2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
甲烷的排放与全球气候变暖密切相关。有研究表明,动物产生的甲烷、二氧化碳等占温室效应气体的18%,其中反刍动物甲烷排放量占动物甲烷排放量的30%,而甲烷的温室效应是二氧化碳的20~30倍[1]。因此,反刍动物的甲烷排放成为当今研究的热点及重点。反刍动物产生甲烷的主要途径是瘤胃发酵和肠道发酵,其中瘤胃发酵产生的甲烷占总产量的90%[2]。产甲烷菌属于古细菌,参与有机物的厌氧降解,生成甲烷。据报道,甲烷是重要的能量载体,反刍动物瘤胃内甲烷的生成损耗2%~12%的饲料能量, 并且通过嗳气排入大气[3],其排放量的增加降低了饲料的利用率[4],造成饲料的浪费。由此可见,降低甲烷排放量对畜牧业和饲料行业的发展具有重要的意义。
目前对于减少反刍动物甲烷排放的研究,主要通过营养措施如改变饲粮结构[5-6],添加丙酸增强剂、油脂、单宁、皂甙等提取物[7-8]和驱原虫[9]等方式。植物源性活性物质因具有无残留的特点,所以倍受国内外学者的青睐。研究表明在饲粮中添加单宁能够显著降低反刍动物甲烷的产量[10-11]。目前已有关于在反刍动物饲粮中添加葡萄籽渣对反刍动物生长性能影响的报道[12-14],但是对于葡萄籽原花青素在反刍动物中对瘤胃发酵产甲烷菌区系的研究报道较少。本试验通过在体外发酵试验中添加不同剂量的葡萄籽原花青素,研究其对奶牛瘤胃发酵产甲烷菌区系的影响,为其作为反刍动物饲料添加剂提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料葡萄籽原花青素购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司,含花青素单聚体18.4%、二聚体20.4%、三聚体15.2%、四聚体14.1%、低聚体(5~13个单位)28.5%、酚醛类物质4.3%。
1.2 瘤胃液收集选用4头健康荷斯坦瘘管奶牛,饲喂精粗比为40 : 60的全混合日粮,收集晨饲前的瘤胃内容物,混合后在39 ℃水浴环境下经4层纱布过滤,装于保温瓶迅速带回实验室,操作应在尽量短的时间内完成[15]。
1.3 试验设计试验采用单因素6水平试验设计,均以500 mg全混合日粮作为发酵底物,置于150 mL厌氧发酵瓶中,分别添加0(对照,样品A1、A2、A3),0.1(样品B1、B2、B3),0.2(样品C1、C2、C3),0.3(样品D1、D2、D3),0.4(样品E1、E2、E3),0.5 g/kg(样品F1、F2、F3)的葡萄籽原花青素,每组3个重复。接种时迅速在每瓶中加入预热的缓冲液50 mL和4层纱布过滤的新鲜瘤胃液25 mL,并向瓶中持续通入CO2 5 s后,立即加上瓶塞,并将每个发酵瓶与产气装置的每个传感器相连接,于39 ℃下连续培养24 h,试验重复3次。
1.4 发酵液样品、产气量和甲烷产量的测定待培养瓶在体外培养24 h后,将培养瓶取出放入冰水浴中停止发酵。将发酵液置于50 mL离心管中,立即测定发酵液的pH。发酵液的挥发性脂肪酸(VFA)浓度、产气量和甲烷产量测定参照杨德莲等[16]的方法。
1.5 基因组DNA提取通过珠磨-十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[17]提取发酵液中总DNA。提取的总DNA溶于无菌的TE缓冲液中,用微量紫外可见光分光光度计测定总DNA浓度和纯度,-20 ℃贮存。
1.6 荧光定量PCR扩增与Illumina MiSeq测序对微生物基因组16S rDNA古菌V3~V4区进行扩增,引物为F344(5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′)和R806(5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)。每个样本的引物5′端加bar-code序列。PCR扩增采用Promega PCR mix进行,PCR反应体系:12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix,3 μL牛血清白蛋白(BSA)(2 ng/μL),2 μL引物(5 μmol/L),2 μL模板DNA和5.5 μL ddH2O。反应参数:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性45 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸45 s,32个循环;72 ℃延伸10 min。每个样品做3个平行PCR反应,并使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物。PCR产物纯化后送至奥维森公司进行PCR产物定量、DNA序列修饰、文库构建及Illumina MiSeq PE300平台测序。
1.7 数据处理与生物信息学分析通过Illumina MiSeq平台进行Paired-end测序,下机数据经过QIIME(version1.8.0)软件过滤、拼接、去除嵌合体,去除打分低于20、碱基模糊、引物错配或测序长度小于150 bp的序列。对获得的序列(clean reads)进行拼接并去除引物,并计算菌群丰富度指数(Chao1指数)、覆盖指数及多样性指数(Shannon和Simpson指数)[18]。根据barcodes规类各组序列信息聚类为用于物种分类的操作分类单元(OUTs),OTUs相似性设置为97%。再利用Mothur软件(version 1.31.2)去掉长度较小的tags[19]。OTUs聚类分析和注释通过与Ribosomal Data-base Project(RDP)数据库中的古菌序列进行比对,基于Weighted Unifrace距离,使用R(version 3.1.1)软件包的pheatmap进行聚类分析。经过UniFrac算法利用系统进化的信息来比较样品间物种群落差异,并进行β多样性(β diversity)分析。细菌聚类分析到门和属水平,产甲烷菌分类到属水平,丰度图采用Excel 2010软件制作。
1.8 统计分析所有数据均采用SAS 8.02软件的GLM程序进行单因素方差分析,多重比较采用Duncan氏法,P < 0.05为差异显著性判定标准。
2 结果 2.1 添加葡萄籽原花青素对瘤胃体外发酵液的产气量、甲烷产量及挥发性脂肪酸浓度的影响如表 1所示,与对照组相比,添加葡萄籽原花青素可显著升高发酵液的pH(P < 0.05);当葡萄籽原花青素添加量为0.2 g/kg时,24 h甲烷产量显著降低(P < 0.05);当葡萄籽原花青素添加量为0.3 g/kg时,24 h总产气量显著降低(P < 0.05);添加葡萄籽原花青素对发酵液的总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、戊酸浓度和乙酸/丙酸均无显著影响(P>0.05);当葡萄籽原花青素添加量为0.4和0.5 g/kg时,发酵液的丁酸和异戊酸浓度显著降低(P < 0.05);当葡萄籽原花青素添加量为0.2 g/kg时,发酵液的异丁酸浓度显著提高(P < 0.05)。
通过Illumina MiSeq高通量测序后,本试验中18个样品共获得1 279 993条高质量产甲烷菌16S rRNA基因序列,每个样品的平均序列数为71 110。以97%序列相似性为阈值,共归为491个OUTs。样品覆盖指数表明试验所得OUTs代表了瘤胃中98%的产甲烷菌,满足后续分析;本试验样本的稀释曲线见图 1,如图所示,在试验测序深度下,所有样品的稀释曲线最终均趋于平缓,表明每个样本的测序量合理,能较好地反映各组瘤胃液中菌群结构和种类的多样性。
α多样性反映了单个样本内部物种的多样性,物种观察指数、Chao1指数反映样品中群落的丰富度(species richness);Shannon指数以及Simpson指数反映群落的多样性。由表 2可知,产甲烷菌平均Shannon指数为4.72,平均Chao1指数为304.9,各组间各指标无显著差异(P>0.05),但各添加葡萄籽原花青素组与对照组相比,物种观察指数和Shannon指数具有升高的趋势,说明葡萄籽原花青素影响了样品中的物种丰富度及多样性。
β多样性的主成分分析结果展示菌群之间的相似度。各添加葡萄籽青花素组和对照组样品β多样性的主成分分析见图 2。基于UniFrac的加权主成分分析其主成分1(PC1)的贡献率为23.93%,主成分2(PC2)的贡献率为18.09%,可以较好地将对照组与葡萄籽花青素组分开,而0.3和0.5 g/kg组的每个样品之间相似度更接近。
研究葡萄籽原花青素对奶牛瘤胃发酵中产甲烷菌区系的影响,添加不同剂量的葡萄籽原花青素在门、科、属水平上对产甲烷菌的菌群组成如表 3所示。在门水平上产甲烷菌都属于广古菌门(Euryarchaeota),在科水平上大部分属于甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae),在属水平上则主要分布在甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、Candidatus_Methanoplasma。在门水平上,与对照组相比,添加0.3、0.4、0.5 g/kg葡萄籽原花青素显著降低了广古菌门的丰度(P < 0.05)。在科水平上,与对照组相比,甲烷杆菌科的丰度随着葡萄籽原花青素添加量的增加有降低的趋势,且在添加量为0.4 g/kg时丰度显著降低(P < 0.05);Methanomassiliicoccaceae的丰度随着葡萄籽花青素添加量的增加而有增加的趋势,添加量为0.3、0.4 g/kg时显著升高(P < 0.05)。在属水平上,与对照组相比,甲烷短杆菌属的丰度随着葡萄籽花青素添加量的增加有降低的趋势,且当添加量为0.4 g/kg时显著降低(P < 0.05),当添加量为0.5 g/kg时有升高的趋势,但仍低于对照组;甲烷杆菌属的丰度随葡萄籽花青素添加量的增加有降低的趋势,且当添加量为0.4、0.5 g/kg时其丰度显著降低(P < 0.05);Candidatus_Methanoplasma的丰度随着葡萄籽花青素添加量的增加有升高的趋势,且当添加量为0.3、0.4 g/kg时丰度显著增加(P < 0.05);甲烷球形菌属的丰度随着葡萄籽花青素添加量的增加有降低的趋势,且当添加量为0.3、0.4、0.5 g/kg时丰度显著降低(P < 0.05)。
应用皮尔森(Pearson)相关性分析方法,对瘤胃发酵指标甲烷产量与菌群结构的相关性进行研究(图 3)。Heatmap图表示的是微生物分类与环境变量比较,评估微生物分类与环境变量之间的相关性,基本输出是一个距离矩阵,表示群落中每个微生物与每个环境因子变量之间的相关系数。发酵液中乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度与甲烷微菌属(Methanomicrobium)丰度呈显著正相关(P < 0.05);而发酵液中Candidatus_Nitrososphaera、甲烷短杆菌属、甲烷球形菌属和甲烷杆菌科丰度与乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度呈显著负相关(P < 0.05),与丁酸浓度和乙酸/丙酸呈显著正相关(P < 0.05);然而Candidatus_Nitrososphaera丰度与乙酸浓度无显著相关性(P>0.05),Candidatus_Nitrososphaera和甲烷短杆菌属丰度与丁酸浓度无显著相关性(P>0.05)。而添加葡萄籽花青素后,菌群结构与甲烷产量、产气量以及pH没有显著的相关性(P>0.05)。
本研究表明,添加葡萄籽原花青素能显著降低各水平的产甲烷菌丰度。葡萄籽原花青素对瘤胃发酵具有显著的影响,还可显著降低甲烷产量[16],因此,本研究从产甲烷菌的结构及丰度变化的角度,进一步解释了葡萄籽原花青素通过影响微生物的区系及功能来调控甲烷生成的机制。邸凌峰等[20]研究发现,葡萄籽原花青素中的缩合单宁与产气量呈正相关。这与本研究结果一致,当葡萄籽花青素添加量为0.3 g/kg时,产气量达到最低。但是,本研究中,随着葡萄籽原花青素添加量的升高,并没有呈剂量依赖性的变化。据李晓鹏[21]在研究缩合单宁对体外发酵的影响中得出,单宁破坏了瘤胃中部分细菌的膜,使细菌不能正常繁殖,同时阻止了酶与底物的结合,导致产气量降低。因此,本研究中葡萄籽原花青素影响了产甲烷菌的生长环境,抑制了产甲烷菌的生长;其次,添加葡萄籽原花青素降低了产甲烷菌对其生长代谢原料的利用能力,因此降低了各个水平的产甲烷菌的丰度。王慧玲等[22]和Anantasook[23]研究发现,甲烷的产生是产甲烷菌直接作用的结果,因此降低产甲烷菌对于甲烷减排具有重要作用。由此可见,葡萄籽原花青素对瘤胃发酵及产气调控具有直接的作用。
本试验通过高通量测序分析结果表明,甲烷短杆菌属为优势产甲烷菌,与大量研究结果相一致[24-26],进一步说明甲烷短杆菌属在反刍动物前肠甲烷形成中起重要作用。而且,在属水平上甲烷短杆菌属所占的比例最大,其他3个所占比例从高排到低依次是甲烷球形菌属、Candidatus_Methanoplasma、甲烷杆菌属。这与Tajima等[27]研究结果一致,在黑白花奶牛中的产甲烷菌的主要分布在甲烷短杆菌属、甲烷球形菌属、甲烷杆菌属和甲烷八叠球菌属。据报道,Candidatus_Methanoplasma主要以甲胺类化合物或甲醇为底物生成甲烷,但不能利用二氧化碳,该菌可作为调控甲烷产量的目标菌群[28-29]。由此可见,产甲烷菌的共性与差异性决定了产甲烷菌的丰度变化,解释了不同物种瘤胃甲烷产量差异的机制。众所周知,甲烷的产生主要通过产甲烷菌利用二氧化碳作为碳源,氢离子作为主要的电子供体发酵形成。反刍动物在产生甲烷的过程中会消耗电子,减少瘤胃内的氢分压,促进产氢菌的代谢和代谢产物的生成,利于有机质的降解利用[30]。因此,了解产甲烷菌区系对瘤胃发酵及调控甲烷生成具有重要的意义。然而,瘤胃甲烷的产量又与细菌的菌群结构[31]、瘤胃体积大小[32]、品种差异[33]、饲粮的组成成分[34-35]等密切相关,因此,瘤胃甲烷调控需要多方面考虑。
据报道,产甲烷菌在瘤胃内主要参与有机物厌氧降解的最后一步,并利用发酵产生的氢生产甲烷[23, 36]。产甲烷菌主要分为5个目,目前的研究表明主要集中在4个目上,分别是甲烷杆菌目、甲烷球形菌目、甲烷八叠球菌目、甲烷微菌目[37]。据报道,水牛瘤胃内90%的产甲烷菌为甲烷短杆菌属,其次为甲烷球形菌属和热原体属,总体上与其他反刍动物瘤胃产甲烷菌区系组成相似[38];本研究中,瘤胃甲烷球形菌属所占比例在15%左右,该结果与Franzolin等[39]的报道一致。反刍动物瘤胃内的瘤胃球菌主要由黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌在纤维素分解中起主要作用。我们的前期研究结果表明,添加葡萄籽花青素对发酵液黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌丰度没有显著的影响,这可能由于体内复杂的瘤胃内环境与体外试验条件所致[16]。葡萄籽原花青素对改善奶牛泌乳性能及提高生产效益具有显著影响[13, 40]。据报道,葡萄籽原花青素对饲料转化效率[41]、氮表观消化率和留存率[42]、粗蛋白质和能量的表观消化率效果尤为显著[43]。
而本研究中,添加葡萄籽原花青素后对瘤胃产甲烷菌区系并无显著变化,不同添加量组中甲烷短杆菌属所占比例均在90%以上,并未显著影响甲烷短杆菌属在瘤胃内的主导地位。然而,在产甲烷菌群结构与甲烷产量的相关性分析中,并没有发现具有显著的相关性。因此,葡萄籽原花青素抑制甲烷的产生机制,有待进一步的探讨。随着每年全球反刍动物排放大量的甲烷,减少瘤胃内甲烷的生成对提高饲料能量利用率和改善环境具有重要意义。减少家畜体内甲烷的生成不仅可以提高动物的生长性能,而且对控制温室效应有一定作用。因此,饲粮中选择添加葡萄籽花青素对瘤胃产甲烷菌以及瘤胃内甲烷生成的调控具有显著影响,而在生产实践中具有广阔的应用前景。
4 结论饲粮中添加葡萄原花青素对产甲烷菌多样性指数没有显著影响,在门、科、属水平上的对产甲烷菌丰度均存在一定影响。
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