动物营养学报    2018, Vol. 30 Issue (12): 4886-4897    PDF    
低出生重对仔猪免疫功能的影响及精氨酸的营养效应
田一航, 陈代文, 余冰, 何军, 虞洁, 毛湘冰, 罗玉衡, 黄志清, 罗钧秋, 郑萍     
四川农业大学动物营养研究所, 动物抗病营养教育部重点实验室, 雅安 625014
摘要: 本研究旨在探讨低出生重(LBW)对仔猪免疫功能的影响及饲粮添加精氨酸的营养效应。试验选用30头4日龄的仔猪,包括10头正常出生重(NBW)和20头LBW仔猪,NBW仔猪饲喂基础饲粮(Ⅰ组),LBW仔猪分别饲喂基础饲粮(Ⅱ组)和在基础饲粮中添加1.0% L-精氨酸的饲粮(Ⅲ组),人工乳饲喂21 d。结果表明:1)与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪末重、平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)显著降低(P < 0.05),血清免疫球蛋白G含量显著降低(P < 0.05),脾脏肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10和转化生长因子-β1表达量显著降低(P < 0.05),脾脏Toll样受体2、核转录因子-κB、髓样分化因子88(MyD88)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达量显著降低(P < 0.05),胸腺MyD88和p38 MAPK表达量显著降低(P < 0.05),胸腺精氨酸酶2(ARG2)表达量显著降低(P < 0.05)。2)与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪末重、ADG和ADFI显著提高(P < 0.05),料重比有降低的趋势(P=0.07),脾脏指数显著提高(P < 0.05),胸腺指数有提高的趋势(P=0.07),血清免疫球蛋白A(IgA)含量显著提高(P < 0.05),血清免疫球蛋白M(IgM)含量有提高趋势(P=0.05),脾脏干扰素-γ(IFN-γ)表达量显著提高(P < 0.05),脾脏p38 MAPK表达量有提高的趋势(P=0.08)。综上,在本试验条件下,与NBW相比,LBW降低仔猪生长性能、血清IgG含量、脾脏细胞因子基因表达量、脾脏和胸腺免疫相关基因表达量和胸腺ARG2表达量;饲粮添加1.0%精氨酸提高LBW仔猪生长性能、血清IgA和IgM含量、脾脏指数和脾脏IFN-γ表达量,说明饲粮添加精氨酸有改善LBW仔猪免疫功能的作用,部分指标可达到NBW仔猪的水平。
关键词: 低出生重     精氨酸     脏器指数     免疫     细胞因子    
Effects of Low Birth Weight on Immune Function of Piglets and the Nutritional Effects of Arginine
TIAN Yihang, CHEN Daiwen, YU Bing, HE Jun, YU Jie, MAO Xiangbing, LUO Yuheng, HUANG Zhiqing, LUO Junqiu, ZHENG Ping     
Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Ministry of Education, Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China
Abstract: The aim of this study was to investigate the effects of low birth weight (LBW) on immune function and the nutritional effects of arginine supplementation for piglets. A total of 30 piglets (4-day-old) including ten normal birth weight (NBW) piglets and twenty LBW piglets were selected. NBW piglets were fed a basal diet (group Ⅰ), and LBW piglets were fed the basal diet (group Ⅱ) and the basal diet supplemented with 1.0% L-arginine (group Ⅲ), respectively. The experiment lasted for 21 days feeding the artificial milk. The results showed as follows: 1) compared with group Ⅰ, the final weight, average daily gain (ADG) and average daily feed intake (ADFI) were significantly decreased (P < 0.05), the serum immunoglobulin G (IgG) content was significantly decreased (P < 0.05), the gene expression levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-10 and transforming growth factor-β1 in spleen were significantly decreased (P < 0.05), the gene expression levels of Toll-like receptor 2, nuclear factor-κB, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) in spleen were significantly decreased (P < 0.05), the gene expression levels of p38 MAPK and MyD88 in thymus were significantly decreased (P < 0.05), and the arginase 2 (ARG2) gene expression level in thymus was significantly decreased (P < 0.05) of piglets in group Ⅱ. 2) Compared with group Ⅱ, the final weight, ADG and ADFI were significantly increased (P < 0.05), the ratio of feed to gain trended to be increased (P=0.07), the spleen index was significantly increased (P < 0.05) and the thymus index tended to be increased (P=0.07), the serum immunoglobulin A (IgA) content was significantly increased and the serum immunoglobulin M (IgM) content tended to be increased (P=0.05), the interferon-γ (IFN-γ) gene expression level in spleen was significantly increased (P < 0.05), and the p38 MAPK gene expression level in spleen tended to be increased (P=0.08) of piglets in group Ⅲ. In conclusion, under the experimental conditions, the LBW decreases growth performance and serum IgG content, down-regulates the expression level of cytokine genes in spleen, decreases the expression levels of immune function-related genes in spleen and thymus, and reduces ARG2 gene expression level in thymus of piglets. Dietary 1.0% arginine increases growth performance, serum contents of IgA and IgM, spleen index, and IFN-γ gene expression level in spleen, suggesting that arginine improves the immune functions of LBW piglets, some indices can reach the level of NBW piglets.
Key words: low birth weight     arginine     organ index     immune     cytokine    

遗传育种技术的发展和饲养管理的改善虽然提高了母猪的窝产仔数,但是也提高了低出生重仔猪数量[1],自然发生的低出生重仔猪比例高达15%~20%[2-3]。低出生重显著提高仔猪断奶前死亡率和发育不良比例[4],造成饲养管理所投入的精力和资本增加。宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)即哺乳动物妊娠期胚胎或胎儿发育受阻,是低出生重仔猪产生的主要原因[2, 5]。前人研究表明,与正常出生重仔猪相比,IUGR仔猪胸腺双阳性(CD4+CD8+)细胞占总T细胞的比例[6]、外周血淋巴细胞对脂多糖(LPS)和刀豆素A(ConA)刺激的反应[7]和血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量[8-9]均显著降低。

精氨酸是幼龄哺乳动物所必需的氨基酸,在体内既参与蛋白质的合成,又是一氧化氮、多胺、肌酸和胍丁胺合成的前体[10]。哺乳仔猪7~14日龄,血液循环中精氨酸及其前体瓜氨酸、鸟氨酸的含量显著降低[11-12]。前人研究表明,单头7日龄的哺乳仔猪每天精氨酸的需要量为2.7 g,而猪乳只能提供1.06 g[13-14]。Kim等[15]在哺乳仔猪配方乳中添加精氨酸,显著提高了仔猪血浆精氨酸含量和生长性能。精氨酸在免疫调节中具有重要作用,正常条件下,饲粮添加0.2%和0.8%精氨酸使14日龄仔猪脾脏指数分别提高32%和14%,饲粮添加0.6%精氨酸使其胸腺指数提高150%[16]。免疫抑制条件下,饲粮添加精氨酸显著提高了仔猪脾脏和胸腺指数、外周血白细胞数量和淋巴细胞比例、血清IgA含量和干扰素-γ(IFN-γ)表达量[17-18]。免疫激活条件下,饲粮添加精氨酸显著降低仔猪血清IFN-γ和白细胞介素-6(IL-6)含量和肝脏肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,抑制Toll样受体4(TLR4)信号通路的过度激活[19-20]

低出生重影响仔猪免疫功能,而精氨酸在免疫调节中具有重要作用。因此本试验通过比较低出生重仔猪和正常出生重仔猪的免疫功能,并在饲粮中添加精氨酸饲喂低出生重仔猪,考察精氨酸添加对低出生重仔猪的免疫功能的影响。

1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计

试验所用仔猪从72头体况接近、胎次相近和产期一致的母猪所产“杜×长×大”新生仔猪中选取。根据前人研究[21-22]确定选择标准,首先标记出16头1.4~1.6 kg的正常出生重仔猪和72头0.8~1.0 kg的低出生重仔猪。4日龄时,再按照体重接近和性别比例一致的原则从标记过的仔猪中选取30头仔猪,包括10头正常出生重仔猪和20头低出生重仔猪,正常出生重仔猪饲喂基础饲粮(Ⅰ组),10头低出生重仔猪饲喂基础饲粮(Ⅱ组),另外10头低出生重仔猪饲喂在基础饲粮中添加1.0% L-精氨酸的试验饲粮(Ⅲ组),人工乳饲喂21 d。

1.2 试验材料

L-精氨酸由日本味之素公司提供,纯度为99%,L-丙氨酸由上海易蒙斯公司提供,纯度为99%。

1.3 试验饲粮

饲粮为人工乳,由代乳粉加水配制而成,按照代乳粉:水=1 : 4的比例加40 ℃温开水,充分溶解混匀后饲喂。基础饲粮参考前人研究[23-24]配制,精氨酸组(Ⅲ组)饲粮添加1.0%的L-精氨酸,此添加量根据本课题组前期研究确定,通过添加葡萄糖和L-丙氨酸使2种饲粮等能等氮,基础饲粮组成及营养水平见表 1

表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)
1.4 饲养管理

试验在四川农业大学动物营养研究所科研基地进行,所有仔猪单笼饲养于代谢笼中。试验前对圈舍及代谢笼进行全面消毒,试验第1周温度控制在31~32 ℃,之后每周降低2 ℃,相对湿度控制在50%~60%。每天饲喂时间为06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00和24:00,每次以仔猪吃饱为准,并记录采食量,计算干物质采食量。试验期间不对猪只使用任何抗生素类药物,其余按基地要求进行操作管理。

1.5 样品采集与处理

在正式试验的第22天清晨,对各组仔猪进行称重,记录末重。

1.5.1 血液样品采集

在正式试验的第22天清晨称重结束后,对各组仔猪进行空腹采血,将采集的前腔静脉血液缓慢倒入玻璃采血管中,3 500 r/min离心15 min制备血清,取吸上清液,做好标记后分装,置于-20 ℃冰箱保存待测。

1.5.2 脏器称重

血液样品采集结束后,对仔猪进行麻醉屠宰。屠宰后,迅速打开仔猪腹腔,分离出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺以及腹股沟淋巴结,然后小心剔除脏器表面异物并用滤纸吸去脏器表面的血渍,使用电子秤进行称重。

1.5.3 组织样品采集

脏器称重后,分别取脾脏和胸腺组织装于冻存管中,锡箔纸包好,投入液氮速冻,并放入-80 ℃冰箱保存待测。

1.6 测定指标与方法 1.6.1 生长性能

根据仔猪初始体重、干物质采食量和末重计算平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI),并计算料重比(F/G)。

1.6.2 脏器指数

使用电子秤对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和腹股沟淋巴结称重,计算脏器指数。

脏器指数(g/kg)=脏器重量(g)/体重(kg)。

1.6.3 血清IgA、IgG和IgM含量

采用上海鑫乐生物科技有限公司的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定,严格按照说明书进行操作。

1.6.4 脾脏和胸腺基因表达测定

实时定量PCR法测定脾脏和胸腺细胞因子基因[包括白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-6、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IFN-γ和转化生长因子-β1(TGF-β1)]、免疫相关基因[包括Toll样受体2(TLR2)、TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、核转录因子-κB(NF-κB)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)]和精氨酸代谢基因[包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、精氨酸酶1(ARG1)和精氨酸酶2(ARG2)]相对表达量。

总RNA的提取按照试剂盒(Trizol Reagent, TaKaRa, 日本)操作说明进行,RNA质量检测使用核酸蛋白检测仪(Beckman DU-800, CA, 美国)于260 nm检测,A260/A280表示RNA的纯度,该比值在1.8~2.0说明RNA纯度较好。cDNA的合成按照逆转录试剂盒(Prime ScriptTM regent kit, TaKaRa, 日本),反应结束后-20 ℃保存待用。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索基因序列,运用Primer 5进行引物设计,由上海生工生物工程公司合成,引物序列见表 2。用实时定量PCR仪(ABI7900HT Real-Time PCR System, ABI, 美国)进行测定,反应荧光染料为SYBR Green Ⅰ (TaKaRa, 日本)。反应体系为10.0 μL:5.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、3.0 μL双蒸水和1.0 μL cDNA模板。通过对3个常用内参基因[β-肌动蛋白(β-actin)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和18S核糖体RNA(18S rRNA)]的筛选,分别选择β-actin和GAPDH作为脾脏和胸腺的内参基因,使用2-ΔΔCT方法计算目的基因相对表达量。

表 2 实时定量PCR引物序列及参数 Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time qPCR
1.7 数据统计分析

试验数据首先用Excel 2010进行初步整理,然后使用SPSS 21.0软件,采用独立样本t检验对试验数据进行分析,两两比较,Ⅱ组与Ⅰ组比较的显著性用P1表示,Ⅲ组与Ⅱ组比较的显著性用P2表示,Ⅲ组与Ⅰ组比较的显著性用P3表示,以P < 0.05为差异显著,0.05≤P < 0.10为有趋势。试验结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果 2.1 低出生重对仔猪生长性能的影响及精氨酸的营养效应

表 3所示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组仔猪末重、ADG、ADFI和F/G显著降低(P < 0.05);与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪末重、ADG和ADFI显著提高(P < 0.05),F/G有降低的趋势(P=0.07)。

表 3 低出生重对仔猪生长性能的影响及精氨酸的营养效应 Table 3 Effects of low birth weight on growth performance of piglets and the nutritional effects of arginine
2.2 低出生重对仔猪脏器指数的影响及精氨酸的营养效应

表 4所示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和腹股沟淋巴结指数无显著差异(P>0.10),Ⅲ组仔猪胸腺指数和腹股沟淋巴结指数显著提高(P < 0.05);与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏指数显著提高(P < 0.05),胸腺指数有提高的趋势(P=0.07)。

表 4 低出生重对仔猪脏器指数的影响及精氨酸的营养效应 Table 4 Effects of low birth weight on organ indices of piglets and the nutritional effects of arginine
2.3 低出生重对仔猪血清免疫球蛋白含量的影响及精氨酸的营养效应

表 5所示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪血清IgG含量显著降低(P < 0.05),Ⅲ组仔猪血清IgA和IgM含量显著提高(P < 0.05),Ⅲ组仔猪血清IgG含量显著降低(P < 0.05);与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪血清IgA含量显著提高(P < 0.05),血清IgM含量有提高趋势(P=0.05)。

表 5 低出生重对仔猪血清免疫球蛋白含量的影响及精氨酸的营养效应 Table 5 Effects of low birth weight on serum immunoglobulin content of piglets and the nutritional effects of arginine
2.4 低出生重对仔猪脾脏和胸腺细胞因子基因表达的影响及精氨酸的营养效应

表 6所示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪脾脏IL-10、TNF-α和TGF-β1表达量显著降低(P < 0.05),Ⅲ组仔猪脾脏IFN-γ表达量显著提高(P < 0.05),Ⅲ组仔猪脾脏TGF-β1表达量显著降低(P < 0.05),Ⅱ组仔猪胸腺IL-2表达量有提高的趋势(P=0.08),Ⅲ组仔猪胸腺IL-10表达量显著降低(P < 0.05),Ⅲ组仔猪胸腺IL-1β(P=0.08)和IL-6表达量(P=0.08)有降低的趋势;与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏IFN-γ表达量显著提高(P < 0.05),胸腺IL-10表达量(P=0.06)和TGF-β1表达量(P=0.09)有降低的趋势。

表 6 低出生重对仔猪脾脏和胸腺细胞因子基因表达的影响及精氨酸的营养效应 Table 6 Effects of low birth weight on the expression of cytokine genes in spleen and thymus of piglets and the nutritional effects of arginine
2.5 低出生重对仔猪脾脏和胸腺免疫相关基因表达的影响及精氨酸的营养效应

表 7所示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪脾脏TLR2、NF-κBp38 MAPKMyD88的表达量显著降低(P < 0.05),Ⅲ组仔猪脾脏NF-κB表达量显著降低(P < 0.05),Ⅱ组仔猪胸腺p38 MAPKMyD88表达量显著降低(P < 0.05),Ⅱ组仔猪胸腺NF-κB表达量有降低的趋势(P=0.09),Ⅲ组仔猪胸腺TLR4、NF-κBp38 MAPKMyD88表达量显著降低(P < 0.05);与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏p38 MAPK表达量有提高的趋势(P=0.08),胸腺TLR4表达量有降低的趋势(P=0.06)。

表 7 低出生重对仔猪脾脏和胸腺免疫相关基因表达的影响及精氨酸的营养效应 Table 7 Effects of low birth weight on the expression of immune related genes in spleen and thymus of piglets and the nutritional effects of arginine
2.6 低出生重对仔猪脾脏和胸腺精氨酸代谢基因表达的影响及精氨酸的营养效应

表 8所示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪脾脏iNOS表达量有降低的趋势(P=0.07),Ⅱ组仔猪脾脏ARG1表达量有提高的趋势(P=0.09),Ⅲ组仔猪脾脏iNOS(P=0.08)和ARG2(P=0.07)表达量有降低的趋势,Ⅱ组仔猪胸腺ARG2表达量显著降低(P < 0.05),Ⅱ组仔猪胸腺iNOS表达量有降低的趋势(P=0.07),Ⅲ组仔猪胸腺iNOSARG1和ARG2表达量显著降低(P < 0.05),Ⅲ组仔猪胸腺eNOS表达量有降低的趋势(P=0.06);与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏和胸腺iNOSeNOSARG1和ARG2表达量无显著差异(P>0.10)。

表 8 低出生重对仔猪脾脏和胸腺精氨酸代谢基因表达的影响及精氨酸的营养效应 Table 8 Effects of low birth weight on the expression of arginine metabolism genes in spleen and thymus of piglets and the nutritional effects of arginine
3 讨论 3.1 低出生重对仔猪生长性能的影响及精氨酸的营养效应

低出生重导致仔猪生长性能下降,给养猪产业带来负面影响。He等[23]研究结果表明,与正常出生重仔猪相比,IUGR仔猪21日龄断奶体重和ADG显著降低。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪末重、ADG、ADFI和F/G显著降低,本研究结果与前人研究结果一致,说明低出生重降低仔猪生长性能。精氨酸是幼龄哺乳动物生长的必需氨基酸,研究发现猪乳中精氨酸含量较低[13],单头7日龄的仔猪每天精氨酸需要量为2.7 g,而猪乳只能提供1.06 g[14]。哺乳仔猪7~14日龄期间血液循环中精氨酸及其前体瓜氨酸、鸟氨酸的含量显著降低[11-12],Kim等[15]在哺乳仔猪配方乳中添加适量精氨酸,显著提高了仔猪血浆精氨酸含量和生长性能。Wang等[22]在7日龄IUGR仔猪饲粮中添加0.6%精氨酸,显著提高了IUGR仔猪的生长性能。本研究结果表明,与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪末重、ADG和ADFI显著提高,F/G有降低的趋势,本研究结果与前人研究结果一致,说明精氨酸可以促进低出生重仔猪的生长发育。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅲ组仔猪末重、ADG和ADFI显著降低,说明本研究中,饲粮精氨酸添加还未能使低出生重仔猪生长性能达到正常出生重仔猪的水平。

3.2 低出生重对仔猪脏器指数的影响及精氨酸的营养效应

仔猪脏器指数是其主要的生物学特性指标之一,该指标的高低一定程度上可以反映其功能的大小。Wiyaporn等[25]研究结果表明,与同日龄的正常出生重仔猪相比,初生和7日龄的低出生重仔猪肝脏、脾脏和肾脏指数均无显著差异。Hu等[8]研究结果表明,28日龄的IUGR仔猪与正常出生重仔猪相比,心脏、肝脏、脾脏和肾脏指数无显著差异。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和腹股沟淋巴结指数无显著差异,本研究结果与前人研究结果一致,说明低出生重对仔猪脏器发育无显著影响。Tan等[16]研究表明,饲粮添加0.2%和0.8%精氨酸使14日龄仔猪脾脏指数分别提高32%和14%,饲粮添加0.6%精氨酸使其胸腺指数提高150%。本研究结果表明,与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏指数显著提高,胸腺指数有提高的趋势,本研究结果与前人研究结果一致,说明精氨酸促进低出生重仔猪脾脏和胸腺的发育。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅲ组仔猪胸腺指数和腹股沟淋巴结指数显著提高,说明本研究中,饲粮添加精氨酸使低出生重仔猪胸腺发育达到了正常出生重仔猪的水平。

3.3 低出生重对仔猪血清免疫球蛋白含量的影响及精氨酸的营养效应

血清免疫球蛋白是介导仔猪体液免疫的主要抗体,其中IgG含量最高。钟翔[9]研究结果表明,7日龄IUGR仔猪与正常出生重仔猪相比,血清IgG含量降低20.8%。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪血清IgG含量显著降低,本研究结果与前人研究结果一致,说明低出生重降低仔猪体液免疫功能。精氨酸添加量影响低出生重仔猪血清免疫球蛋白的分泌。范苗[26]研究结果表明,饲粮每天添加250、375和500 mg/kg精氨酸使21日龄仔猪血清IgA含量分别提高33.33%、58.10%和33.33%,仅有每天添加250 mg/kg精氨酸使血清IgG含量提高17.68%。Tan等[16]研究结果表明,饲粮添加0.6%~0.8%精氨酸使14日龄仔猪血清IgM含量提高150%~200%,添加0.4%~0.8%精氨酸使21日龄仔猪血清IgM含量提高62%~91%;仅有添加0.2%精氨酸使21日龄仔猪血清IgG含量提高12%,高于0.2%的添加量不能使其进一步提高。本研究结果表明,与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪血清IgA含量显著提高,血清IgM含量有提高趋势,本研究结果与前人研究结果一致,说明精氨酸通过促进免疫球蛋白的分泌,提高仔猪体液免疫功能,但精氨酸的最佳添加量有待进一步研究。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅲ组仔猪血清IgA和IgM含量显著提高,血清IgG含量显著降低,说明本研究中,饲粮添加精氨酸使低出生重仔猪血清IgA和IgM含量达到了正常出生重仔猪的水平。

3.4 低出生重对仔猪脾脏和胸腺细胞因子基因表达的影响及精氨酸的营养效应

细胞因子主要是由免疫细胞[如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞及自然杀伤(NK)细胞等]经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质,是免疫系统重要的组成部分。TNF-α由肥大细胞、巨噬细胞和T细胞分泌,可募集嗜中性粒细胞和巨噬细胞到感染部位,增强对病原体的清除能力[27-28]。IL-10由Th2细胞、巨噬细胞和肥大细胞这3种免疫细胞分泌[29],具有抑制Th1细胞活化的作用[30]。TGF-β1由T细胞和单核细胞分泌,具有干预naive T细胞的分化,抑制巨噬细胞激活和效应性T细胞增殖,降低促炎细胞效应的作用[31]。IL-2主要由Th1细胞分泌,具有诱导细胞毒性T细胞、巨噬细胞和NK细胞活化的功能[32]。有研究结果表明,与同日龄正常出生重仔猪相比,初生IUGR仔猪血清IL-10含量显著降低,血清TNF-α含量有降低的趋势,回肠TNF-α含量以及IL-10和TNF-α表达量显著降低[33],7和21日龄IUGR仔猪血清IL-10含量显著降低[7, 27]。也有研究结果表明,与同日龄正常出生重仔猪相比,初生IUGR仔猪结肠IL-6基因表达量显著提高[28],19日龄IUGR仔猪小肠近端TNF-α表达量显著提高[34]。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪脾脏IL-10、TNF-αTGF-β1的表达量显著降低,胸腺IL-2表达量有提高的趋势,本研究结果与前人研究结果一致,说明低出生重影响仔猪细胞因子的表达,但在不同组织所得到的结果会有不同。仔猪脾脏和胸腺富含T细胞,T细胞主要介导细胞免疫,对细胞因子分泌的调节也具有重要的作用。林燕等[6]研究结果表明,与正常出生重仔猪相比,1日龄IUGR仔猪CD4+CD8+T细胞(双阳性细胞)占胸腺总T细胞的比例显著低于正常出生重仔猪。Dong等[33]研究结果表明,与初生正常出生重仔猪相比,IUGR仔猪血液中的CD4/CD8值显著降低,脾脏CD8水平显著提高,胸腺CD4表达量显著提高。目前关于低出生重仔猪脾脏和胸腺T细胞的研究较少,细胞因子分泌异常与T细胞的关系需要进一步的研究。曲红焱[17]研究结果表明,饲粮添加精氨酸提高环磷酰胺导致的仔猪血清IFN-γ含量的降低。韩杰[18]研究结果表明,饲粮添加精氨酸显著改善环磷酰胺导致的仔猪血中白细胞数量、淋巴细胞比例和IFN-γ含量的降低。IFN-γ主要由Th1细胞分泌,能够激活巨噬细胞,具有高度生物学活性,且具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用,IFN-γ基因在转录水平受到严格的调控[35]。本研究结果表明,与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏IFN-γ表达量显著提高,胸腺IL-10和TGF-β1表达量有降低的趋势,本研究结果与前人研究结果一致,说明饲粮添加精氨酸改善了低出生重仔猪脾脏细胞因子的表达。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏IFN-γ表达量显著提高,TGF-β1表达量显著降低,胸腺IL-10表达量显著降低,胸腺IL-1βIL-6表达量有降低的趋势,说明本研究中,饲粮添加精氨酸改善了低出生重仔猪脾脏IFN-γ和胸腺IL-2的表达。

3.5 低出生重对仔猪脾脏和胸腺免疫相关基因表达的影响及精氨酸的营养效应

Toll样受体是一类模式识别受体,可以识别病原体相关分子模式,并激活NF-κB和MAPK信号途径,在机体的免疫防御中发挥重要的作用。TLR2是Toll样受体中的一种,可识别肽聚糖、脂肽和脂蛋白等病原相关分子模式,还可以与其他Toll样受体形成异源二聚体识别TLR2的配体,属于MyD88依赖型,TLR2识别其配体后,胞内区Toll样受体与接头分子MyD88结合,并与白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)等分子相互作用,激活NF-κB,引起多种与免疫有关的细胞因子分泌,如IL-2、TNF-α和IFN-γ等[36]。p38 MAPK属于MAPK家族,活化的p38 MAPK可激活转录激活因子-2(ATF-2)、活化T细胞核因子(NF-AT)及NF-κB等转录因子,从而促进IFN-γ的分泌[37]。Zhong等[7]研究结果表明,与正常出生重仔猪相比,7日龄IUGR仔猪空肠和回肠NF-κB蛋白含量显著降低。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪脾脏TLR2、NF-κBMyD88和p38 MAPK表达量显著降低,胸腺p38 MAPKMyD88表达量显著降低,胸腺NF-κB表达量有降低的趋势,本研究结果与前人研究结果一致,说明低出生重仔猪脾脏和胸腺NF-κB和p38 MAPK信号途径受损。精氨酸可以调节免疫相关信号途径,改善仔猪免疫功能。Chen等[19]研究结果表明,仔猪饲粮添加精氨酸抑制脾脏、肝脏、腹股沟淋巴结TLR4-MyD88信号通路的过度激活缓解免疫应激。Li等[20]研究结果表明,饲粮添加精氨酸抑制肝脏TLR4-NF-κB信号途径,缓解大肠杆菌造成的损伤。本研究结果表明,与Ⅱ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏p38 MAPK表达量有提高的趋势,胸腺TLR4表达量有降低的趋势,本研究结果与前人研究结果一致,说明精氨酸对低出生重仔猪脾脏和胸腺免疫相关基因表达有调节作用,但是否可以通过提高p38 MAPK表达量改善低出生重仔猪脾脏免疫功能,有待进一步研究。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏NF-κB表达量显著降低,胸腺TLR4、NF-κBp38 MAPKMyD88表达量显著降低,说明本研究中,饲粮添加精氨酸使低出生重仔猪脾脏TLR2、TLR2、MyD88和p38 MAPK表达量达到了正常出生重仔猪的水平。

3.6 低出生重对仔猪脾脏和胸腺精氨酸代谢基因表达的影响及精氨酸的营养效应

一氧化氮是一种重要的内源性信使分子,参与体内的免疫调节。精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成一氧化氮,是体内一氧化氮生成的唯一途径[38]。NOS有2种重要的亚型,其中eNOS参与生理水平一氧化氮的生成,细菌内毒素、IL-1β及TNF-α等可诱导iNOS的生成,产生大量的一氧化氮[39]。精氨酸酶催化精氨酸生成鸟氨酸和尿素,是体内另外一条利用精氨酸的途径,精氨酸酶可竞争性抑制NOS的活性[39]。精氨酸酶有2种亚型,ARG1主要在肝脏中表达而ARG2在多种组织有不同程度的表达[40]。NOS和精氨酸酶受到Th1和Th2型细胞因子的调节,Th1型细胞因子诱导NOS的表达,Th2型细胞因子诱导精氨酸酶的表达[39]。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组仔猪脾脏iNOS表达量有降低的趋势,脾脏ARG1表达量有升高的趋势,胸腺iNOS表达量有降低的趋势,胸腺ARG2表达量显著降低,说明低出生重降低了仔猪胸腺对精氨酸的催化利用。饲粮添加精氨酸可以调节精氨酸在体内的代谢过程[41-42]。Huang等[43]研究结果表明,饲粮添加0.8%精氨酸显著提高14日龄仔猪十二指肠黏膜一氧化氮含量和21日龄仔猪空肠黏膜NOS活性和血浆鸟氨酸含量;饲粮添加0.4%精氨酸显著提高21日龄仔猪血浆鸟氨酸含量和空肠黏膜精胺含量。本研究结果表明,与低出生重仔猪相比,饲粮添加精氨酸对仔猪脾脏和胸腺ARG1、ARG2、iNOSeNOS表达量均无显著影响,本研究结果与前人研究结果不一致,原因可能是添加剂量、添加时间以及试验条件的不同。本研究结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅲ组仔猪脾脏iNOSARG2表达量有降低的趋势,胸腺iNOSARG1和ARG2表达量显著降低,胸腺eNOS表达量有降低的趋势,说明本研究中,饲粮添加精氨酸未能改善低出生重仔猪胸腺精氨酸代谢基因表达。

4 结论

① 与正常出生重仔猪相比,低出生重仔猪生长性能显著降低,血清IgG含量显著降低,脾脏IL-10、TNF-αTGF-β1、TLR2、NF-κBp38 MAPKMyD88表达量显著降低,胸腺p38 MAPKMyD88和ARG2表达量显著降低。

② 饲粮添加1.0%精氨酸显著提高了低出生重仔猪生长性能、血清IgA含量、脾脏指数和脾脏IFN-γ表达量。

③ 饲粮添加1.0%精氨酸有改善低出生重仔猪免疫功能的作用,部分指标可达到正常出生重仔猪的水平。

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