2. 广东省农业科学院动物科学研究所, 畜禽育种国家重点实验室, 农业部华南动物营养与饲料重点实验室, 广东省动物育种与营养公共实验室, 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室, 广州 510640
2. Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China, Ministry of Agriculture Guangdong Public Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangzhou 510640, China
近年来一系列研究发现，肌纤维的类型直接决定了肉色、嫩度和肌内脂肪含量等多数肉质指标，是影响肉品质的核心因素之一[1-3]。因此，研究肌纤维类型的营养调控对于改善肉品质具有重要的理论意义和应用价值。有研究表明，在对猪肉色评分时发现氧化型(Ⅰ型)肌纤维的比例与肉色评分中的红度(a*)值呈正相关[4]。Leseigneur等[5]研究发现氧化型肌纤维的磷脂含量比酵解型肌纤维高；而且含Ⅰ型肌纤维高的肌肉，肌间脂肪含量高，具有更好的风味和多汁性，而含Ⅱb型肌纤维高的肌肉，肉质较差，甚至产生白肌肉(PSE)。De Souza等[6]证实，过氧化物酶增殖体激活受体α(PPARα)激动剂可以使慢肌(Ⅰ型)中的PPARα的表达量提高，对于快肌(Ⅱ型)没有作用。Russell等[7]发现，提高骨骼肌中的PPARα表达和线粒体内脂肪酸氧化的相关酶的活性能够引起肌纤维类型从Ⅱ型转化到Ⅰ型。近年来的研究发现，叶绿醇与PPARα的激活密切相关，叶绿醇还可以直接作为配体激活PPARα。利用荧光素酶报告基因的研究发现，叶绿醇可以显著激活PPARα，其激活效应是植烷酸的4倍[8]。An等[9]研究发现，在小鼠饲粮中添加叶绿醇可以激活PPARα，从而改善肥胖引起的代谢性疾病。因此，本研究拟通过在小鼠饲粮中添加叶绿醇，观察其对小鼠肌肉代谢相关酶活性和肌纤维类型变化的作用。
1 材料与方法 1.1 试验动物及饲粮本试验所用的3周龄雄性昆明小鼠购自广东省医学实验动物中心。基础饲粮由该中心提供，其组成及营养水平见表 1。将饲粮粉碎后，分别在饲粮中添加0、0.05%、0.50%的叶绿醇以及0.48%硬脂酸，混匀后重新制料，37 ℃烘干。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
分析纯叶绿醇购自瑞鼎化工(上海)有限公司；甘油三酯(TG)、己糖激酶(HK)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3 试验设计和饲养管理40只3周龄雄性昆明小鼠[(13±1) g]经过预饲后分为4组，每组10只, 并单笼饲养。对照组饲喂基础饲粮，阳性对照组饲喂含0.48%硬脂酸的试验饲粮，2个试验组分别饲喂含0.05%和0.50%叶绿醇的试验饲粮。小鼠在自然光照条件下饲养。饲养期间自由饮水、采食，全期试验共计28 d。
1.4 样品采集试验结束后，分离小鼠的腓肠肌、趾长伸肌，滤纸吸干，称重，放入离心管中，迅速投入装有液氮的液氮罐中。采样结束后转移样品至-80 ℃冰箱中保存备用。检测前，将解冻后的腓肠肌样本用0.86%的冷生理盐水小心漂洗，滤纸吸干水分，称重，转入5 mL离心管，加入组织块重量9倍体积的0.86%冷生理盐水，在冰块上将组织块剪碎后匀浆。将制备的10%组织匀浆3 000 r/min低温离心15 min，分装上清，-20 ℃保存备用。
1.5 测定指标与方法 1.5.1 生长性能指标检测每周对小鼠进行逐只称重，计算各组小鼠的平均体重。
1.5.2 腓肠肌和趾长伸肌相对重量的测定试验结束屠宰前，称量小鼠体重，屠宰后分离小鼠的腓肠肌、趾长伸肌，滤纸吸干，称重，计算腓肠肌和趾长伸肌相对重量，计算公式如下：
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采用比色法测定腓肠肌中TG含量和HK、LDH、SDH活性。上述指标的检测方法参照试剂盒说明书进行，用酶标仪(Gene5多功能酶标仪-BioTek，美国)进行吸光度测定。
1.5.4 肌纤维类型组织学测定参照Ashmore等[10]的酶组化法测定。切片制备：将用于组织化学分析的腓肠肌先从液氮转入-80 ℃冰箱，再转入-30 ℃冰箱进行逐步回温，然后沿肌纤维垂直方向进行冰冻切片(切片机，freezing microtome-Leica，德国)，设置冻头温度-20 ℃，冷冻室温度-25 ℃，切片厚度10 μm)，每个样品切5张片。
每张切片利用五点法，深蓝色为Ⅰ型肌纤维，浅蓝为Ⅱa型肌纤维，白色为Ⅱb型肌纤维，在显微镜下(×100)观察肌纤维并拍照，用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件对各类型肌纤维比例进行统计。
1.6 数据统计分析数据采用SPSS 18.0统计软件one-way ANOVA程序进行方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，数据用平均值±标准误(mean±SE)表示，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 叶绿醇对小鼠平均体重的影响由表 2可知，在饲粮中添加0.50%叶绿醇时，前2周平均体重显著低于对照组(P＜0.05)，此后逐渐恢复正常。
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表 2 叶绿醇对小鼠平均体重的影响 Table 2 Effects of phytol on average body weight of mice |
由表 3可知，与对照组相比，饲粮中添加0.05%和0.50%叶绿醇均可显著提高小鼠腓肠肌相对重量(P＜0.05), 对趾长伸肌相对重量无显著影响(P>0.05)。
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表 3 叶绿醇对小鼠腓肠肌和趾长伸肌相对重量的影响 Table 3 Effects of phytol on relative weight of gastrocnemius and extensor digitorum longus of mice |
由表 4可知，与对照组相比，饲粮中添加0.50%叶绿醇显著降低小鼠腓肠肌中TG的含量(P＜0.05)，显著提高HK活性(P＜0.05)；添加0.05%叶绿醇显著提高小鼠腓肠肌中SDH活性(P＜0.05)；饲粮中添加叶绿醇对小鼠腓肠肌中LDH活性无显著影响(P>0.05)；饲粮中添加0.48%硬脂酸对上述代谢酶活性均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 叶绿醇对小鼠腓肠肌TG含量及代谢酶活性的影响 Table 4 Effects of phytol on TG content and activities of metabolize enzymes in gastrocnemius muscle of mice |
由图 1和表 5可知，与对照组相比，饲粮中添加0.50%的叶绿醇可以显著提高小鼠腓肠肌肌纤维类型中Ⅰ型肌纤维比例(P＜0.05)，对于Ⅱa型与Ⅱb型肌纤维比例无显著影响(P>0.05)。
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图 1 小鼠腓肠肌ATP酶染色图 Figure 1 ATP enzyme staining of gastrocnemius muscle of mice (100×) |
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表 5 叶绿醇对小鼠腓肠肌肌纤维比例的影响 Table 5 Effects of phytol on muscle fiber proportion in gastrocnemius muscle of mice |
目前，叶绿醇对动物生长发育的相关报道不多，且研究结果也不尽相同。Mackie等[11]研究发现，在饲粮中添加(0.5%、0.1%)的叶绿醇3周后，发现小鼠的体重显著降低。Hashimoto等[12]研究也发现，小鼠饲粮中添加0.5%叶绿醇可以降低小鼠的采食量，减缓小鼠体重的增加。本试验结果显示，与对照组相比，添加0.50%叶绿醇饲养2周后，可以显著降低小鼠的平均体重。这些试验结果与前人的结果基本一致，其作用机制有待进一步研究探讨。
3.2 叶绿醇对小鼠腓肠肌代谢酶活性和TG含量的影响肌肉的代谢类型可大致分为氧化型、酵解型和中间型。Ⅰ型肌纤维的代谢类型主要是氧化型，Ⅱ型肌纤维的代谢类型主要酵解型[13]。在相同条件下，肌肉处于何种代谢类型与肌肉的自身状况有关，肌肉中LDH、SDH、HK活性能在一定程度上反映肌肉代谢状况[14]。SDH是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。并且SDH与三羧酸循环的其他酶不同，是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒体内膜的一个重要部分[15]。有研究发现，速度、爆发力训练的运动员其快肌纤维选择性肥大，而耐力训练的运动员慢肌纤维选择性肥大，肌肉中慢肌含量多，并且SDH的活性显著提高[16]。Sieck等[17]测定大鼠膈肌中各肌纤维类型中SDH的活性，发现Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维中SDH活性最高。He等[18]研究同样发现，检测人骨骼肌中3种肌纤维的SDH活性，其中Ⅰ型最高，Ⅱa型次之，Ⅱb型活性最低。HK为糖酵解的第一步酶，将葡萄糖转变为葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖激酶是HK的异构体。LDH是一种结合蛋白，其活性可反映细胞内无氧酵解的活跃程度[19]。有研究发现，比较豚鼠的红股肌(Ⅱa型多)、白股肌(Ⅱb型多)、比目鱼肌(Ⅰ型)3种肌肉中HK、LDH的活性，比目鱼肌中LDH活性最低，白股肌中LDH活性最高，而HK活性恰好相反[20-21]。Peter等[22]对比豚鼠的白半膜肌和比目鱼肌中LDH、HK活性，也得出相同的结果。以上结果提示，Ⅰ肌纤维中SDH、HK活性比Ⅱ型肌纤维高，同时LDH活性低于Ⅱ型肌纤维。本试验结果显示，添加叶绿醇可以提高小鼠腓肠肌中HK和SDH活性，说明叶绿醇能够提高肌肉中的氧化代谢酶活性，从而提高肌肉氧化代谢水平。本试验研究结果显示，0.50%叶绿醇组腓肠肌中TG含量显著低于对照组。虽然以氧化型代谢为主的肌肉中肌内脂肪含量较高[23]，但是这种观点存在争议。有试验证明，肌内脂肪与肌肉代谢类型没有相关性[24]。氧化型肌肉中肌纤维脂质含量比酵解型肌肉更高，但肌纤维中的脂质含量相对脂肪细胞中脂质含量而言仍较少，因而肌内脂肪的含量主要还是肌肉的脂肪细胞决定。同时有研究发现，给小鼠饲喂4周0.2%和0.5%叶绿醇的饲粮，可以分别显著降低肝脏的TG含量3倍和4倍[25]，本试验结果与前人研究相似，叶绿醇有减少组织TG含量的作用。
3.3 叶绿醇对小鼠腓肠肌肌纤维类型的影响肌纤维是组成肌肉的基本单位，肌纤维类型组成差异是肉品质变异的一个重要因素[26]，它与嫩度、pH、色差、持水力等肉品质指标存在重要的关系[27-31]，不同肌纤维类型间的转化可能成为肉质改善的关键。高比例Ⅰ型肌纤维肌肉表现为较高的pH24 h和氧化酶活性, 较低的酵解酶活性和滴水损失[32]。有研究表明，增加猪Ⅱ型肌纤维比例，可以增加宰后pH的下降、肉色亮度、肉色灰白、烹饪损失、蛋白质变性程度，降低系水力[33-36]。本试验结果显示，添加0.50%叶绿醇可以增加Ⅰ型肌纤维比例，说明叶绿醇可能具有改善肉品质的作用。
4 结论综合本试验结果表明，饲粮中添加叶绿醇可以提高小鼠腓肠肌的相对重量，提高腓肠肌中HK和SDH活性，增加腓肠肌中Ⅰ型肌纤维的比例。
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