在现代化养猪业中，早期断奶仔猪容易受到饲养环境中的一系列不良因素的影响，如细菌、病毒等的刺激，从而发生免疫应激。在免疫应激状态下，免疫系统会产生大量的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1等，会导致组织(如肠道和肝脏)的损伤[1]，并最终导致动物生长性能下降。因此，通过营养调控手段(如添加脂肪酸和氨基酸)减少炎性介质的过量释放，对缓解仔猪免疫应激具有重要意义。
传统营养学认为天冬酰胺(Asn)是一种非必需氨基酸，但有研究表明，Asn在调节机体免疫功能方面具有重要作用[2]。Wu等[3]认为Asn是一种精氨酸(Arg)家族氨基酸，其在体内可以通过脱氨基和转氨基等一系列作用途径生成Arg和谷氨酰胺(Gln)，而Arg和Gln在调节机体组织功能、缓解炎症方面发挥重要的作用。本实验室前期的研究也表明，Asn可以缓解脂多糖(LPS)刺激导致的仔猪免疫应激和组织损伤[4]，而且可以改善LPS刺激仔猪受损肝脏的能量代谢[5]。下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴可以调节许多生理过程，如免疫、生育和机体的应激反应等[6]，在机体应激和感染中扮演着重要的角色[7]。LPS可以刺激外周免疫细胞产生大量的炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6等[8]。而这些炎性细胞因子含量的升高会促使HPA轴活化，从而引起免疫应激反应[9-10]。而通过降低炎性细胞因子的营养调控方式可能有利于减轻由LPS刺激诱导的免疫应激[11]。因此，鉴于本实验室先前的研究结果，推测在猪的饲粮中添加适量的Asn，可能会缓解由LPS诱导的HPA轴炎症反应，从而缓解机体应激。
Toll样受体4(TLR4)是机体固有免疫的一个重要组成部分，其与髓样分化蛋白88(MyD88)相互作用可启动核转录因子-κB(NF-κB)活化，后者可刺激炎性基因的表达，促进炎性细胞因子生成。同样的，核苷酸结合寡聚域受体(NOD)1和NOD2也可以激活炎性细胞因子的释放。这些炎性细胞因子可以防止病原菌的入侵，但也可以导致宿主组织的损伤以及神经内分泌的紊乱。HPA轴在机体应激和感染中扮演着重要的角色，LPS刺激可以激活HPA轴中TLR4和NOD炎症信号通路，从而导致炎性因子如TNF-α分泌量升高[12]。先前的研究表明，饲粮中添加鱼油可以通过抑制断奶仔猪HPA轴中TLR4和NOD炎症信号通路，降低炎性因子的分泌，从而缓解LPS刺激所导致的仔猪免疫应激反应[12]。但Asn对HPA轴TLR4和NOD信号通路的影响至今还未见报道。因此，本试验研究了Asn对LPS刺激断奶仔猪的生长性能和HPA轴TLR4和NOD信号通路的影响，旨在为缓解仔猪免疫应激提供一定的理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料Asn：有效成分>99.4%，购自武汉阿米诺科技有限公司。
1.2 试验动物与设计试验选取24头健康的(21±2)日龄“杜×长×大”断奶仔猪[平均体重(8.12±0.56) kg]，按体重相近原则随机分为4组，分别为：1)对照组(基础饲粮)；2)LPS组(基础饲粮+LPS)；3)LPS+0.5% Asn组(基础饲粮+0.5%Asn+LPS)；4)LPS+1.0% Asn组(基础饲粮+1.0% Asn+LPS)。每组6个重复，每个重复1头猪，试验期为20 d。基础饲粮用丙氨酸进行等氮处理。试验第20天，LPS组、LPS+0.5% Asn组和LPS+1.0% Asn组的试验猪注射100 μg/kg BW的LPS(大肠杆菌血清型055 : B5，美国Sigma公司)，对照组则注射等量的生理盐水。
1.3 试验饲粮饲粮配制参照NRC(1998)仔猪的营养需要，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
动物饲养试验在动物营养与饲料科学湖北省重点实验室进行。试验前清扫、冲洗栏舍，先用2%氢氧化钠(NaOH)溶液冲洗栏舍，再用1 : 200的百毒杀稀释液喷洒猪舍，最后用福尔马林和高锰酸钾熏蒸数小时，净化1周。试验仔猪饲养在1.80 m×1.10 m不锈钢饲养笼中，饲养期间猪舍温度保持在25 ~27 ℃，每天光照12 h，自由通风，自由采食和饮水。
1.5 样品采集与处理试验期每天记录仔猪的采食量，并分别在试验第1天和第19天对试验猪进行空腹12 h称重，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。试验第19天，在注射LPS或生理盐水前12 h，禁食，注射4 h后，屠宰全部试验猪，并取出下丘脑、垂体及肾上腺，用冰生理盐水冲洗后置于速冻管，并立即放入液氮进行速冻，-80 ℃冻存待测。
1.6 检测指标及方法将组织样品溶解于装有1mL RNAiso Plus试剂(TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司)的离心管中，放置冰上匀浆后，按说明书进行样品总RNA提取。
cDNA合成按照PrimeScript® RT reagent kit with gDNA eraser[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]规定的步骤完成。反转录体系为：4 μL 5×PrimeScript® Buffer，1 μL PrimeScript® RT enzyme mix，1.0 μL RT primer mix，10 μL DNAase处理RNA，加RNase freed dH2O至20 μL。反转录参数：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃至结束。
实时荧光定量PCR按照SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)[real-time PCR试剂盒，TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]方法步骤完成。20 μL反应体系是由10.0 μL SYBR® Premix Ex TaqTM(2×)、0.4 μL ROX reference dye Ⅱ(10×)、2.0 μL cDNA、6.8 μL RNase freed dH2O、0.4 μL上游引物(10 μmol/L)、0.4 μL下游引物(10 μmol/L)组成。使用ABI 7500 Real-time PCR仪(Applied Biosystems公司)进行扩增，PCR反应条件为95 ℃ 30 s, 随后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，进行40个循环。内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)，并采用2-△△CT方法分析基因相对表达量[13]。
利用Primer Premier 5.0软件设计试验所用特异性引物，并由宝生物工程(大连)有限公司合成，相关基因的引物序列见表 2。
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表 2 基因的引物序列 Table 2 Primer sequences of genes |
试验数据采用SPSS 22.0统计软件进行独立样本t检验和回归分析。t检验分别用于LPS组与对照组相比较，以确定LPS刺激的效果；以及LPS组与LPS+0.5% Asn组相比较和LPS组与LPS+1.0% Asn组相比较，以确定添加Asn对LPS仔猪的影响。线性和二次曲线回归分析，用来确定饲粮中添加不同水平(0、0.5%、1.0%)的Asn对LPS刺激仔猪的影响。统计数据采用平均值和均值标准误(SEM)表示。以P≤0.05为差异显著标准0.05＜P≤0.10为具有显著性趋势。
2 结果 2.1 Asn对LPS刺激断奶仔猪生长性能的影响由表 3可知，与对照组相比，LPS刺激以及饲粮中添加Asn对LPS刺激断奶仔猪的生长性能没有显著影响(P>0.05)。
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表 3 Asn对LPS刺激断奶仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of Asn on growth performance of weaned piglets challenged by LPS |
由表 4可知，与对照组相比，LPS可以显著提高下丘脑中TLR4、MyD88、NOD2、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(RIP2)和NF-κB的mRNA表达量(P＜0.05)。饲粮中添加Asn可以显著降低下丘脑中NF-κB的mRNA表达量(线性，P＜0.05)，有降低下丘脑中白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的mRNA表达量的趋势(线性，P＜0.10)。
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表 4 Asn对LPS刺激断奶仔猪下丘脑中TLR4和NOD信号通路关键基因mRNA表达的影响 Table 4 Effects of Asn on key genes mRNA expression in TLR4 and NOD signaling pathways in hypothalamus of weaned piglets challenged by LPS |
由表 5可知，与对照组相比，LPS可以显著提高垂体中TLR4、MyD88、NOD1、NOD2、RIP2、NF-κB和TNF-α的mRNA表达量(P＜0.05)。饲粮中添加Asn可以显著降低垂体中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的mRNA表达量(二次，P＜0.05)，提高了垂体中NOD1的mRNA表达量(线性，P＜0.10；二次，P＜0.05)。
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表 5 Asn对LPS刺激断奶仔猪垂体中TLR4和NOD信号通路关键基因mRNA表达的影响 Table 5 Effects of Asn on key genes mRNA expression in TLR4 and NOD signaling pathways in pituitary gland of weaned piglets challenged by LPS |
由表 6可知，与对照组相比，LPS可以显著提高肾上腺中TLR4、MyD88、IRAK1、NOD2、RIP2、NF-κB和TNF-α的mRNA表达量(P＜0.05)。饲粮中添加Asn有降低肾上腺中TLR4和NOD2的mRNA表达量的趋势(线性，P＜0.10)，显著增加了肾上腺中RIP2的mRNA表达量(线性，P＜0.05；二次，P＜0.05)。
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表 6 Asn对LPS刺激断奶仔猪肾上腺中TLR4和NOD信号通路关键基因mRNA表达的影响 Table 6 Effects of Asn on key genes mRNA expression in TLR4 and NOD signaling pathways in adrenal gland of weaned piglets challenged by LPS |
免疫应激在养猪生产中普遍存在，是导致猪生长抑制的重要因素之一，给养猪生产造成很大的经济损失。免疫应激是由于饲养环境中的病原体或非病原体(如细菌、病毒和内毒素等)或疫苗接种等应激猪的免疫系统所致[14]。在免疫应激高度激活状态下，会导致炎性细胞因子过量分泌，从而产生免疫应激问题。传统的观点认为，炎性细胞因子主要由免疫系统产生。然而近几年的研究发现，神经内分泌系统、胃肠道、肝脏、肌肉和脂肪等组织也能分泌炎性细胞因子[15-17]。这些细胞因子通过对靶组织的直接作用或通过作用于神经内分泌系统，引起动物一系列行为和代谢上的改变，最终导致动物生长迟缓和胴体品质下降[14]。因此，采取一定措施适度调节应激动物过度的免疫反应，尤其是炎性细胞因子的过量产生对缓解免疫应激有重要作用。
近年来，通过营养调控来缓解免疫应激已成为动物营养学的重要研究方向。国内外学者和项目组在这方面进行了一系列的研究，发现n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、Arg和共轭亚油酸等营养素均可缓解猪的免疫应激[15-19]。然而，由于免疫应激的调控机制尚不清楚，使得营养调控措施针对性不强。
Toll样受体(TLRs)属于模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)家族，可通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，在抗菌和激活机体固有免疫反应中发挥关键作用[20-21]。TLRs家族中的TLR4可以识别LPS进而介导机体的炎症反应，主要是通过TLR4传递由MyD88、IRAK1和TRAF6级联传递的信号，并最终触发NF-κB的激活，活化的NF-κB刺激炎性基因的表达，促进促炎性细胞因子生成等。近年来发现，许多疾病的发病机制与TLRs信号通路的过度激活密切相关[22]。TLR4信号通路的激活也是导致猪免疫应激的重要原因[15-18]。因此，有效抑制TLR4信号通路，对缓解仔猪免疫应激具有很重要的实际意义。在本试验中，与对照组相比，LPS提高了下丘脑、垂体、肾上腺中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达量及肾上腺中IRAK1的mRNA表达量，表明LPS刺激导致了下丘脑、垂体和肾上腺TLR4信号通路的激活。而饲粮中添加Asn降低了下丘脑中IRAK1、肾上腺中TLR4和垂体中TRAF6的mRNA表达量，这说明Asn可能抑制了肾上腺TLR4上游信号通路，但对下丘脑和垂体，则是抑制了其TLR4下游信号通路。有研究表明，Arg能缓解LPS刺激导致的断奶仔猪肝脏中TLR4的mRNA表达量增加[23]，而Asn是作为一种Arg家族氨基酸，其在体内可以通过脱氨基和转氨基等一系列作用途径生成Arg[2]，因此，我们推测Asn可能在体内通过转化为Arg后，抑制HPA轴TLR4及其下游相关基因的表达，从而缓解LPS刺激导致的HPA轴炎症反应。此外，本试验结果表明，饲粮中添加Asn对垂体中TRAF6的mRNA表达量呈现二次趋势，即添加0.5%的Asn比添加1.0%的Asn可以更好地抑制垂体中TLR4受体信号通路下游基因的表达。先前的研究表明，Asn可以通过降低肝脏中TLR4、IRAK1、TRAF6、NOD1、NOD2的mRNA表达量，从而缓解了LPS诱导的肝脏受损[24]，并改善了LPS诱导的损伤肠道的完整性[25]。因此，本研究结果表明，Asn可能通过降低IRAK1、TLR4和TRAF6的mRNA表达量，从而缓解了LPS诱导的HPA轴的炎症反应。
除了TLR4信号通路之外，另一个PRR家族，即核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(NODs)，在识别PAMPs和调节宿主天然免疫反应中也起着关键作用[20-21]，但目前对NOD的研究，主要集中在NOD1和NOD2。与TLR4类似，NOD1和NOD2也可以通过衔接分子RIP2激活NF-κB，导致促炎细胞因子基因mRNA的转录上调[21]。为了防止NOD信号通路的过度激活，使机体维持相对稳态，机体也存在NOD1和NOD2的负调控因子，适时终止NOD信号通路。目前已发现许多NOD1和NOD2的负调控因子，如Erbb2互作蛋白(ERBB2IP)和矢车菊苷β1(ACAP1)等[26-27]。在本试验中，与对照组相比，LPS刺激提高了下丘脑中NOD2、RIPK2、NF-κB，垂体中NOD1、NOD2、RIP2、NF-κB，肾上腺中NOD2、RIPK2、NF-κB的mRNA表达量，表明LPS刺激导致了NOD信号通路的激活。而饲粮中添加Asn降低了肾上腺中NOD2和下丘脑中NF-κB的mRNA表达量。但饲粮中添加Asn也同时提高了肾上腺中RIP2的mRNA表达量，且饲粮中添加Asn还有提高肾上腺中NF-κB的mRNA表达量的趋势。皮定安[28]研究发现，LPS刺激降低了肝脏ACAP1的mRNA表达量。这表明，LPS刺激造成过度炎症反应的同时会降低部分负调控因子的表达。同理，饲粮中Asn的添加水平过高也可能会抑制NOD信号通路中的负调控因子的表达，从而导致NF-κB的mRNA表达量升高。RIP2是NODs信号通路上游因子，是NOD1和NOD2与下游因子NF-κB之间的衔接因子。在本研究中，饲粮中添加Asn虽然提高了肾上腺中RIP2的mRNA表达量，但对下游因子NF-κB的mRNA表达量基本没有影响。
4 结论Asn虽然对LPS刺激仔猪的生长性能没有产生显著影响，但其可通过降低下丘脑中NF-κB的mRNA表达量而对下丘脑TLR4信号通路具有一定的抑制作用。
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