, CHEN Daiwen, ZHENG Ping, HE Jun, MAO Xiangbing, YU Jie, LUO Yuheng, LUO Junqiu, HUANG Zhiqing, YU Bing
养猪生产中，断奶仔猪因受生活环境变化及自身发育不完善等因素影响，常常会出现采食量降低、生长迟缓、腹泻，甚至感染疾病等诸多问题[1]。因此，研发改善仔猪生长性能和肠道健康，提高疾病抵抗力的饲料及添加剂产品是动物营养与饲料领域长期关注的热点问题。酵母菌属于兼性厌氧菌微生物，在有氧和无氧条件下均能生长繁殖，广泛分布于自然界中并具有生产成本低和富含多种营养物质的特点。在生产方式的转变和加工手段的提升后，各种酵母类产品也得到开发。例如，以酵母为载体生产的有机微量元素(酵母硒和酵母锌)[2]，通过特定培养基发酵培养的酵母培养物[3]，在内源酶和外源酶充分水解后释放多种功效成分的酵母水解物[4]等。其中，酵母水解物以核苷酸和细胞壁免疫多糖为主要成分而备受关注。核苷酸作为核酸的基本单元，在生物合成途径中传递化学能；参与细胞的构成和供能，对免疫系统和胃肠道中快速周转细胞的生长和发育有着重要作用，是体内不可缺少的重要成分[4]。细胞壁免疫多糖占酵母细胞壁净重的75%，主要包括以共价键连接的β-葡聚糖和甘露聚糖，可作为益生元对动物机体进行免疫调控，提高疾病抵抗力和维持肠道健康，促进生长[5-6]。然而，不同的酵母水解物之间因加工方式和原料不同，其所含的主要活性物质有一定区别，在动物上的应用效果不一[7-9]。目前，国内外关于酵母水解物在仔猪上的应用研究虽有报道，但因不同产品组成成分存在差异而呈现不同的应用效果。而酵母核苷酸和酵母细胞壁免疫多糖等提纯类物质的研究较多且主要集中在对畜禽生长性能和免疫功能调控上，但研究结果也尚存争议[10-13]。由此可见，酵母水解物是否会因其富含多种活性物质而对仔猪具有促生长和免疫调控作用，还有待研究。因此，本试验以断奶仔猪为对象，考察饲粮添加富含酵母核苷酸和细胞壁免疫多糖的酵母水解物对其生长性能、血清免疫和抗氧化能力及粪便菌群的影响，为酵母类产品的开发和应用积累资料提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料酵母水解物由江门天锦泰生物工程有限公司提供，风干基础，粗蛋白质含量为50.80%，主要活性物质为核苷酸和细胞壁多糖，含量分别为13.58%和11.00%。
1.2 试验设计试验采用单因子设计，选取28头平均体重为(8.02±0.39) kg、健康的(28±1)日龄“杜×长×大”(DLY)断奶仔猪，按各组体重相近原则随机分为对照组(基础饲粮)和酵母水解物组(酵母水解物等量替代基础饲粮中0.5%的去皮豆粕)。每个组14个重复，每个重复1头仔猪，单笼饲养。试验期28 d。
1.3 试验饲粮仔猪基础饲粮参照NRC(2012)7~25 kg仔猪营养需要进行设计配制，为玉米-豆粕-鱼粉-乳清粉型饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在四川农业大学动物营养研究所科研基地仔猪代谢试验舍进行。试验期间，圈舍温度维持在26 ℃左右。仔猪自由采食和饮水，每日喂料3次(08:00、14:00和20:00)。每天清扫圈舍、记录采食量、温度和腹泻情况，并定期消毒。
1.5 样品采集与处理血清样品：于试验第29天上午，空腹称重后各组选取10头接近平均体重的断奶仔猪，前腔静脉采血10 mL，静置30 min后3 500 r/min离心10 min制备血清，分装血清，-20 ℃保存待测。
直肠粪便样品：于试验第29天上午，各组选取10头接近平均体重的断奶仔猪，用无菌棉插入直肠4~5 cm处，轻轻转动棉签，刺激仔猪排便，及时收集新鲜粪样，分装于冻存管中并编号，液氮速冻后转移至-80 ℃保存待测粪便菌群。
1.6 测定指标和方法 1.6.1 生长性能分别于试验第1天和第29天08:00对所有试验猪空腹称重，计算试验猪的平均日增重(average daily gain, ADG)、平均日采食量(average daily feed intake, ADFI)和料重比(feed to gain ratio, F/G)
1.6.2 腹泻指标在试验期间，每天早晚定时观察并记录各组仔猪腹泻情况。腹泻评分标准见表 2，当腹泻评分大于或等于2分时判定仔猪腹泻。腹泻率及腹泻指数计算参照Giang等[14]计算，公式如下：
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表 2 腹泻评分标准 Table 2 The standard for diarrhea score |
采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定血清尿素氮(urea nitrogen, UN)、白蛋白(albumin, ALB)、总蛋白(total protein, TP)、葡萄糖(glucose, GLU)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量。测定方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.6.4 血清抗氧化能力指标血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、谷胱苷肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量均严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行测定。
1.6.5 血清免疫能力指标血清补体3(complement 3, C3)、补体4(complement 4, C4)含量和溶菌酶(lysozyme, LZM)活性采用上海鑫乐生物科技有限公司生产的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒进行测定，严格按照试剂盒说明操作。
1.6.6 直肠粪便菌群按照粪便DNA提取试剂盒(Omega, 美国)说明书提取直肠粪便中的DNA，利用荧光定量PCR仪(CFX96, Bio-Rad, 美国)测定其总菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和芽孢杆菌的数量。根据细菌的16S rRNA基因序列设计相应的特异性引物(表 3)。参照刁慧[15]的方法，应用Taqman探针进行荧光定量PCR，利用Real Master Mix探针[天根生化科技(北京)有限公司，中国]进行检测。大肠杆菌、乳酸杆菌和芽孢杆菌的反应体系包括：8 μL Real Master Mix、1 μL Probe Ehancer Solution、上游和下游引物各1 μL、0.3 μL探针、1 μL DNA和7.7 μL ddH2O；双歧杆菌的反应体系包括：8 μL Real Master Mix、1 μL Probe Ehancer Solution、上游和下游引物各1 μL、0.8 μL探针、1 μL DNA和7.2 μL ddH2O。采用三步法扩增标准程序：95 ℃预变性10 s，95 ℃ 5 s，50~60 ℃ 25 s，95 ℃ 10 s，共50个循环。总菌反应体系为25 μL：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL、上游和下游引物各1 μL、DNA 1 μL和ddH2O 9.5 μL。采用三步法PCR扩增标准程序：95 ℃预变性10 s，95 ℃ 5 s，50~60 ℃ 25 s，95 ℃ 10 s，熔解曲线条件为95 ℃ 39 s、55 ℃ 1 min、95 ℃ 1 min，共40个循环。以每克内容物为检测单位，计算方法参照Qi等[16]，结果用每克内容物中菌落形成单位(CFU)的常用对数[lg(CFU/g)]表示。
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表 3 实时荧光定量PCR特异性引物序列及探针 Table 3 Specific primer sequences and probes for real time PCR |
试验数据采用Excel 2013进行初步统计，然后利用SPSS 20.0统计软件对腹泻率数据进行x2检验，其余数据进行独立样本t检验分析，结果以平均值±标准误表示，P < 0.01为差异极显著，P < 0.05为差异显著，0.05≤P < 0.10为有趋势。
2 结果 2.1 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪生长性能的影响由表 4可知，与对照组相比，饲粮添加酵母水解物可极显著提高断奶仔猪ADG和ADFI(P < 0.01)，极显著降低腹泻率(P < 0.01)，有降低F/G的趋势(P=0.07)。
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表 4 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪生长性能的影响 Table 4 Effects of dietary yeast hydrolyzate on growth performance of weaned piglets (n=14) |
由表 5可知，与对照组相比，饲粮添加酵母水解物可显著降低断奶仔猪血清LDL-C含量(P < 0.05)，极显著提高血清ALB含量(P < 0.01)，有降低血清TG含量的趋势(P=0.07)，对血清UN、GLU、TC、HDL-C和TP含量无显著影响(P>0.05)。
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表 5 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪血清生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary yeast hydrolyzate on serum biochemical indices of weaned piglets (n=10) |
由6可知，与对照组相比，饲粮添加酵母水解物可分别显著和极显著提高断奶仔猪血清T-AOC (P < 0.05)和GSH-Px活性(P < 0.01)，显著降低血清MDA含量(P < 0.05)，对血清SOD活性无显著影响(P>0.05)。
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表 6 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪血清抗氧化能力的影响 Table 6 Effects of dietary yeast hydrolyzate on serum antioxidant capacity of weaned piglets (n=10) |
由表 7可知，与对照组相比，饲粮添加酵母水解物可显著增加断奶仔猪血清C3和C4含量(P < 0.05)，对血清LZM活性无显著影响(P>0.05)。
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表 7 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪血清免疫能力的影响 Table 7 Effects of dietary yeast hydrolyzate on serum immunity in serum of weaned piglets (n=10) |
由表 8可知，与对照组相比，饲粮添加酵母水解物可显著增加断奶仔猪直肠粪便中芽孢杆菌的数量(P < 0.05)，对总菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和双岐杆菌数量无显著影响(P>0.05)，可使大肠杆菌数量降低6.53%。
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表 8 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪直肠粪便菌群的影响 Table 8 Effects of dietary yeast hydrolyzate on microflora in rectal feces of weaned piglets (n=10) |
酵母水解物富含核苷酸和细胞壁免疫多糖(甘露聚糖和β-葡聚糖)等主要活性物质，对畜禽具有促生长和防腹泻的效应。Molist等[7]研究发现，饲粮添加酵母水解物可显著提高断奶仔猪饲料转化率。文超越等[8]在仔猪饲粮中添加0.5%的酵母水解物发现，与对照组相比，酵母水解物显著提高仔猪第1~14天的ADG和ADFI。另外，酵母菌中的谷氨酸盐、肌苷酸和鸟苷酸等呈味氨基酸或核苷酸在其自溶或外源酶催化水解后会得到充分释放，从而改善饲粮适口性，刺激猪的味觉器官，表现出较强的诱食特性，增加动物采食[17]。本试验发现，饲粮添加酵母水解物可显著提高断奶仔猪ADG和ADFI，有降低F/G的趋势。可见，酵母水解物对断奶仔猪生长性能具有一定的改善作用。动物生长发育与机体良好的代谢水平之间关系密切。本试验研究发现，饲粮添加酵母水解物可显著降低断奶仔猪血清LDL-C含量，极显著提高血清ALB含量，有降低血清TG含量的趋势。这可能是由于仔猪在断奶后一段时间内，无法合成足够数量的核苷酸，而富含核苷酸的酵母水解物可以作为激活糖蛋白和糖原的中介物，介导机体代谢功能来维持正常的能量平衡和蛋白质合成[18]。肝脏作为核苷酸从头合成的主要场所可以通过外源补充核苷酸来降低肝代谢压力，维持仔猪机体代谢环境的健康[19]。酵母核苷酸还是一种优质的蛋白质源，有利于仔猪体内蛋白质的合成[20]。因此，饲粮添加富含核苷酸的酵母水解物可以保持机体处于一个良好的代谢水平，为促进仔猪正常和健康生长创造条件。另外，酵母核苷酸的添加可以促进肠道发育，加快恢复仔猪断奶应激诱发的腹泻[18]。Martinez-Puig等[21]研究发现，饲粮添加0.5%的酵母核苷酸有降低仔猪腹泻的趋势。本试验研究结果与其基本一致，表明酵母水解物具有降低仔猪腹泻的作用。而酵母水解物对仔猪的促生长和防腹泻的功效可能主要归功于其富含的核苷酸和细胞壁多糖等多种活性成分对机体抗氧化和免疫抵抗力的提高以及对肠道菌群平衡的改善等多方面作用。
3.2 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪血清抗氧化能力的影响动物体内通过维持氧化与抗氧化之间的相对稳定，以保证动物正常生长。MDA作为脂质过氧化的主要产物，过度产生和沉积会诱发机体氧化应激反应[22]。过氧化氢酶、SOD和GSH-Px等抗氧化酶又能够利用链式反应机制降低体内的自由基反应[23]。前人研究指出，酵母水解产生的核酸物质与其他相关物质是一种高效的内源性自由基清除剂和抗氧化剂[24]。动物机体内亚油酸氧化产生的自由基能够被核苷酸碱基中的氮氧原子捕获，并能与铜、铁等离子形成螯合物，极大程度地降低脂质过氧化反应[21]。也有研究指出，酵母β-葡聚糖的聚合结构使其具备清除体内多余自由基的能力[25]。周世业[12]在断奶仔猪饲粮中添加0.25%的外源核苷酸发现，第14天仔猪血清中的T-AOC和SOD活性显著升高，MDA含量显著降低。本试验得出类似的结果，饲粮添加酵母水解物可显著提高断奶仔猪血清T-AOC和GSH-Px活性以及显著降低血清MDA含量。因此，酵母水解物的抗氧化能力可能是多种活性成分之间协同增效的结果，从而维持机体健康，促进生长。
3.3 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪血清免疫能力的影响补体系统在宿主防御传染性疾病和炎症反应中发挥着至关重要的作用。抗原的分布以及和抗体免疫球蛋白G(IgG)的结合程度可以决定补体活化的水平[26]。Xiong等[27]研究指出，酵母水解物对仔猪的免疫调控作用可以通过增加血清中IgG和免疫球蛋白M(IgM)含量来实现。酵母核苷酸对免疫球蛋白产生的正调节作用是由于其促进了辅助型T淋巴细胞的发育，进而促使B细胞成熟和分化的结果[28]。另外，Valpoti c ′等[29]研究发现，饲粮添加0.2%的甘露聚糖能显著增加仔猪第21天和第28天外周血中CD45+、CD8+和CD21+淋巴细胞亚群的比例。酵母水解物中包含的免疫多糖可以通过激活免疫细胞和促进细胞因子的生成来调控机体的免疫应答反应[10]。本研究发现，酵母水解物可显著增加断奶仔猪血清C3和C4的含量。由此可知，酵母水解物可提高仔猪先天免疫反应，对外界致病因素具有一定的抵抗力。
3.4 饲粮添加酵母水解物对断奶仔猪粪便菌群的影响通常认为产肠毒素性大肠杆菌是引起仔猪腹泻、发病和死亡的主要原因[30]。相比断奶前，仔猪断奶后肠道内大肠杆菌数量显著增加，而乳酸菌数量显著下降[31]。因此，维持肠道菌群平衡、降低有害菌数量成为减少仔猪腹泻和保证其正常生长的突破口之一。前人研究发现，饲粮添加酵母核苷酸可增加肠道双歧杆菌数量，促进乳酸的生成，降低肠道pH，从而抑制有害菌生长和繁殖，减少腹泻发生[25]。Andrés-Elias等[32]研究发现，酵母核苷酸可以通过稳定仔猪回肠中的微生物菌群平衡来调节肠道的内稳态。此外，酵母细胞壁成分和大肠杆菌、沙门氏菌以及李斯特菌等病原菌均可直接结合，抑制细菌病原体在胃肠道中的黏附和定植，从而减轻后续感染[33]。本研究发现，酵母水解物可显著提高断奶仔猪粪便中芽孢杆菌数量，一定程度地降低大肠杆菌数量，与前人研究结果基本一致。这说明酵母水解物有利于维持仔猪肠道微生物的相对稳定，对动物肠道健康具有一定的调控作用。
4 结论饲粮添加酵母水解物可改善断奶仔猪生长性能，维持机体良好的代谢水平，提高血清先天免疫因子水平和抗氧化能力，增加直肠粪便芽孢杆菌数量。
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