s。以ADIPOQ、ADIPOR1、ADIPOR2、TOP2β和TBP为目的基因进行相对定量，分析其mRNA表达量。
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表 1 基因的引物设计 Table 1 Primer design for genes |
主要试剂包括：Trizol(Invitrogen公司，美国)、反转录试剂盒(TaKaRa公司，大连，中国)、ADIPOQ抗体(Abcam，ab22554)、ADIPOR1抗体(Abcam，ab126611)、ADIPOR2抗体(Abcam，ab77612)、β-actin抗体(Abcam，ab8226)，所有引物均由维尔生物科技有限公司(长沙)合成。
将组织样品剪碎(20~30 mg)，按照质量体积比=1 : 2的比例加入裂解液，组织匀浆器匀浆至组织充分裂解，12 000×g, 4 ℃离心10 min，取上清，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)定量试剂盒进行总蛋白定量。配制10%分离胶和5%浓缩胶，每孔20~30 μg总蛋白上样，每孔10~15 μL，浓缩胶60 V、分离胶80 V电泳直至溴酚蓝到底，停止电泳。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶在Tris-甘氨酸转移缓冲液中平衡30 min，在冷却条件下100 V恒压转膜2 h。转膜结束后，醋酸纤维素(PVDF)膜放到含5%脱脂奶粉的吐温-Tris-盐酸缓冲液(TBST)中室温封闭1 h。TBST漂洗5 min，重复3次，ADIPOQ抗体、ADIPOR1抗体、ADIPOR2抗体和β-actin抗体分别按1 : 1 000、1 : 1 000、1 : 1 000和1 : 2 000的比例溶于含5%脱脂奶粉的TBST中，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗5 min，重复3次。加入相应种属二抗(1 : 2 000)，室温孵育1 h，TBST漂洗5 min，重复3次。配制ECL工作液，室温孵育转印膜1 min，保鲜膜密封，放置于化学发光仪(Image Quant LAS 4000 mini)选取适当的时间进行显影后，采用Bandscan 5.0软件分析计算条带的光密度值，按以下公式对目的蛋白进行相对定量。
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试验数据用Excel 2007软件进行初步处理后，采用SPSS 17.0软件的one-way ANOVA程序进行系统分析，若组间差异显著，则采用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性标准，P＜0.01为差异极显著性标准。试验结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果 2.1 不同组织器官中ADIPOQ mRNA表达量的变化由表 2可知，随着日龄的变化，除了心脏外，猪不同组织器官中ADIPOQ mRNA表达量呈现出先上升再下降的趋势。相较于1日龄猪不同组织器官中ADIPOQ mRNA表达量，28日龄猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背肌、背脂、腹脂和股肌的表达量分别升高11.20%(P>0.05)、545.76%(P＜0.01)、321.36%(P＜0.01)、229.59%(P＜0.01)、419.57%(P＜0.01)、386.96%(P＜0.01)、373.33%(P＜0.01)和303.37%(P＜0.01)；除心脏外，140日龄猪肝脏、脾脏、肾脏、背肌、背脂、腹脂和股肌7种组织器官中ADIPOQ mRNA表达量较28日龄猪又出现下降的趋势，其降幅分别达到16.40%(P>0.05)、62.67%(P＜0.01)、66.87%(P＜0.01)、80.13%(P＜0.01)、77.23%(P＜0.01)、41.55%(P＜0.01)和94.15%(P＜0.01)；除股肌中ADIPOQ mRNA表达量较1日龄猪降低了76.40%(P＜0.01)外，心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背肌、背脂和腹脂较1日龄猪分别提高了30.40%(P>0.05)、439.83%(P＜0.01)、57.28%(P＜0.05)、9.18%(P>0.05)、3.26%(P>0.05)、10.87%(P>0.05)、176.67%(P＜0.01)。
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表 2 不同组织器官中ADIPOQ mRNA表达量的变化 Table 2 Changes of ADIPOQ mRNA expression in different tissues and organs |
由表 3可知，猪不同组织器官(除心脏外)中ADIPOR1 mRNA表达量随日龄变化呈现逐渐升高的趋势。28日龄猪肝脏、脾脏、肾脏、背肌、背脂、腹脂和股肌中ADIPOR1 mRNA表达量较1日龄猪分别提高了249.41%(P＜0.01)、116.36%(P＜0.01)、137.07%(P＜0.01)、84.31%(P＜0.05)、63.37%(P＜0.05)、69.00%(P＜0.05)和47.37%(P＜0.05)；140日龄猪各组织器官中ADIPOR1 mRNA表达量较1和28日龄猪均极显著升高(P＜0.01)。
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表 3 不同组织器官中ADIPOR1 mRNA表达量的变化 Table 3 Changes of ADIPOR1 mRNA expression in different tissues and organs |
由表 4可知，猪不同组织器官中ADIPOR2 mRNA表达量随日龄变化呈现逐渐升高的趋势。28日龄猪不同组织器官中ADIPOR2 mRNA表达量较1日龄猪均极显著升高(P＜0.01)，心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背肌、背脂、腹脂和股肌增幅分别达到89.60%、164.23%、146.09%、132.17%、116.67%、94.34%、102.80%和92.52%；140日龄猪不同组织器官中ADIPOR2 mRNA表达量较1和28日龄猪均极显著升高(P＜0.01)。
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表 4 不同组织器官中ADIPOR2 mRNA表达量的变化 Table 4 Changes of ADIPOR2 mRNA expression in different tissues and organs |
由表 5可知，猪大部分组织器官中TBP mRNA表达量基本呈现逐渐升高的趋势。其中，28日龄猪心脏和肝脏中TBP mRNA表达量较1日龄猪分别降低了37.32%(P>0.05)和9.33%(P>0.05)，而脾脏、肾脏、背肌、背脂、腹脂和股肌中TBP mRNA表达量则分别提高了30.11%(P>0.05)、20.63%(P>0.05)、245.78%(P＜0.01)、75.41%(P>0.05)、194.44%(P＜0.01)和445.45%(P＜0.01)；140日龄猪不同组织器官中TBP mRNA表达量较1和28日龄猪均出现极显著升高(P＜0.01)。
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表 5 不同组织器官中TBP mRNA表达量的变化 Table 5 Changes of TBP mRNA expression in different tissues and organs |
由表 6可知，28日龄猪肝脏和脾脏中TOP2β mRNA表达量较1日龄猪分别降低了66.13%(P＜0.05)和11.46%(P>0.05)，而28日龄猪心脏、肾脏、背肌、背脂、腹脂和股肌中TOP2β mRNA表达量较1日龄猪分别提高了14.97%(P>0.05)、12.50%(P>0.05)、156.00%(P＜0.01)、924.65%(P＜0.01)、157.63%(P＜0.01)和603.13%(P＜0.01)；140日龄猪不同组织器官中TOP2β mRNA表达量较1和28日龄猪均出现极显著提高(P＜0.01)。猪大部分组织器官中TOP2β mRNA表达量基本逐渐升高的趋势。
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表 6 不同组织器官中TOP2β mRNA表达量的变化 Table 6 Changes of TOP2β mRNA expression in different tissues and organs |
由表 6可知，1和28日龄猪背肌、背脂、腹脂和股肌中ADIPOD蛋白的表达量均无显著差异(P>0.05)；相较于1日龄猪，140日龄猪4个组织中ADIPOD蛋白的表达量分别降低了19.01%(P>0.05)、7.77%(P>0.05)、41.96%(P>0.05)和45.54%(P>0.05)，较28日龄猪分别降低了-4.26%(P>0.05)、12.84%(P>0.05)、39.81%(P>0.05)和54.92%(P＜0.05)。除了背肌外，背脂、腹脂和股肌中ADIPOD蛋白的表达量在28~140日龄呈现下降趋势。
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表 7 不同组织器官中ADIPOD蛋白表达量的变化 Table 7 Changes of ADIPOD protein expression in different tissues and organs |
由表 8可知，除腹脂中ADIPOR1蛋白的表达量略有升高(P>0.05)外，28日龄猪背肌、背脂和股肌中ADIPOR1蛋白的表达量较1日龄猪分别降低了3.88%(P>0.05)、0.96%(P>0.05)和5.45%(P>0.05)；140日龄猪不同组织中ADIPOR1蛋白的表达量均低于1和28日龄猪，降幅分别达到6.80%(P>0.05)、38.46%(P＜0.05)、17.82%(P>0.05)、24.55%(P>0.05)和3.03%(P>0.05)、37.86%(P＜0.05)、22.43%(P>0.05)、20.19%(P>0.05)。猪背肌、背脂和股肌中ADIPOR1蛋白的表达量呈现逐渐降低的趋势。
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表 8 不同组织器官中ADIPOR1蛋白表达量的变化 Table 8 Changes of ADIPOR1 protein expression in different tissues and organs |
由表 9可知，除股肌中ADIPOR2蛋白的表达量略有升高(P>0.05)外，28日龄猪背肌、背脂和腹脂中ADIPOR2蛋白的表达量较1日龄猪分别降低了12.61%(P>0.05)、4.31%(P>0.05)和1.65%(P>0.05)；除背肌外，140日龄猪背脂、腹脂和股肌组织中ADIPOR2蛋白的表达量均低于1和28日龄猪，降幅分别达到37.93%(P>0.05)、63.64%(P>0.05)、59.09%(P>0.05)和35.14%(P>0.05)、63.03%(P>0.05)、63.11%(P＜0.05)。猪背肌和腹脂中ADIPOR2蛋白的表达量呈现逐渐降低的趋势。
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表 9 不同组织器官中ADIPOR2蛋白表达量的变化 Table 9 Changes of ADIPOR2 protein expression in different tissues and organs |
初生仔猪不同组织中ADIPOQ mRNA表达量一般比较低，这和仔猪的自身条件有关，仔猪刚出生时前体脂肪较多，而成熟的细胞较少，而随着仔猪的生长发育，前体脂肪细胞不断分化为成熟的脂肪细胞，ADIPOQ mRNA表达量也表现出大幅度的升高。Ramsay等[8]测定了新生仔猪1~21日龄脂肪组织中各种脂肪因子的发育性变化，结果发现ADIPOQ mRNA表达量显著上升；此外，对兔子的研究也发现，ADIPOQ在不同年龄兔子体内的表达差异极显著[9]。本试验结果显示，除了28日龄心脏外，其余组织中ADIPOR mRNA表达量均显著高于1日龄，这是因为心脏中脂肪含量较少，且ADIPOQ的分泌量较小，所以心脏中的变化不会太明显。有研究而表明，肥胖会导致猪ADIPOQ的合成和分泌量减少[10]。本试验结果表明，随着猪日龄的增加，不同组织中ADIPOQ mRNA表达量大致呈现出先上升再下降的趋势。这是因为后期猪通过自身脂肪的大量沉积，进行自身调节，所以ADIPOQ蛋白的表达量呈现出逐渐降低的趋势。
3.2 不同组织器官中ADIPOR1、ADIPOR2 mRNA和蛋白表达量的变化动物机体中ADIPOR1和ADIPOR2 mRNA和蛋白的表达量与脂肪沉积的状态密切相关。一般情况下，随着动物年龄的增大，细胞分裂增殖等新陈代谢活动逐渐增强，ADIPOQ及其受体的表达也会受其影响而不断变化。Ocón-Grove等[11]研究发现，成年公鸡睾丸中ADIPOR1及ADIPOR2 mRNA的表达量分别是青年鸡的8.3和9.0倍；Pischon等[12]发现在生长鼠脂肪组织中，ADIPOQ含量开始时会不断增加，直到第8~10周时才开始逐渐下降。在猪的初期生长阶段，前体脂肪细胞大量分化为成熟的脂肪细胞，包括后期脂肪的沉积阶段脂肪细胞大量生长，在这种情况下，ADIPOR1和ADIPOR2 mRNA表达量也会随着成熟脂肪细胞数量的增加而逐渐升高。本试验结果显示，除了28日龄心脏中ADIPOR1 mRNA表达量要低于1日龄以外，各组织器官中ADIPOR1 mRNA表达量均随日龄的增长而升高；各组织器官中ADIPOR2 mRNA表达量也随着日龄的增加而提高。mRNA表达量的升高不等同于蛋白表达量的升高，随着猪的生长，脂肪会大量的积累，在这种情况下，机体会自动调节ADIPOR1和ADIPOR2蛋白的表达量，通过降解一部分ADIPOR1和ADIPOR2蛋白来确保脂肪组织的沉积，因此，随着猪的生长发育，ADIPOR1和ADIPOR2蛋白的表达量却逐渐降低，这是由猪机体脂肪沉积的需要来进行调节的。De Rosa等[13]发现肥肉型卡赛塔纳猪肌肉、内脏和肾脏周围脂肪中ADIPOR蛋白的表达量均低于瘦肉型的长白猪。本试验结果也显示，除了28日龄时腹脂中ADIPOR1蛋白的表达量要高于1日龄以外，背肌、背腹脂和股肌中ADIPOR1蛋白的表达量均随着日龄的增长出现逐步降低的趋势；背肌和腹脂中ADIPOR2蛋白的表达量随日龄的增加而降低。
3.3 不同组织器官中TOP2β和TBP mRNA表达量的变化目前，对于动物机体中TOP2β和TBP mRNA表达量的研究还比较少。在本研究中，除了28日龄时心脏和肝脏中TOP2β mRNA表达量要低于1日龄以外，各组织器官中TOP2β mRNA表达量均随着日龄的增长而呈现出逐渐升高的趋势；除了28日龄时肝脏和脾脏中TBP mRNA表达量低于1日龄以外，各组织器官中TBP mRNA表达量均随着日龄的增长呈现出显著或极显著升高。真核生物的TOP2β是同型二聚体酶，对于在普通的瞬时双链DNA切割形成过程中改变DNA的拓扑学具有非常关键的作用[14]，拓扑异构酶对于DNA的复制、包装、修复以及DNA拓扑学上允许的变化的转录具有非常关键的作用；而TBP一个最重要的功能是促进真核生物转录。随着猪的生长发育，机体细胞数量大幅增长，TOP2β和TBP mRNA表达量也大幅度升高，这对于保证机体细胞的正常分裂具有十分重要的作用。
4 结论① 随着猪的生长，不同组织器官中ADIPOQ mRNA表达量呈现先上升再下降的趋势，而ADIPOR1和ADIPOR2 mRNA表达量则呈现逐渐升高的趋势；ADIPOD、ADIPOR1和ADIPOR2蛋白的表达量在猪的生长后期均出现降低的趋势。
② 随着猪的生长，不同组织器官中TOP2β和TBP mRNA表达量也大幅度升高。
③ ADIPOQ及相关基因mRNA和蛋白的表达量与猪的脂肪沉积呈负相关，机体能根据自身需要对其进行调节。
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