自20世纪40年代以来，促生长类抗生素因为其具有促生长、防治疾病等作用而被广泛用于畜禽生产中，极大地促进了畜牧业的发展。但是，抗生素的应用产生了许多负面影响，如药物残留、产生病菌耐药性等，严重危害动物健康并造成环境污染等^[1]。因此，绿色安全无污染的抗生素替代物越来越受大众的关注。

血根碱(sanguinarine, SAG)是一种苯菲啶异喹啉类生物碱，存在于博落回的全草、白屈菜的全草、紫堇的块根、血水草的地上部分，具有抗肿瘤、增强免疫力、抗菌、抗炎及杀虫等作用^[2-4]。牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharides，ABP)是植物多糖的一种，分离提取自牛膝根，是一种水溶性较好的小分子多糖化合物，具有保护机体组织器官、抗氧化、缓解应激、抑制肿瘤细胞、改善机体免疫功能等作用^[5]。因此，研制和开发牛膝多糖和血根碱作为替代抗生素的饲料添加剂具有重要的生产实际应用价值。

目前，对血根碱和牛膝多糖的理化性质、提纯工艺、生物学功能及其在动物上的生产应用等已有很多研究，而对于两者联合添加对肉鸡生长及免疫方面的互作效应尚没有相关报道。鉴于此，本试验拟研究血根碱和牛膝多糖在黄羽肉鸡上替代抗生素的效果，并探讨两者是否存在互作效应，以期为肉鸡生产中抗生素替代物的使用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

血根碱(纯度为99%)和牛膝多糖(纯度为65%)均由湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程中心提供，血根碱和牛膝多糖添加量参照Lee等^[6]、云龙^[7]、罗李媛^[8]的报道。抗生素为杆菌肽锌，购自绿康生化股份有限公司，纯度为15%。试验鸡为黄羽肉鸡，购买于湖南宁乡温氏公司。

1.2 试验设计与试验饲粮

选取1日龄黄羽肉鸡300只，随机分成5组，每组6个重复，每个重复10只。试验鸡全部为母鸡，平均初始体重为30.3 g，生长良好、健康无病、体重基本一致。除对照组外，其他5组在基础饲粮基础上添加相应的添加剂。试验设计见表 1。试验期56 d，分为2个阶段(1~28日龄、29~56日龄)进行。

基础饲粮参照NRC(1994)和NY/T 33—2014《鸡饲养标准》中黄羽肉鸡营养需要，以玉米、豆粕等为主要原料配制。基础饲粮组成及营养水平见表 2。

1.3 饲养管理

试验前用“高锰酸钾+福尔马林”对鸡舍熏蒸消毒，通风3 d后开始饲养试验。按肉鸡免疫程序进行常规免疫，分别在1日龄时采用滴鼻或点眼方法进行首次免疫、9和20日龄时在颈部皮下进行二次和三次免疫新城疫-鸡传支二连苗。试验鸡采用上、中、下3层笼养，人工控温(第1天33 ℃，第1周30~32 ℃，第2周27~29 ℃，第3周24~26 ℃，以后保持在20~21 ℃)，人工光照，自然通风，自由饮水、采食。每天观察记录鸡群行为、健康状况及鸡舍中的温度和湿度。

1.4 测定指标 1.4.1 生长性能的测定

以各重复为单位记录1~28日龄、29~56日龄的采食量和阶段增重，计算平均日采食量、平均日增重、料重比。

1.4.2 外周血淋巴细胞增殖率的测定

于28和56日龄时各重复随机取1只鸡，空腹12 h后用肝素抗凝真空管(含肝素20 U/mL)颈静脉采血1 mL，充分混匀，37 ℃静置2 h，待红细胞沉淀后，吸取血浆层(稍带些红细胞)，加红细胞裂解液以破解红细胞，3 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用Han’s液洗涤2次，同样方法离心弃上清，然后将细胞重悬浮于2 mL RPMI-1640完全培养基中，用台盼蓝染色计数，监测活细胞率在95%以上，调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，制成淋巴细胞悬液。用96孔细胞培养板培养细胞，植物血球凝集素(PHA)刺激孔每孔加入100 μL淋巴细胞悬液和100 μL PHA液(用RPMI-1640完全培养基配制)，PHA终浓度为25 μg/mL，对照孔每孔加入100 μL淋巴细胞悬液和100 μL RPMI-1640完全培养基，即每孔最终体积为200 μL，最终细胞浓度为1×10⁶个/mL，空白孔每孔加入200 μL RPMI-1640完全培养基。每个处理设5个重复，置于37 ℃、5% CO₂和饱和湿度的培养箱内静置培养48 h。终止培养前4 h时每孔加入5 mg/mL四唑盐(MTT)溶液20 μL，继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，在微型振荡器上振荡10 min，使四甲基偶氮唑盐充分溶解。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，即OD₅₇₀，以刺激指数(SI)的高低反映淋巴细胞增殖率的高低，SI计算公式如下：

1.4.3 免疫器官指数的测定

将28、56日龄时采血后的鸡称重，然后颈静脉放血处死，分离脾脏、胸腺、法氏囊，分别称重，计算免疫器官指数。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 20.0软件分别对单因素和双因素设计进行单因素和双因素方差分析。使用LSD法多重比较分析单因素设计中5个组间的差异显著性。采用SPSS 20.0软件的一般线性模型单变量分析程序评估双因素设计中处理间的互作效应。试验结果用平均值±标准差表示，P < 0.05为差异显著。

2 结果 2.1 血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡生长性能的影响

由表 3可知，试验处理显著影响了1~28日龄肉鸡的平均日采食量、平均日增重和料重比(P < 0.05), 其中血根碱+牛膝多糖组的平均日采食量较对照组、血根碱组、牛膝多糖组和抗生素组分别提高了9.24%、2.58%、2.69%、5.92%(P < 0.05)，抗生素组的平均日采食量相比对照组提高了3.14%(P < 0.05)。血根碱+牛膝多糖组的平均日增重与抗生素组相比无显著差异(P>0.05)，但显著高于其他3组(P < 0.05), 血根碱组、牛膝多糖组和对照组的平均日增重无显著差异(P>0.05)。血根碱组、牛膝多糖组和血根碱+牛膝多糖组的料重比均显著高于对照组和抗生素组(P < 0.05)，但这3组之间没有显著差异(P>0.05)。析因分析显示，血根碱和牛膝多糖对平均日采食量、平均日增重和料重比都有显著影响(P < 0.05)，且血根碱和牛膝多糖对平均日采食量有显著的互作效应(P < 0.05)。

由表 4可知，试验处理显著影响29~56日龄肉鸡的平均日采食量和平均日增重(P < 0.05)，但对料重比无显著影响(P>0.05)。血根碱组、牛膝多糖组和血根碱+牛膝多糖组的平均日采食量均显著高于对照组和抗生素组(P < 0.05)，其中以血根碱+牛膝多糖组的平均日采食量最高，较对照组和抗生素组分别提高了8.45%、3.99%。血根碱组、牛膝多糖组和血根碱+牛膝多糖组的平均日增重均显著高于对照组和抗生素组(P < 0.05)，但这3组之间差异不显著(P>0.05)。析因分析显示，血根碱和牛膝多糖对平均日采食量和平均日增重均有显著影响(P < 0.05)，且血根碱和牛膝多糖对平均采食量和平均日增重有显著的互作效应(P < 0.05)。

2.2 血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡外周血淋巴细胞增殖率的影响

由表 5可知，试验处理对28和56日龄肉鸡外周血淋巴细胞增殖率均有显著影响(P < 0.05)。28日龄时，血根碱组和血根碱+牛膝多糖组外周血淋巴细胞增殖率没有显著差异(P>0.05)，均显著高于其余3组(P < 0.05)，其中以血根碱+牛膝多糖组外周血淋巴细胞增殖率最高, 较对照组、牛膝多糖组和抗生素组分别提高了13.95%、53.13%、22.50%。56日龄时，血根碱+牛膝多糖组外周血淋巴细胞增殖率最高，与牛膝多糖组差异不显著(P>0.05)，但显著高于对照组、血根碱组和抗生素组(P < 0.05)，较这3组分别提高了45.00%、23.40%、70.59%。析因分析显示，28日龄时，血根碱和牛膝多糖对外周血淋巴细胞增殖率均有显著影响(P < 0.05)，且血根碱和牛膝多糖对外周血淋巴细胞增殖率存在显著的互作效应(P < 0.05)；56日龄时，牛膝多糖对外周血淋巴细胞增殖率有显著影响(P < 0.05)，血根碱对外周血淋巴细胞增殖率没有显著影响(P>0.05)，血根碱和牛膝多糖对外周血淋巴细胞增殖率不存在显著的互作效应(P>0.05)。

2.3 血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡免疫器官指数的影响

由表 6、表 7可知，试验处理对28和56日龄免疫器官指数均无显著影响(P>0.05)，但有提高28日龄法氏囊指数的趋势(P=0.077)。28日龄法氏囊指数以血根碱+牛膝多糖组最高，比对照组、抗生素组分别提高67.97%、43.33%(P>0.05)。血根碱和牛膝多糖对56日龄法氏囊指数有显著影响(P < 0.05)，血根碱和牛膝多糖对28和56日龄免疫器官指数均没有显著的互作效应(P>0.05)。

3 讨论 3.1 血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡生长性能的影响

采食量是影响动物生产水平的重要因素，料重比是评价养殖动物经济效益的指标，每增加1个单位的肉所需要消耗的饲料越少，获得的经济效益越大。

大量研究表明血根碱和牛膝多糖能促进动物机体生长。在肉鸡上的研究发现，饲粮中添加50 mg/kg的血根碱制剂(有效浓度为1.5%)或者添加0.30和0.75 mg/kg的血根碱可以显著提高肉鸡的平均日增重、终末体重和饲料转化率^[6-8]；高剂量(150 mg/kg)博落回血根碱提取物提高生长性能效果显著^[9]；饲粮中添加0.4%牛膝显著提高了45日龄快大黄肉鸡的平均日采食量和平均日增重，显著降低了料重比^[10]。研究发现，血根碱或博落回提取物能够提高生长育肥猪和哺乳母猪的生长性能^[11-12]。在断奶仔猪上，何夏阳^[13]研究发现饲粮中添加0.5 mg/kg血根碱提高了断奶仔猪的平均日采食量和平均日增重，降低了料重比，其对仔猪的促生长效果与金霉素相当，戴波^[14]、Kantas等^[15]、欧阳龙等^[16]均得出相似的结论，即血根碱或博落回提取物提高了仔猪的平均日增重，降低了料重比，有效缓解了断奶应激，提高了饲料报酬。也有研究表明饲粮中添加50 mg/kg博落回对杜长大三元杂交断奶仔猪的生长性能没有显著影响^[17]。另有研究发现牛膝多糖能够缓解免疫应激或脂多糖引起的仔猪断奶应激，提高生长性能^[18-19]。

本试验结果表明血根碱、牛膝多糖单独或联合添加均能够增加黄羽肉鸡的平均日采食量和平均日增重，这3组的料重比在1~28日龄阶段没有优势，但在29~56日龄阶段与对照组相比有所下降，与抗生素组相当，这和上述前人的研究结果基本一致。血根碱和牛膝多糖有提高黄羽肉鸡生长性能的趋势，且存在一定的互作效应。血根碱和牛膝多糖对平均日采食量和平均日增重均有显著的提高作用，对料重比的影响则表现为随着养殖时间的延长先升高后下降，两者在前期(1~28日龄)对平均日采食量有显著的互作效应，在后期(29~56日龄)对平均日采食量和平均日增重均有显著的互作效应。本试验结果说明血根碱和牛膝多糖能够提高黄羽肉鸡的生长性能，其原因可能是血根碱和牛膝多糖中含有的多种生物活性成分，能够增强机体胃肠蠕动和分泌消化液，提高食欲，促进动物对营养物质的吸收和物质代谢，从而促进动物生长^[20]。

3.2 血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡外周血淋巴细胞增殖率的影响

T淋巴细胞表面有多种受体，体外培养的淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性促有丝分裂原的刺激分裂增殖，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，蛋白质和核酸合成增加, 向淋巴母细胞转化。淋巴细胞增殖率可以作为测定机体免疫功能的指标之一，其高低可反映机体的细胞免疫水平。

研究发现，血根碱对T淋巴细胞和B淋巴细胞都有刺激作用，能够增强机体免疫力^[21]；牛膝多糖对外周血淋巴细胞增殖有促进作用^[22]，可显著促进T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖^[23]。本试验中，在28日龄时，血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡外周血淋巴细胞增殖率存在显著的互作效应。血根碱和血根碱+牛膝多糖促淋巴细胞转化的效果比抗生素好，而牛膝多糖促淋巴细胞转化的效果较差，这可能是个体差异、试验样本数不够或者试验时间太短导致性能不稳定引起的。在56日龄时，血根碱组、牛膝多糖组和血根碱+牛膝多糖组外周血淋巴细胞增殖率分别比抗生素组提高38.24%、55.88%、70.59%，分别比对照组提高17.50%、32.50%、45.00%，说明血根碱与牛膝多糖单独或联合添加均提高了黄羽肉鸡外周血淋巴细胞转化率，且以血根碱与牛膝多糖联合添加时效果最好。本试验结果表明，血根碱和牛膝多糖在提高黄羽肉鸡免疫性能上有优势，应用效果优于抗生素，完全可以替代抗生素杆菌肽锌，且血根碱和牛膝多糖联合添加的效果比单独添加要好。

3.3 血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡免疫器官指数的影响

胸腺和法氏囊都是中枢免疫器官，其中胸腺是T淋巴细胞分化成熟的场所。脾脏是外周免疫器官，T淋巴细胞和B淋巴细胞迁移至此定居并受抗原刺激而增殖，促进脾脏组织结构的发育和成熟，同时脾脏为免疫反应提供重要的场所。

大量研究表明血根碱和牛膝多糖有提高动物免疫器官指数的作用。研究发现，0.4%的牛膝显著提高了30日龄肉鸡的法氏囊、脾脏指数和45日龄肉鸡的脾脏指数^[10]；川牛膝多糖显著提高了D-半乳糖诱导衰老小鼠的脾脏和肝脏指数^[24]；100 mg/kg川牛膝多糖显著或极显著提高了小鼠胸腺和脾脏指数^[25]；给雏鸡注射0.5 mL浓度为4或8 mg/mL的牛膝多糖均能够显著提高免疫器官指数^[26]。

本试验结果表明，血根碱、牛膝多糖单独或联合添加都有提高黄羽肉鸡免疫器官指数的作用，且效果优于抗生素，并以血根碱和牛膝多糖联合添加时效果最好，同时血根碱和牛膝多糖对免疫器官指数没有显著的互作效应。这说明血根碱和牛膝多糖能够提高黄羽肉鸡机体的免疫力，且两者联用效果最佳，能够替代抗生素。

血根碱、牛膝多糖单独或联合添加增强黄羽肉鸡免疫器官指数主要是在试验的前期(28日龄)，在试验的后期(56日龄)作用效果不明显，这与罗李媛^[8]研究得出的400 mg/kg川牛膝多糖对三黄鸡的免疫增强效果在饲喂早期(21日龄之前)有较好的效果相一致，其原因有待进一步研究。

4 结论

① 饲粮中单独或联合添加血根碱和牛膝多糖均能够提高黄羽肉鸡的生长性能，增强机体免疫力，且效果优于杆菌肽锌。

② 血根碱和牛膝多糖对黄羽肉鸡的生长性能及外周血淋巴细胞增殖率均表现出一定的协同效应，两者联合添加的效果优于单独添加。